本發明涉及一種貉犬瘟熱活疫苗及其制備方法和應用，本發明屬于獸用生物制品技術領域。
背景技術：
犬瘟熱是由副黏病毒科麻疹病毒屬犬瘟熱病毒引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，幼齡動物多為急性、致死性經過，成年動物可成慢性、持續性感染，臨床癥狀以雙相體溫升高，伴有卡他性肺炎、胃腸炎為主要特征，偶有神經癥狀出現，容易繼發其他細菌病毒的混合感染和二次感染，死亡率可高達80％，是危害我國毛皮動物養殖業的最嚴重的疫病之一。
貉犬瘟熱全年任何季節都能夠發生，尤其是仔貉在斷乳前后以及育成期更加敏感，具有非常高的發病率和死亡率，老齡貉具有一定的抵抗力。帶毒動物是貉犬瘟熱的主要傳染源，通過眼及鼻分泌物、唾液、尿、糞便排出病毒，主要經消化道、呼吸道傳染。由于貉犬瘟有發病急、缺乏特效治療方法的特點，貉犬瘟熱仍以疫苗接種作為主要的防控手段，然而目前市場上并沒有貉犬瘟熱疫苗銷售，很多養殖戶以犬、水貂等動物的犬瘟熱疫苗用以預防貉犬瘟熱，無法取得較好的免疫保護效果。因此，開發安全、免疫效果良好的貉犬瘟熱疫苗，不僅是行業和市場的迫切需求，具有廣闊的市場應用前景，對于防控貉犬瘟熱具有重要的意義。
技術實現要素：
本發明的目的在于提供一種貉犬瘟熱活疫苗及其制備方法。
為了達到上述目的，本發明采用了以下技術手段：
本發明通過貉體連續傳代的方式，人工馴化了犬瘟熱疫苗株cdv-o2，獲得了一株對貉安全、免疫原性良好、滴度穩定的貉犬瘟熱病毒弱毒疫苗株cdv-or12株，并以此毒株制備了貉犬瘟熱活疫苗(液體疫苗)。
本發明的一種貉犬瘟熱活疫苗，為液體疫苗，其有效成分為貉犬瘟熱病毒弱毒疫苗株，所述的貉犬瘟熱病毒弱毒疫苗株，命名為cdv-or12株，分類命名為犬瘟熱病毒(caninedistempervirus)，該疫苗株保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址在北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，微生物保藏號為cgmccno.13793，保藏時間為2017年04月21日。
在本發明所述的貉犬瘟熱活疫苗中，優選的，所含有的貉犬瘟熱病毒弱毒疫苗株的tcid50≥104.5/頭份，更優選的，所含有的貉犬瘟熱病毒弱毒疫苗株的tcid50為104.5-105.5/頭份。
進一步的，本發明還提出了一種制備所述的貉犬瘟熱活疫苗的方法，其特征在于：包括以下步驟：
(1)取所述的貉犬瘟熱病毒弱毒疫苗株cdv-or12株以吸附接毒的方式接種vero細胞上進行病毒擴增培養，每日觀察細胞病毒情況，待細胞病變達到75-85％時通過反復凍融的方法收獲病毒液，并進行病毒含量、純凈性檢驗；
(2)將檢驗合格的病毒液以無血清的mem培養液稀釋后，定量分裝，并保存于-20℃，即為貉犬瘟熱活疫苗。
在本發明所述的方法中，優選的，步驟(1)得到的病毒液中貉犬瘟熱病毒弱毒疫苗株的tcid50≥104.5/ml。
在本發明所述的方法中，優選的，制備得到的疫苗成品中貉犬瘟熱病毒弱毒疫苗株的含量tcid50≥104.5/頭份，更優選的，所含有的貉犬瘟熱病毒弱毒疫苗株的tcid50為104.5-105.5/頭份。
更進一步的，本發明還提出了所述的貉犬瘟熱活疫苗在制備預防貉犬瘟熱藥物中的用途。
實驗證明，本發明制備得到的疫苗可有效保護貉免于犬瘟熱病毒強毒的攻擊，免疫3周和3個月后保護率均為100％，免疫6個月后保護率為90％。因此，該疫苗可有效預防貉犬瘟熱的發生，免疫期為6個月，本發明的提出為貉犬瘟熱的防控提供了一種新的技術手段。
具體實施方式
下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。
實施例1犬瘟熱病毒疫苗株cdv-o2的馴化及鑒定
1.犬瘟熱病毒疫苗株cdv-o2的馴化
(1)將保存的犬瘟熱病毒疫苗株cdv-o2以吸附接毒的方式接種于非洲綠猴腎細胞(vero)上進行病毒擴增培養，每日觀察細胞病毒情況，待細胞病變達到80％左右時通過反復凍融的方法收獲病毒液，并進行病毒含量(tcid50≥105.0/ml)、無菌檢驗。將檢驗合格的病毒液分裝，并保存于-20℃。
(2)將擴增的cdv-o2病毒液原液后肢肌肉接種抗體陰性健康貉3只，每只5ml，分三點接種，隔離飼養并每天觀察接種貉各項生理指標。接種后第3、5天分別剖殺貉1只，無菌條件下采集脾臟，并利用vero細胞進行病毒分離，并通過犬瘟熱病毒特異性引物及犬瘟熱病毒陽性血清進行鑒定。
(3)將分離到的犬瘟熱病毒標記為cdv-or3，即為貉體內馴化第1代(f1)，將cdv-or3以吸附接毒的方式接種于vero細胞上進行病毒擴增培養，每日觀察細胞病毒情況，待細胞病變達到80％左右時通過反復凍融的方法收獲病毒液，并進行病毒含量(tcid50≥105.0/ml)、無菌檢驗。將檢驗合格的病毒液分裝，并保存于-20℃。
(4)重復步驟(2)、(3)，將犬瘟熱病毒在貉體內再連續馴化9次，得到犬瘟熱病毒弱毒疫苗株，其為在貉體內馴化的第10代(f10)毒株，將該毒株命名為cdv-or12株，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址在北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，微生物保藏號為cgmccno.13793，保藏時間為2017年04月21日。
2.犬瘟熱病毒弱毒疫苗株cdv-or12對貉免疫原性測定
取保存的犬瘟熱病毒弱毒疫苗株cdv-or12，調整病毒含量為104.5tcid50/ml，后肢肌肉接種抗體陰性健康貉5只，每只1ml，接種21天后測定血清中犬瘟熱病毒中和抗體效價，并用犬瘟熱病毒強毒hbf-1株攻毒，測定保護率。結果表明，犬瘟熱病毒弱毒疫苗株cdv-or12接種貉血清中犬瘟熱病毒中和抗體效價分別為：1:256、1:362、1:256、1:181、1:362，攻毒保護率為100％(5/5)。
3.犬瘟熱病毒弱毒疫苗株cdv-or12對貉的毒力返強試驗
取保存的犬瘟熱病毒弱毒疫苗株cdv-or12連續5代肌肉接種抗體陰性貉，每代連續觀察14天。結果顯示每代接種貉體溫、食欲、精神狀態、糞便等生理指標均表現正常，未出現犬瘟熱癥狀，說明該犬瘟熱病毒弱毒疫苗株cdv-or12無毒力返強現象，可用于貉犬瘟熱疫苗的研究。
實施例2貉犬瘟熱活疫苗(液體疫苗)的制備
1.犬瘟熱病毒制苗液的制備
取保存的犬瘟熱病毒弱毒疫苗株cdv-or12株以吸附接毒的方式接種vero細胞上進行病毒擴增培養，每日觀察細胞病毒情況，待細胞病變達到80％左右時通過反復凍融的方法收獲病毒液，并進行病毒含量、純凈性檢驗，得到的病毒液中貉犬瘟熱病毒弱毒疫苗株的含量tcid50≥104.5/ml。根據測得的病毒含量數據，將檢驗合格的病毒液以無血清的mem培養液適當稀釋后，定量分裝于90ml疫苗瓶中，保存于-20℃。
2.疫苗成品中犬瘟熱病毒含量的測定
疫苗成品進行病毒含量測定，犬瘟熱病毒含量tcid50為104.5-105.5/頭份。
實施例3貉犬瘟熱活疫苗(cdv-or12株)的安全性試驗
取檢驗合格的貉犬瘟熱活疫苗(實施例2制備)，后肢肌肉接種抗體陰性貉，設單劑量(接種1頭份，犬瘟熱病毒含量tcid50＝104.5/頭份)、單劑量重復和超劑量(10倍)接種免疫組，同時設不接種疫苗貉作為陰性對照。疫苗接種后，連續14天觀察貉的體溫、食欲、精神狀態、糞便等生理指標，并剖檢觀察接種貉主要臟器病變情況。試驗結果表明，貉經單劑量、單劑量重復和超劑量接種后，各項生理指標均正常，未表現出任何臨床癥狀，剖檢觀察接種貉主要臟器無病變，說明貉犬瘟熱活疫苗對貉安全。
實施例4貉犬瘟熱活疫苗(cdv-or12株)的效力及免疫期試驗
取檢驗合格的貉犬瘟熱活疫苗(實施例2制備)，后肢肌肉接種抗體陰性貉，每只1ml(接種1頭份，犬瘟熱病毒含量tcid50＝104.5/頭份)，同時設接種vero細胞培養液對照組。接種3周、3個月、6個月和9個月后采血、分離血清，測定血清中犬瘟熱病毒中和抗體，同時使用100個半數致死量(ld50)的犬瘟熱檢驗用強毒hbf-1進行攻擊，連續14天觀察攻毒貉體溫、食欲、精神狀態、糞便等生理指標。
結果表明，接種3周和3個月后，接種貉血清中犬瘟熱病毒中和抗體效價均在1:256以上，貉對犬瘟熱病毒強毒的保護率均為100％(10/10)；接種6個月后，貉對犬瘟熱病毒強毒的保護率為90％(9/10)；接種9個月后，貉對犬瘟熱病毒強毒的保護率為70％(7/10)。因此，該疫苗的免疫期定為6個月。
實施例5貉犬瘟熱活疫苗(cdv-or12株)與同類疫苗(cdv3-cl株)對貉的免疫效力比較試驗
取檢驗合格的貉犬瘟熱活疫苗(實施例2制備)，以及市場上銷售的水貂犬瘟熱活疫苗(cdv3-cl株)分別后肢肌肉接種抗體陰性貉，每只接種1頭份(犬瘟熱病毒含量tcid50＝104.5/頭份)，同時設未接種疫苗的對照組。接種3周、3個月、6個月和9個月后采血、分離血清，測定血清中犬瘟熱病毒中和抗體，同時使用100個半數致死量(ld50)的犬瘟熱檢驗用強毒hbf-1進行攻擊，連續14天觀察攻毒貉體溫、食欲、精神狀態、糞便等生理指標。
結果表明，接種3周和3個月后，貉犬瘟熱活疫苗免疫組血清中犬瘟熱病毒中和抗體效價均在1:256，接種貉對犬瘟熱病毒強毒的保護率為100％(10/10)，水貂犬瘟熱活疫苗免疫組血清中犬瘟熱病毒中和抗體效價均在1:128以上，接種貉對犬瘟熱病毒強毒的保護率為100％(10/10)；接種6個月后，貉犬瘟熱活疫苗免疫組接種貉對犬瘟熱病毒強毒的保護率為100％(10/10)，水貂犬瘟熱活疫苗免疫組接種貉對犬瘟熱病毒強毒的保護率為80％(8/10)；接種9個月后，貉犬瘟熱活疫苗免疫組接種貉對犬瘟熱病毒強毒的保護率為70％(7/10)，水貂犬瘟熱活疫苗免疫組接種貉對犬瘟熱病毒強毒的保護率僅為50％(5/10)。
以上結果表明：本發明所制備的貉犬瘟熱活疫苗(cdv-or12株)的免疫效力優于臨床上應用的水貂犬瘟熱活疫苗。
以上實驗結果表明本發明制備得到的貉犬瘟熱活疫苗(cdv-or12株)可有效保護貉免于犬瘟熱病毒強毒的攻擊，有效預防貉犬瘟熱的發生。