本發明屬于水生動物口服疫苗領域。涉及萌發缺陷、無抗生素抗性基因標記的表面展示草魚呼腸孤病毒保護性抗原的口服重組芽孢疫苗及其制備方法。
背景技術：
：：草魚魚呼腸孤病毒(grasscarpreovirus,gcrv)是目前發現的毒性最強的的魚類病毒之一，不僅能感染草魚導致嚴重的出血病，還能感染青魚、麥穗魚、稀有鮈鯽，給水產養殖造成重大經濟損失。gcrv也是迄今研究最清楚的魚類病毒之一。在gcrv病毒顆粒中，病毒表面抗原如vp5、vp7等能誘導草魚產生特異性的保護抗體，是研制gcrv疫苗的重要抗原[1]。目前國內已研制出草魚出血病細胞滅活疫苗和減毒活疫苗，但由于采用注射接種，不便于大規模推廣應用[2,3]。魚類口服接種疫苗不受時間、地點和魚體大小的限制，適用于大群體接種，操作方便、省時、省力，便于大規模推廣應用。但蛋白抗原在水體環境中穩定性差、利用率低，易被消化道內的蛋白酶降解，口服接種后免疫保護效果不佳[2,3]。因此，能遞呈抗原并維持抗原在動物消化道和環境中穩定性的載體是研制安全高效的魚類口服疫苗的關鍵共性問題。近年來，嘗試采用新型材料，如海藻酸鹽、可生物降解高分子聚合材料(如聚dl-乳酸-聚乙二醇共聚物)包裹疫苗抗原，制備能在環境和動物胃腸道中保持抗原穩定性的口服微球疫苗[4]。盡管口服微球疫苗免疫效果有所提高，但還有諸多尚待解決的問題[5]。譬如，微球共聚物制備工藝中添加的有機金屬催化劑(如三基鋁化合物)和機溶劑(如二氯甲烷等)殘留對接種動物和環境生物的毒副作用；在微球制備后期的冷凍干燥過程中，添加避免影響抗原活性的多種穩定劑仍存留其中[6]。枯草芽孢桿菌在營養缺乏時以處于休眠狀態的芽孢存在。芽孢具有耐受高溫、干燥、化學藥物、酸堿的能力，在極端環境中能長期存活，并且能通過動物消化道屏障。枯草芽孢桿菌芽孢對動物具有益生功能，作為人類食品和動物飼料的添加劑被廣泛應用，具有良好安全記錄。一些枯草芽孢桿菌已建立了可操作的遺傳系統，其芽孢的結構、分化及萌發過程已闡明。芽孢由20余種蛋白構成的外層衣殼包圍，如cota、cotb、cotc、cotf和cotg等[7]，但這些衣殼蛋白基因缺失或突變不會導致芽孢特性的明顯改變。基于芽孢的以上特征，利用基因重組技術使芽孢衣殼蛋白與外源蛋白融合表達，并通過芽孢衣殼蛋白將外源蛋白展示在芽孢表面，建立了芽孢表面展示技術。利用該技術構建的重組芽孢在通過動物消化道時，被展示在芽孢表面的外源蛋白抗原能誘導動物產生系統和局部保護性免疫反應[8-10]。但口服重組芽孢疫苗的保護效果有待提高。其主要原因傳統芽孢表面展示技術制備的重組芽孢能在動物腸道中萌發形成營養細胞，導致喪失免疫誘導作用[11,12]。此外，重組芽孢中含有用于重組菌株篩選的抗生素抗性基因標記，存在一定的安全風險。枯草芽孢桿菌芽孢芽孢的萌發受一系列基因表達產物調控，如gera，gerb及gerk操縱子基因等。因此，當這些基因的缺失或突變時，枯草芽孢桿菌芽孢萌發缺陷，不能萌發形成營養細胞[13]。此外，枯草芽孢桿菌細胞中含有位點特異的重組酶xer，能識別并切割特異性的核苷酸序列[14]。xer酶對染色體上特異序列識別并切割，并導致基因切除重組。本發明的目的是利用基因重組技術，制備萌發缺陷、無抗生素抗性基因標記的表面展示草魚呼腸孤病毒保護性抗原的口服重組芽孢疫苗。文獻[1]chencl,sunxy,liaolj,etal.(2013)antigenicanalysisofgrasscarpreovirususingsingle-chainvariablefragmentantibodyagainstigmfromctenopharyngodonidella.scichinalifesci56:59-65.[2]王玉堂(2013)疫苗在水產養殖病害防治中的作用及應用前景.中國水產2013:42-45.[3]鞏華,黃志斌(2010)水產疫苗研究開發現狀與展望.海洋與漁業2010:43-47.[4]李荔,劉志剛,喻海瓊(2006)一種新型魚病口服疫苗的研制和示蹤研究.熱帶醫學雜志4:382-385.[5]張小江,任燕,常藕琴,石存斌,李寧求,etal.(2008)斜帶石斑魚口服pela-ompk微球疫苗的示蹤及免疫效果.中國水產科學.[6]alparho,papanicolaoui,bramwellvw(2005)strategiesfordnavaccinedelivery.expertopindrugdeliv2:829-842.[7]driksa(1999)bacillussubtilissporecoat.microbiolmolbiolrev63:1-20[8]maurielloem,ducleh,isticator,cangianog,hongha,etal.(2004)displayofheterologousantigensonthebacillussubtilissporecoatusingcotcasafusionpartner.vaccine22:1177-1187.13.[9]isticator,cangianog,tranht,ciabattinia,medaglinid,etal.(2001)surfacedisplayofrecombinantproteinsonbacillussubtilisspores.jbacteriol183:6294-6301.[10]ningd,lengx,liq,xuw(2011)surface-displayedvp28onbacillussubtilissporesinduceprotectionagainstwhitespotsyndromevirusincrayfishbyoraladministration.japplmicrobiol111:1327-1336.[11]casulag,cuttingsm(2002)bacillusprobiotics:sporegerminationinthegastrointestinaltract.applenvironmicrobiol68:2344-2352[12]ful,liw,duh,daiwandxuz(2008)oralvaccinationwithenvelopeproteinvp28againstwhitespotsyndromevirusinprocambarusclarkiiusingbacillussubtilisasdeliveryvehicles.lettapplmicrobiol46:581–586[13]hinck,nagorskak,iwanickia,wegrzyng,serorsjandobuchowskim(2006)expressionofgenescodingforgeraandgerksporegerminationreceptorsisdependentontheproteinphosphataseprpe.applenvironmicrobiol.188(12):4373–4383[14]blooraeandrockym.cranenburghrm(2006)anefficientmethodofselectablemarkergeneexcisionbyxerrecombinationforgenereplacementinbacterialchromosomes.applenvironmicrobiol72(4)2520–2525技術實現要素：本發明的目的是提供一種草魚抗呼腸孤病毒口服重組芽孢疫苗及其制備方法。本發明所采用的技術方案是：一種草魚抗呼腸孤病毒口服重組芽孢疫苗，是用草魚顆粒飼料包被表面展示草魚呼腸孤病毒免疫保護性抗原的重組枯草芽孢桿菌芽孢而制得；所述芽孢是具有萌發缺陷、無抗生素抗性基因標記的芽孢。本發明所述芽孢是利用如下基因重組方法獲得：構建融合表達并展示呼腸孤病毒保護性抗原的整合性重組載體，通過同源重組和切除重組獲得重組枯草芽孢桿菌重組菌株，以及利用重組菌株制備萌發缺陷、表面展示保護性抗原的無抗生素抗性基因的重組芽孢。本發明還提供了所述草魚抗呼腸孤病毒口服重組芽孢疫苗的制備方法，是用草魚顆粒飼料包被表面展示草魚呼腸孤病毒免疫保護性抗原的、具有萌發缺陷、無抗生素抗性基因標記的重組枯草芽孢桿菌芽孢而制得；所述重組枯草芽孢桿菌芽孢通過下述步驟制備：(1)構建重組載體：構建含枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白與呼腸孤病毒保護性抗原融合表達的重組基因、兩側有枯草芽孢桿菌位點特異的重組酶xer識別和切割序列的抗生素抗性基因、以及以控制芽孢萌發的關鍵基因為整合片段的重組載體；(2)將重組載體轉化枯草芽孢桿菌，通過同源重組將融合表達的重組基因整合于染色體中并使芽孢萌發基因插入失活，并通過切除重組和負篩選獲得無抗生素抗性基因的重組菌株；(3)誘導重組菌株細胞產生萌發缺陷、無抗生素抗性基因標記以及表面展示呼腸孤病毒保護性抗原的重組芽孢。本發明中所述枯草芽孢衣殼蛋白包括cota，cotb，cotc，cote，cotg，cotx等芽孢衣殼結構蛋白。呼腸孤病毒保護性抗原選自vp5、vp7等。所述整合片段是控制芽孢萌發關鍵基因的部分編碼序列，所述關鍵基因選自gera、gerb和gerk操縱子中所有基因。所述枯草芽孢桿菌位點特異的重組酶xer識別和切割序列可以是如seqidno.25所示的nif序列，所述抗生素抗性基因指能用于枯草芽孢桿菌重組菌株細胞篩選的基因。本發明中枯草芽孢桿菌重組菌株是整合性重組載體轉化枯草芽孢桿菌，并依次通過正篩選和負篩選后得到的菌株。枯草芽孢桿菌包括能被整合性重組質粒轉化、有位點特異的重組酶xer的產芽孢菌株。如bacillussubtilisstr.168及其衍生菌株等(bacillusgeneticstockcenter，departmentofbiochemistry，theohiostateuniversity，west12thavenue，columbus,ohio，43210，usa)。本發明將重組芽孢與未經油脂噴涂的草魚顆粒飼料均勻混合、吸附，以一定比例的植物油脂進行包被。進一步地，本發明所構建的整合性重組質粒中，以芽孢衣殼蛋白基因cota(genbankid:936023)、cotb(genbankid:936870)、cotc(genbankid:939543)、cote(genbankid:939508)、cotf(genbankid:936671)、cotg(genbankid:936865)、cotx(genbankid:936417)等與芽孢表面展示gcrv表面抗原基因vp7(genbankid:6218809)和vp5(genbankid:6218803)進行重組，將目的蛋白或酶融合表達并表面展示與芽孢表面；以控制芽孢萌發的基因geraa(genbankid:935953)、gerab(genbankid:935948)、gerac(genbankid:935951)、gerba(genbankid:936814)、gerbb(genbankid:936827)、gerbc(genbankid:936819)、gerka(genebankid:938285)、gerkb(genbankid:938282)和gerkc(genbankid:938287)以及具有類似功能的基因，作為融合表達衣殼蛋白和gcrv保護性抗原的重組基因整合于染色體的整合位點；以兩側有枯草芽孢桿菌xer重組酶識別和切割的序列nif(5’-acttcctagaatatatattatgtaaact-3’(seqidno.25)(bloorae,cranenburghrm.applenvironmicrobiol.2006,72(4):2520-2525)的抗生素抗性基因作為重組枯草芽孢桿菌的篩選標記。與本領域已知的方法相比，本發明制備萌發缺陷、無抗生素抗性基因標記的表面展示草魚呼腸孤病毒保護性抗原的口服重組芽孢疫苗，具有更安全和高效的特點和優勢。附圖說明圖1整合性平臺載體pjs1700和pjs1837的構建。(a)整合性平臺載體pjs1700構建流程和結構示意圖。gerkb5'和gerkb3'分別表示控制枯草芽孢桿菌芽孢萌發關鍵基因gerkb編碼序列的5'端和3'端dna片斷；apr和emr，分別表示氨芐青霉素抗性基因和紅霉素抗性基因，分別用于篩選escherichiacolidh5α和bacillussubtilis168(trp-)中的轉化子；紅霉素抗性基因(emr)兩端添加枯草芽孢桿菌位點特異重組酶xer識別和切割的序列nif；cotb，含cotb基因的啟動子序列和編碼序列，但不含終止密碼子。oric為大腸桿菌復制子。(b)整合性平臺載體pjs1837結構示意圖。geraa5'和geraa3'分別表示控制枯草芽孢桿菌芽孢萌發關鍵基因geraa編碼序列中的5'端和3'端dna片斷；apr和kmr,分別表示氨芐青霉素抗性基因和卡拉霉素抗性基因，分別用于e.colidh5α或b.subtilis168(trp-)轉化子的篩選；卡那霉素抗性基因(kmr)兩端添加枯草芽孢桿菌位點特異重組酶xer識別和切割的序列nif；cotc，含cotc基因的啟動子序列和編碼序列，但不含終止密碼子。(c)整合性平臺載體pjs1900g構建流程和結構示意圖。gerbb5'和gerbb3'分別表示控制枯草芽孢桿菌芽孢萌發關鍵基因gerbb編碼序列的5'端和3'端dna片斷。(d)整合性平臺載體的鑒定。m，標準分子量dna片段；1,以gerkb-1和em-nif1為引物pcr鑒定pjs1700，擴增產物為gerkb5’-emr(1.6kb)；2，以cotb-1和gerkb-2為引物pcr鑒定pjs1700，擴增產物為cotb-gerkb3’(1.6kb)；3，以geraa-1和km-nif1為引物pcr擴增pjs1837，擴增產物為geraa5’-kmr(1.65kb)；4，以cotc-1和geraa-2為引物pcr鑒定pjs1837，擴增產物為cotc-gerkb3’(1.2kb)；5，以gerbb-1和em-nif1為引物pcr鑒定pjs1900g，擴增產物為gerbb5’-emr(1.7kb)；6，以cotb-1和gerbb-2為引物pcr鑒定pjs1900g，擴增產物為cotb-gerkb3’(1.7kb)。圖2重組芽孢融合表達并展示vp7和vp5的整合載體。(a)融合表達并展示vp7和vp5的整合性重組載體結構示意圖。pjs1700-vp7融合表達cotb-vp7并展示vp7；pjs1700-vp5融合表達cotb-vp5并展示vp5；pjs1837-vp7融合表達cotc-vp7并展示vp7；pjs1837-vp5融合表達cotc-vp5并展示vp5；pjs1900g-vp7融合表達cotg-vp7并展示vp7；pjs1900g-vp5融合表達cotg-vp5并展示vp5。(b)融合表達vp7和vp5整合載體的鑒定。1,以cotb-1和vp7-2為引物pcr鑒定pjs1700-vp7，擴增產物為cotb-vp7重組片段(1.9kb)；2,以cotb-1和vp5-2為引物pcr鑒定pjs1700-vp5，擴增產物為重組片段cotb-vp5(2.1kb)；3,以cotc-1和vp7-2為引物pcr鑒定pjs1837-vp7，擴增產物為cotc-vp7重組片段(1.5kb)；4，以cotc-1和vp5-2為引物pcr鑒定pjs1834-vp5，擴增產物為cotc-vp5重組片段(1.7kb)；5,以cotg-1和vp7-2為引物pcr鑒定pjs1900g-vp7，擴增產物為cotg-vp7重組片段(1.8kb)；6，以cotg-1和vp5-2為引物pcr鑒定pjs1900g-vp5，擴增產物為cotg-vp5重組片段(2.0kb)。圖3芽孢萌發缺陷、表面展示vp7或vp5重組枯草芽孢桿菌菌株的構建流程及染色體重組基因結構示意圖。融合表達和展示vp7或vp5的整合載體轉化b.subtilisstr.168,分別通過同源重組、正篩選、切除重組和負篩選得到芽孢萌發缺陷、表面展示vp7或vp5的無抗生素抗性標記的重組枯草芽孢桿菌菌株。圖4重組枯草芽孢桿菌菌株的pcr鑒定。1,以cotb-1和gerkb-2為引物pcr鑒定重組菌株dr1700-vp7(emr)，擴增產物為cotb-vp7-gerkb3’(2.31kb)；2,以em-nif1和gerk-1為引物pcr鑒定重組菌株dr1700-vp7(emr)，擴增產物為重組片段gerkb5’-emr(1.6kb)；3,以cotc-1和geraa-2為引物pcr鑒定dr1837-vp7重組菌株，擴增產物為重組片段cotc-vp7-geraa3’(1.85kb)；4，以km-nif1和geraa-1為引物pcr鑒定dr1837-vp5重組菌株，擴增產物為重組片段geraa5’-kmr(1.65kb)；5,以cotb-1和gerkb-2為引物pcr鑒定dr1700-vp7(emr)重組菌株，擴增產物為cotb-vp5-gerkb3’重組片段(2.6kb)；6,以em-nif1和gerkb-1為引物pcr鑒定dr1700-vp5(emr)重組菌株，擴增產物為重組片段gerkb5’-emr(1.6kb)；7,以cotc-1和geraa-2為因為pcr鑒定dr1837-vp5(kmr)重組菌株，擴增產物為重組片段cotc-vp5-geraa3’(2.2kb)；8,以km-nif1和geraa-1為引物pcr鑒定dr1837-vp5(kmr)重組菌株，擴增產物為重組片段geraa5’-kmr(1.65kb)；9，以cotg-1和gerbb-2為引物，pcr鑒定dr1900g-vp7(emr)，擴增產物為cotg-vp7-gerbb3’(2.4kb)；10，以gerbb-1和em-nif1為引物，pcr鑒定dr1900g-vp7(emr)，擴增產物為gerbb5’-emr(1.7kb)；11，以cotg-1和gerbb-2為引物，pcr鑒定dr1900g-vp5(emr)，擴增產物為cotg-vp5-gerbb3’(2.5kb)；12，以gerbb-1和em-nif1為引物，pcr鑒定dr1900g-vp5(emr)，擴增產物為gerbb5’-emr(1.7kb)。圖5重組枯草芽孢桿菌對相應抗生素的敏感性分析。分別將正篩選和負篩選后得到的重組菌株接種于含相應抗生素的lb平板上，37℃培養。得到對相應抗生素敏感的重組菌株dr1700-vp7(ems)、dr1837-vp7(kms)、dr1700-vp5(ems)、dr1837-vp5(kms)、dr1900g-vp7(ems)和dr1900g-vp5(ems)。圖6無抗生素抗性基因標記的重組枯草芽孢桿菌的鑒定。1,以cotb-1和gerkb-2為引物pcr鑒定重組菌株dr1700-vp7(ems)，擴增產物為cotb-vp7-gerkb3’(2.31kb)；2,以em-nif1和gerk-1為引物pcr鑒定重組菌株dr1700-vp7(ems)，無特異性擴增產物；3,以cotc-1和geraa-2為引物pcr鑒定dr1837-vp7(kms)重組菌株，擴增產物為重組片段cotc-vp7-geraa3’(1.85kb)；4，以km-nif1和geraa-1為引物pcr鑒定dr1837-vp5(kms)重組菌株，無特異性擴增產物；5,以cotb-1和gerkb-2為引物pcr鑒定dr1700-vp7(ems)重組菌株，擴增產物為cotb-vp5-gerkb3’重組片段(2.6kb)；6,以em-nif1和gerkb-1為引物pcr鑒定dr1700-vp5(ems)重組菌株，無特異性擴增產物；7,以cotc-1和geraa-2為因為pcr鑒定dr1837-vp5(kms)重組菌株，擴增產物為重組片段cotc-vp5-geraa3’(2.2kb)；8,以km-nif1和geraa-1為引物pcr鑒定dr1837-vp5(kms)重組菌株，無特異性擴增產物；9，以cotg-1和gerbb-2為引物，pcr鑒定dr1900g-vp7(ems)，擴增產物為cotg-vp7-gerbb3’(2.4kb)；10，以gerbb-1和em-nif1為引物，pcr鑒定dr1900g-vp7(ems)，無特異性擴增產物；11，以cotg-1和gerbb-2為引物，pcr鑒定dr1900g-vp5(ems)，擴增產物為cotg-vp5-gerbb3’(2.5kb)；12，以gerbb-1和em-nif1為引物，pcr鑒定dr1900g-vp5(ems)，無特異性擴增產物。圖7重組芽孢萌發能力分析。誘導重組菌株dr1700-vp7(ems)、dr1837-vp7(kms)、dr1700-vp5(ems)、dr1837-vp5(kms)、dr1900g-vp5(ems)和dr1900g-vp7(ems)形成芽孢，將純化和定量后的重組芽孢接種于無抗生素的lb平板，37℃培養。圖8表面展示vp7或vp5的重組芽孢鑒定。b可見光觀察芽孢(10×100油鏡)；f熒光觀察芽孢(10×100oil)。具體實施方式在本發明中所使用的術語，除非有另外說明，一般具有本領域普通技術人員通常理解的含義。下面結合具體的實施例，并參照數據進一步詳細地描述本發明。應理解，這些實施例只是為了舉例說明本發明，而非以任何方式限制本發明的范圍。在以下的實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規方法。所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現時標明，其后所用相同試劑如無特殊說明，均以首次標明的內容相同。本發明實施例中涉及的由發明人保存的生物材料，均可向公眾提供20年。芽孢表面展示gcrv表面抗原vp7基因(genbankid:6218809)和vp5基因(genbankid:6218803)以標準病毒株gcrv-873(genbankid:af403396.1)為參照，根據枯草芽孢桿菌密碼子偏好性對基因密碼進行了優化，編碼產物氨基酸序列保持不變。為便于克隆，起始密碼子和終止密碼子位點分別添加ndei位點和kpni位點。優化后的基因序列由上海生工生物工程公司合成。合成基因序列如下：vp5基因序列如seqidno.26；vp7基因序列seqidno.27。合成基因vp5和vp7分別克隆于puck載體(上海生工生物工程公司)中，并將其分別命名為pjs1602和pjs1603。本發明實施例中所用基因擴增引物見表1：表1.本發明所用引物序列實施例1以gerkb為整合位點表面展示gcrv抗原vp7的重組芽孢口服疫苗的制備1.分子生物學操作1.1枯草芽孢桿菌染色體的提取離心收集10mlbacillussubtilis168(trp-)培養物，加0.5mlte懸浮沉淀。每個微量離心管加入30μl溶菌酶(100mg/ml)，于37℃反應1h；加入50μl10％的十二烷基磺酸鈉(sds)與20μl20mg/ml的蛋白酶k，震蕩均勻，于37℃反應2h，加入等體積的苯酚和氯仿抽提后取上清，加入2倍體積的乙醇，室溫2h后，12,000g離心10min，棄上清液后以75％乙醇500μl洗dna沉淀物，以去除無機鹽離子。待dna沉淀物干燥后，加入30～50μlte或ddh2o溶解dna，于-20℃下保存備用。1.2分子生物學技術操作所有質粒的構建采用sambrook等(《分子克隆：試驗手冊》第二版，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約，1989)所述的標準分子生物學技術進行，用于本發明的所有回收dna片段均采用上海生工生物工程有限公司凝膠回收試劑盒分離純化。所有pcr產物克隆片段均經上海生工生物工程有限公司測序。pcr試劑、限制性內切酶和連接酶均采用寶生物工程(大連)有限公司，酶切及連接反應體系及條件按照產品說明書進行設置。1.3pcr擴增用于基因擴增的引物由上海生工生物技術有限公司合成，為便于擴增產物的克隆部分引物5’端添加限制性內切酶識別位點，pcr反應體系中含10mmtris·cl(ph8.3)，50mmmgcl2，上下游引物各100pm，200μmdntps，50ng模板dna，2.5udna聚合酶。pcr反應程序根據不同引物及產物特征設置。2.細菌的轉化2.1escherichiacolidh5α的轉化e.colidh5α感受態細胞的制備和轉化采用sambrook等(《分子克隆實驗手冊》第二版，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約，1989)所述方法進行。取一個e.colidh5α單菌落轉移到含20mmol/lmgso4的sob中，37℃培養約3h；培養物轉移至預冷的離心管中，在冰上放置10分鐘，使培養物冷卻至0℃；5000rpm4℃離心10分鐘，棄上清；加20ml預冷fsb懸浮細胞，繼續冰浴10min；5000rpm4℃離心10min，棄上清。加2ml冰預冷的fsb重懸沉淀140μl二甲基亞砜(dmso)，混勻后置冰上15分鐘，再加140μldmso，分裝保存于-70℃冰箱。取5μl連接產物加入感受態細胞中，混勻冰浴30min，42℃熱激90秒，冰浴1-2分鐘；加0.8mlsoc培養基，37℃溫育45～60min；5000rpm離心5min，棄上清后加100μlsoc培養基懸浮細胞，并轉移到含相應抗生素的lb平板中，涂布均勻后，37℃培養12-16h。培養基及主要試劑配制fsb緩沖液：至終濃度10mm乙酸鉀，45mmmncl2，10mmcacl2，100mmkcl，3mm氯化六氨合高鈷，10％甘油。lb培養基：1％胰化蛋白胨,0.5％酵母提取物,1％nacl。sob培養基：2％胰化蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.05％nacl，2.5mmkcl，10mmmgcl2。soc培養基：1lsob培養基中加20ml1m滅菌的葡萄糖。固體培養基：以上相應液體培養基中添加1.5％瓊脂糖2.2b.subtilis168(trp-)的轉化b.subtilis168細胞接種于lb平板，37℃培養2天。取一個單菌落接于5mlgmⅰ溶液，在30℃100rpm振蕩培養過夜。次日取2ml轉接到18mlgmⅰ中，37℃200rpm振蕩培養3.5h。再取10ml轉接到90mlgmⅱ中，37℃100rpm振蕩培養90min，離心收集菌體。用10ml上清液懸浮菌體，并加30％的滅菌甘油至10％，混勻后按每管0.5ml分裝，-70℃保存。轉化時取出離心管，放在45℃水浴中溶化，然后在0.5ml菌液中加入適量dna(1μg/ml)。于37℃緩慢振蕩(80rpm)保溫30min后涂含相應抗生素平板，于37℃培養過夜。主要試劑的配制10×最低鹽溶液：14gk2hpo4，6gkh2po4，2g(nh4)2so4，1g檸檬酸鈉，0.2gmgso4.7h2o，加水至100ml。l-色氨酸溶液：2mg/mll-色氨酸，避光保存。gmⅰ溶液：1×最低鹽溶液95ml，1ml50％葡萄糖，0.4ml5％水解酪蛋白，1ml10％酵母提取物，2.5mll-色氨酸溶液。gmⅱ溶液：1×最低鹽溶液97.5ml，1ml50％葡萄糖，80μl5％水解酪蛋白，40μl10％酵母提取物，0.5ml0.5mmgcl2，0.5ml0.1mcacl2，0.5mll-色氨酸溶液。3.以gerkb為整合位點整合性載體的構建3.1以gerkb為整合位點的整合性平臺載體的構建以gerkb-1和gerkb-2為引物，b.subtilis168染色體為模板，pcr擴增gerkb基因片段，t4dna聚合酶補平后克隆于pjs313(ndei酶切位點被破壞的puc18質粒,《分子克隆：試驗手冊》第二版，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約，1989)中pvuii位點，得到的重組質粒為pjs1484。以gerkb-p和gerkb-s為引物，pjs1484為模板，反轉pcr擴增產物以psti和saci酶切；以含有nif序列的em-nif1和em-nif2為引物，pmutin4質粒(laboratoiregenetiquemicrobienne,inra,domainedevilvert,jouy-en-josas78350,france)為模板，pcr擴增emr基因；以cotb-1和cotb-2為引物，pcr擴增包含啟動子的cotb基因。以純化cotb基因和emr基因混合物為模板，em-nif2和cotb-2為引物，pcr擴增重組片段emr-cotb基因片段，擴增產物正向克隆于pmd-18t(購自寶生物工程(大連)有限公司)載體中，轉化e.colidh5α得到重組質粒pjs1692。以psti和saci酶切pjs1692，回收emr-cotb重組片段與相同酶切的pjs1484反轉pcr產物連接，得到整合性平臺載體命名為pjs1700(見本發明附圖說明和附圖1)。該平臺質粒含有枯草芽孢桿菌xer位點特異重組酶識別序列nif的紅霉素抗性基因(emr)篩選標記、含啟動子序列但無終止密碼子的芽孢衣殼蛋白基因cotb、以及作為整合平臺的gerkb基因片段。在cotb基因下游有多克隆位點ndei、xbai、bamhi、kpni和saci。3.2以gerkb為整合位點、融合表達cotb-vp7的整合性載體構建以ndei和kpni酶切pjs1603，回收合成基因vp7克隆于pjs1700載體中，質粒pjs1700-vp7(見本發明附圖說明和附圖2)。該質粒中含有emr-cotb-vp7重組片段，在枯草芽孢桿菌cotb啟動子控制下表達融合蛋白cotb-vp7。4.芽孢融合表達cotb-vp7的重組枯草芽孢桿菌菌株的制備將整合性質粒pjs1700-vp7轉化b.stubtilis，以0.4μg/ml的紅霉素(em)篩選轉化子。通過重組質粒上的gerkb片段與染色體上同源基因片段同源重組，重組片段emr-cotb-vp7插入控制芽孢萌發的重要基因gerkb的編碼序列中并整合于染色體上，導致gerkb插入失活(見本發明附圖說明和附圖3)。轉化子分別以特異引物通過pcr鑒定(見本發明附圖說明和附圖4)，鑒定后的重組菌株分別命名為dr1700-vp7(emr)。5.無紅霉素抗性基因標記的重組枯草芽孢桿菌菌株的制備為獲得無抗生素抗性基因標記的重組枯草芽孢桿菌菌株dr1700-vp7(ems)，將重組菌株dr1700-vp7(emr)通過無抗生素抗性培養基培養24-30h(8-12代，切除重組頻率約為3％)。將傳代細菌在無抗生素平板上單菌落培養，并通過影印技術將菌落轉移至含0.4μg/mlem的lb平板上，利用枯草芽孢桿菌xer重組酶對emr兩側的nif序列進行切除重組，篩選對紅霉素敏感的菌落(ems)(見本發明附圖說明和附圖3和圖5)。鑒定后將其命名為重組菌株dr1700-vp7(ems)(見本發明附圖說明和附圖6)。6.萌發缺陷、無抗生素抗性基因標記及表面展示vp7的重組芽孢的制備以dsm培養基誘導重組菌株dr1700-vp7(ems)形成芽孢。dsm培養基的配制：0.8％肉湯營養液(difco),0.1％kcl,0.025％mgso4·7h2o,1.0mmca(no3)2,10μmmncl2,1.0μmfeso4)。取重組菌株dr1700-vp7(ems)單菌落接種于3mldsm培養基中，37℃震蕩培養40h，5000rpm離心10min收集芽孢，重懸于1ml無菌水中。以終濃度為10mg/ml溶菌酶37℃處理30min破壞營養細胞，5000rpm離心10min沉淀芽孢，加1ml水重懸芽孢。取5μl純化后的重組芽孢涂布與lb(1％tryptone,0.5％yeastextract,1％nacl)培養基平板上，37℃培養。觀察發現重組芽孢不能萌發形成營養細胞。取20μl純化芽孢懸液，加bsa至終濃度2％室溫封閉30min，以pbs洗滌5次后重懸于20μlpbs中，加兔抗vp7多克隆抗體室溫靜置1h,，洗滌三次后重懸于20μlpbs中，加ftic標記的山羊抗兔血清(beyotime,海門)，室溫1h后洗滌三次后重懸于20μlpbs中，取5μl樣品壓片后，利用裝置在leicadfc300fx熒光顯微鏡上的leicaqwinlite圖像分析軟件輔助的leicadfc300fx冷ccd數碼攝像頭進行拍攝。fitc熒光通過sapphire濾光片組件(激發光濾光片bf470/40,dichromaticmirror:500,發射光濾片:bp525/50)觀察，拍攝快門速度為270ms。觀察結果顯示重組芽孢表面具有強烈的綠色熒光(見本發明附圖說明和附圖8)。7.萌發缺陷、無抗生素抗性基因標記及表面展示vp7的重組芽孢口服疫苗的制備重組芽孢懸液與草魚顆粒飼料按2-3％混合，芽孢含量為106-109芽孢和克飼料，室溫條件下靜止吸附12h；添加植物調和油，與重組芽孢混合顆粒飼料按2-3％比例混合，制備重組芽孢口服疫苗。實施例2以geraa為整合位點表面展示gcrv抗原vp7的重組芽孢口服疫苗的制備1.分子生物學操作及細菌轉化與實施例1中1.和2.所述方法相同。2.以geraa為整合位點的整合性載體的構建2.1以geraa為整合位點的整合性平臺載體的構建以geraa-1和geraa-2為引物，b.subtilis168染色體為模板，pcr擴增geraa基因片段，t4dna聚合酶補平后克隆于pjs313(ndei酶切位點被破壞的puc18質粒,《分子克隆：試驗手冊》第二版，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約，1989)中pvuii位點，得到的重組質粒為pjs1482。pjs1482質粒中的geraa片段中存在psti和saci酶切位點。以含nif序列的km-nif1和km-nif2引物，pub110(molecular,cellular,anddevelopmentalbiology,universityofcolorado,boulder,co80309,usa)質粒為模板，pcr擴增卡那霉素抗性基因(kmr)；以cotc-1和cotc-2為引物，pcr擴增含啟動子的cotc基因。以純化后的cotc基因和kmr基因片段混合物為模板，km-nif2和cotc-2為引物，pcr擴增kmr-cotb重組片段，擴增產物正向克隆于pmd-19t(寶生物工程(大連)有限公司)載體中，轉化e.colidh5α得到重組質粒pjs1834。以psti和saci酶切pjs1834，回收kmr-cotc重組片段，與相同酶切pjs1482連接，得到整合性平臺載體命名為pjs1837(見本發明附圖說明和附圖1)。該平臺載體含兩端有枯草芽孢桿菌xer位點特異重組酶識別序列nif的卡那霉素抗性基因(kmr)、含啟動子序列但無終止密碼子的芽孢衣殼蛋白基因cotc、以及作為重組基因整合于染色體geraa基因中的整合片段。在cotc基因下游有ndei、xbai、bamhi、kpni和saci多克隆位點。2.2以geraa為整合位點融合表達cotc-vp7的整合性載體構建以ndei和kpni酶切pjs1603，回收合成基因vp7克隆于pjs1837平臺載體中，轉化e.colidh5α得到重組載體pjs1837-vp7(見本發明附圖說明和附圖2)。該質粒中含有kmr-cotc-vp7重組片段，在枯草芽孢桿菌芽孢中融合表達重組蛋白cotc-vp7。3.芽孢融合表達cotc-vp7的重組枯草芽孢桿菌菌株的構建將整合性質粒pjs1837-vp7轉化b.stubtilis，以10μg/ml的卡拉霉素(km)篩選轉化子。通過重組質粒上的geraa片段與染色體上同源基因片段雙交換重組，重組片段(kmr-cotc-vp7插入控制芽孢萌發的重要基因geraa的編碼序列中并整合于染色體上，導致geraa插入失活(見本發明附圖說明和附圖3)。轉化子分別以特異引物通過pcr鑒定(見本發明附圖說明和附圖4)，鑒定后的重組菌株分別命名為dr1837-vp7(kmr)。4.無卡拉霉素抗性基因標記重組枯草芽孢桿菌菌株的篩選。與實施例1中5.所述方法相同。將傳代細菌在無抗生素平板上單菌落培養,并通過影印平板將平板菌落轉移至含10μg/mlkm的lb平板上，利用枯草芽孢桿菌xer重組酶對kmr兩側的nif序列進行切除重組，篩選對卡拉霉素敏感的菌落(kms)(見本發明附圖說明和附圖3和圖5)。通過pcr對其抗性基因進行鑒定(見本發明附圖說明和附圖6)，并將重組菌株命名為dr1837-vp7(kms)。5.萌發缺陷、無抗生素抗性基因標記及表面展示vp7的重組芽孢制備以本發明實施例1中6.所述方法制備并鑒定dr1837-vp7(kms)菌株重組芽孢的萌發能力(見本發明附圖說明和附圖7)和表面展示vp7(見本發明附圖說明和附圖8)。6.萌發缺陷、無抗生素抗性基因標記及表面展示vp7的重組芽孢口服疫苗的制備以本發明實施例1中7.所述方法制備萌發缺陷、無抗生素抗性基因標記及表面展示vp7的重組芽孢口服疫苗。實施例3以gerbb為整合位點無抗生素抗性基因標記表面展示vp7的重組枯草芽孢桿菌芽孢1.分子生物學操作及細菌轉化與實施例1中1.和2.所述方法相同。2.以gerbb為整合位點整合性載體的構建2.1以gerbb為整合位點的整合性平臺載體的構建以gerbb-1和gerbb-2為引物，b.subtilis168染色體為模板，pcr擴增gerbb基因片段，t4dna聚合酶補平后克隆于pjs313(ndei酶切位點被破壞的puc18質粒,《分子克隆：試驗手冊》第二版，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約，1989)中pvuii位點，得到的重組質粒為pjs1881g。以gerbb-p和gerbb-s為引物，pjs1881g為模板，反轉pcr擴增產物以psti和saci酶切；以含有nif序列的em-nif1和em-nif2為引物，pmutin4質粒(laboratoiregenetiquemicrobienne,inra,domainedevilvert,jouy-en-josas78350,france)為模板，pcr擴增emr基因；以cotg-1和cotg-2為引物，pcr擴增包含啟動子的cotg基因。以純化cotg基因和emr基因混合物為模板，em-nif2和cotg-2為引物，pcr擴增重組片段emr-cotg基因片段，擴增產物正向克隆于pmd-18t(購自寶生物工程(大連)有限公司)載體中，轉化e.colidh5α得到重組質粒pjs1804g。以psti和saci酶切pjs1804g，回收emr-cotb重組片段與相同酶切的pjs1881g反轉pcr產物連接，得到整合性平臺載體命名為pjs1900g(見本發明附圖說明和附圖1)。該平臺質粒含有枯草芽孢桿菌xer位點特異重組酶識別序列nif的emr篩選標記、含啟動子序列但無終止密碼子的芽孢衣殼蛋白基因cotg、以及作為整合平臺的gerbb基因片段。在cotg基因下游有多克隆位點ndei、xbai、bamhi、kpni和saci，便于表面展示目的蛋白或酶的基因克隆。2.2以gerbb為整合位點融合表達cotg-vp7的整合性載體構建以ndei和kpni酶切pjs1603，回收合成基因vp7克隆于pjs1900g體中，轉化e.colidh5α得到重組質粒pjs1900g-vp7(見本發明附圖說明和附圖2)。該質粒中含有emr-cotb-vp7重組基因，在枯草芽孢桿菌細胞中cotg啟動子控制下表達融合蛋白cotg-vp7。3.芽孢融合表達cotg-vp7的重組枯草芽孢桿菌菌株構建將整合性載體pjs1900g-vp7轉化b.stubtilis，以0.4μg/ml的em篩選轉化子。通過重組質粒上的gerbb片段與染色體上同源基因片段雙交換重組，將重組基因片段(emr-cotg-vp7)插入控制芽孢萌發的重要基因gerbb的編碼序列中并整合于染色體上，導致gerbb插入失活(見本發明附圖說明和附圖3)。轉化子分別以特異引物通過pcr鑒定(見本發明附圖說明和附圖4)，鑒定后的重組菌株分別命名為dr1900g-vp7(emr)。4.無紅霉素抗性基因標記重組枯草芽孢桿菌菌株的篩選與實施例1中5.所述方法相同。將傳代細菌在無抗生素平板上單菌落培養，并通過影印平板將平板菌落轉移至含0.4μg/mlem的lb平板上，利用枯草芽孢桿菌xer重組酶對emr兩側的nif序列進行切除重組，篩選對紅霉素敏感的菌落(ems)(見本發明附圖說明和附圖3和圖5)。通過pcr對其抗性基因進行鑒定(見本發明附圖說明和附圖6)，并將重組菌株命名為dr1900g-vp7(ems)。5.萌發缺陷、無抗生素抗性基因標記及表面展示vp7的重組芽孢制備以實施例1中6.所述方法制備并鑒定dr1900g-vp7(ems)菌株重組芽孢的萌發能力(見本發明附圖說明和附圖7)和表面展示vp7(見本發明附圖說明和附圖8)。6.萌發缺陷、無抗生素抗性基因標記及表面展示vp7的重組芽孢口服疫苗的制備以本發明實施例1中7.所述方法制備萌發缺陷、無抗生素抗性基因標記及表面展示vp7的重組芽孢口服疫苗。實施例4以gerkb為整合位點表面展示gcrv抗原vp5的重組芽孢口服疫苗的制備1.分子生物學操作及細菌轉化與實施例1中1.和2.所述方法相同。2.以gerkb為整合位點融合表達cotb-vp5的整合性質粒的整合載體構建以ndei和kpni酶切pjs1602，回收vp5片段并隆于本發明實施例1中2所述的整合性平臺載體pjs1700(見本發明附圖說明和附圖1)中，得到的重組載體命名為pjs1700-vp5(見本發明附圖說明和附圖2)。該整合性載體中含有emr-cotb-vp5重組片段，在枯草芽孢桿菌芽孢中融合表達重組蛋白cotb-vp5。3.芽孢融合表達cotb-vp5的重組枯草芽孢桿菌菌株的構建將整合性質粒pjs1700-vp5轉化b.stubtilis，以0.4μg/ml的em篩選轉化子。通過重組質粒上的gerkb片段與染色體上同源基因片段同源重組，重組基因片段(emr-cotb-vp5)插入控制芽孢萌發的重要基因gerkb的編碼序列中并整合于染色體上，導致gerkb插入失活(見本發明附圖說明和附圖3)。轉化子分別以特異引物通過pcr鑒定(見本發明附圖說明和附圖4)，鑒定后的重組菌株分別命名為dr1700-vp5(emr)。4.無紅霉素抗性基因標記的重組枯草芽孢桿菌菌株的篩選與實施例1中5.所述方法相同。將傳代細菌細胞以適當的濃度稀釋有涂布與無抗生素lb平板上培養形成單菌落,并通過影印平板將平板菌落轉移至含0.4μg/mlem的lb平板上，利用枯草芽孢桿菌xer重組酶對emr兩側的nif序列進行切除重組，篩選對紅霉素敏感的菌落(ems)(見本發明附圖說明和附圖3和圖5)。通過pcr對其抗性基因進行鑒定(見本發明附圖說明和附圖6)，并將重組菌株命名為dr1700-vp5(ems)。5.萌發缺陷、無抗生素抗性基因標記及表面展示vp5的重組芽孢制備以本發明實施例1中6.所述方法制備并鑒定dr1700-vp5(ems)菌株重組芽孢的萌發能力(見本發明附圖說明和附圖7)和表面展示vp5(見本發明附圖說明和附圖8)。6.萌發缺陷、無抗生素抗性基因標記及表面展示vp5的重組芽孢口服疫苗的制備以本發明實施例1中7.所述方法制備萌發缺陷、無抗生素抗性基因標記及表面展示vp5的重組芽孢口服疫苗。實施例5以geraa為整合位點表面展示gcrvvp5的重組芽孢口服疫苗的制備1.分子生物學操作及細菌轉化與實施例1中1.和2.所述方法相同。2.以geraa為整合位點融合表達cotc-vp5的整合性質粒的整合載體構建以ndei和kpni酶切pjs1602，回收合成基因vp5克隆于pjs1837平臺載體中，轉化e.colidh5α得到重組載體pjs1837-vp5(見本發明附圖說明和附圖2)。該質粒中含有kmr-cotc-vp5重組片段，在枯草芽孢桿菌芽孢中融合表達重組蛋白cotc-vp5。3.芽孢融合表達cotc-vp5的重組枯草芽孢桿菌菌株的構建將整合性質粒pjs1837-vp5轉化b.stubtilis，以10μg/ml的km篩選轉化子。通過重組質粒上的geraa片段與染色體上同源基因片段進行同源重組，重組基因片段(kmr-cotc-vp5)插入控制芽孢萌發的重要基因geraa的編碼序列中并整合于染色體上，導致geraa插入失活(見本發明附圖說明和附圖3)。轉化子分別以特異引物通過pcr鑒定，鑒定后的重組菌株分別命名為dr1837-vp5(kmr)(見本發明附圖說明和附圖4)。4.無卡拉霉素抗性基因標記的重組枯草芽孢桿菌菌株的篩選與實施例1中5.所述方法相同。將傳代細菌細胞以適當的濃度稀釋后涂布于無抗生素lb平板上培養形成單菌落，通過影印平板將平板菌落轉移至含10μg/mlkm的lb平板上，利用枯草芽孢桿菌xer重組酶對kmr兩側的nif序列進行切除重組，篩選對卡拉霉素敏感的菌落(kms)(見本發明附圖說明和附圖3和圖5)。通過pcr對其抗性基因進行鑒定(見本發明附圖說明和附圖6)，并將重組菌株命名為dr1837-vp5(kms)。5.萌發缺陷、無抗生素抗性基因標記及表面展示vp5的重組芽孢制備以本發明專利實施例1中6.所述方法制備dr1837-vp5(kms)重組芽孢，分析重組芽孢的萌發能力(圖7)。以本發明專利實施例3中5.所述之方法分析重組芽孢表面展示脂肪酶活性。dr1837-vp5(kms)重組芽孢脂肪酶活性測定結果見本發明附圖說明和附圖8。6.萌發缺陷、無抗生素抗性基因標記及表面展示vp5的重組芽孢口服疫苗的制備以本發明實施例1中7.所述方法制備萌發缺陷、無抗生素抗性基因標記及表面展示vp5的重組芽孢口服疫苗。實施例6以gerbb為整合位點無抗生素抗性基因標記表面展示vp5的重組枯草芽孢桿菌芽孢1.分子生物學操作及細菌轉化與實施例1中1.和2.所述方法相同。2.以gerbb為整合位點融合表達cotg-vp5的整合性載體構建以ndei和kpni酶切以ndei和kpni酶切pjs1602，回收vp5片段并隆于本發明實施例3中2所述的整合性平臺載體pjs1900g(見本發明附圖說明和附圖1)中，得到的重組載體命名為pjs1900g-vp5(見本發明附圖說明和附圖2)。該整合載體中含有emr-cotg-vp5重組基因，在枯草芽孢桿菌細胞中cotg啟動子控制下表達融合蛋白cotg-vp5。3.芽孢融合表達cotg-vp5的重組枯草芽孢桿菌菌株構建將整合性載體pjs1900g-vp5轉化b.stubtilis，以0.4μg/ml的em篩選轉化子。通過重組質粒上的gerbb片段與染色體上同源基因片段雙交換重組，將重組基因片段(emr-cotg-vp5)插入控制芽孢萌發的重要基因gerbb的編碼序列中并整合于染色體上，導致gerbb插入失活(見本發明附圖說明和附圖3)。轉化子分別以特異引物通過pcr鑒定(見本發明附圖說明和附圖4)，鑒定后的重組菌株分別命名為dr1900g-vp5(emr)。4.無紅霉素抗性基因標記重組枯草芽孢桿菌菌株的篩選與實施例1中4.所述方法相同。將傳代細菌在無抗生素平板上單菌落培養，并通過影印平板將平板菌落轉移至含0.4μg/mlem的lb平板上，利用枯草芽孢桿菌xer重組酶對emr兩側的nif序列進行切除重組，篩選對紅霉素敏感的菌落(ems)(見本發明附圖說明和附圖3和圖5)。通過pcr對其抗性基因進行鑒定(見本發明附圖說明和附圖6)，并將重組菌株命名為dr1900g-vp5(ems)。5.萌發缺陷、無抗生素抗性基因標記及表面展示vp5的重組芽孢制備以實施例1中6.所述方法制備并鑒定dr1900g-vp5(ems)菌株重組芽孢的萌發能力(見本發明附圖說明和附圖7)和表面展示vp5(見本發明附圖說明和附圖8)。6.萌發缺陷、無抗生素抗性基因標記及表面展示vp5的重組芽孢口服疫苗的制備以本發明實施例1中7.所述方法制備萌發缺陷、無抗生素抗性基因標記及表面展示vp5的重組芽孢口服疫苗。sequencelisting<110>中國科學院水生生物研究所<120>一種草魚抗呼腸孤病毒口服重組芽孢疫苗及其制備方法<130><160>27<170>patentinversion3.3<210>1<211>50<212>dna<213>人工序列<400>1gagtttacataatatatattctaggaagtcggattaggccgtttgtcctc50<210>2<211>28<212>dna<213>人工序列<400>2catatgggatgattgatcatctgaagat28<210>3<211>56<212>dna<213>人工序列<400>3ccggagtttacataatatatattctaggaagtccggttcaaaataaatgcattccc56<210>4<211>36<212>dna<213>人工序列<400>4catatggtgttttttatgctttttatactctacaac36<210>5<211>54<212>dna<213>人工序列<400>5gagtttacataatatatattctaggaagtcctctgcctttggagacagtgtccc54<210>6<211>26<212>dna<213>人工序列<400>6catatggtcgtcgcagtggtggtgcg26<210>7<211>22<212>dna<213>人工序列<400>7gacctcattggaacaaacagag22<210>8<211>23<212>dna<213>人工序列<400>8caatgacactgacgacaatgacc23<210>9<211>22<212>dna<213>人工序列<400>9gtgatcggccatctcatgcgcc22<210>10<211>23<212>dna<213>人工序列<400>10gagcatacaggcaaattgctggg23<210>11<211>39<212>dna<213>人工序列<400>11gagagacacactgcaggacaacctctcccaaaatccgag39<210>12<211>36<212>dna<213>人工序列<400>12gagagacacagagctccgccaatggcagttgtggtg36<210>13<211>21<212>dna<213>人工序列<400>13gagttaatgcttggcaatgcg21<210>14<211>20<212>dna<213>人工序列<400>14gggtaacctgcaagctgacc20<210>15<211>36<212>dna<213>人工序列<400>15gagagacacactgcagaattctgtgtcccggtcaag36<210>16<211>37<212>dna<213>人工序列<400>16gagagacacagagctcaggacaacagcaacattcgtc37<210>17<211>50<212>dna<213>人工序列<400>17ggacttcctagaatatatattatgtaaactccgttaatgcgccatgacag50<210>18<211>54<212>dna<213>人工序列<400>18cccgggagtttacataatatatattctaggaagtgacgaaactgcaaaatatcc54<210>19<211>50<212>dna<213>人工序列<400>19gacttcctagaatatatattatgtaaactcgaaaagtgccacctgacgtc50<210>20<211>54<212>dna<213>人工序列<400>20cccgggagtttacataatatatattctaggaagtagctccttggaagctgtcag54<210>21<211>33<212>dna<213>人工序列<400>21gagatatacatatggctagcaaaggagaagaac33<210>22<211>36<212>dna<213>人工序列<400>22gagatataggtaccgcaggtcgactctagaggatcc36<210>23<211>31<212>dna<213>人工序列<400>23gagagacatatgtcggtcgtgtcggccatcc31<210>24<211>34<212>dna<213>人工序列<400>24ggagagaggtaccttaactcggtctcagtgccag34<210>25<211>28<212>dna<213>人工序列<400>25acttcctagaatatatattatgtaaact28<210>26<211>1017<212>dna<213>人工序列<400>26catatgcaggctagcaaattggacgacaagattggaattctgtctaacagaattggagcc60aacaccgccagcattaatttcctggctggaattgtggatgcgacgagaattgatgcagtg120gacgcgccactgtacatttatattgtggatgaccagagacgcctggcaattgccacggga180gacggattatttgtgaaagatcgtaagctgaacggatacgatgtgcgtagctttccacct240attgccgtggctaaatataatgacattttatctttctcactgagctcagcccctccactg300gacattgttgatggaaagttggctgtgagcacaactagcagactgttcatcaccagcgga360aagttagacactaattcttatgtgggatcatcaagcgtggacatttctggagcggcggca420gaaaagacggtgagcgttagaacgattaaccctatcattgcaggacaggatggactgtca480ctgtcactgagcggagtgctggaagttggatctggattattactgtcaggaagatcttgg540cctcttacattggatctgcgtgtgagcactccattagcgtatgaccacacaggagtatta600tcagttgtaacacgttatcctttagatgtgacgtctgctggaatgggagtgaacatgcaa660gtgcctctgcgtctgcacggagtggacttgggattggcatacaatacgcaggatttctca720attgttgacggatatttgactttgaacagatctcaaggaaaactggaagaactcggagaa780gcggtgaacatgaacgctactctggtggacttaaatgacggaggattgcaggctctggaa840acagatttaagcttggaaaagcctctcaacgctatgcaatgcctgtttgaacacgaagga900acgtggcgttggaaatttggagtgcgaatgtctacggaaccgacgattacaactgtgcgt960gttaatgttcacagcacttggtctgtggctgtgcaggaatcaattgcataaggtacc1017<210>27<211>840<212>dna<213>人工序列<400>27catatgccacttcacatgattccgcaagtggcccacgctatggtgcgtgcagccgctgca60ggacgccttaccttatacacaagaactagaactgaaaccaccaactttgatcacgctgaa120tacgtgacctgcggacgttacaccatctgcgccttctgccttacgactctggctcctcac180gccaacgtgaagaccattcaagactcacacgcttgttcacgtcaaccaaatgaagccatt240cgctcattagtggaagtgagcgacaaagcgcagaccgccctcgtgggaagccgtactgta300gactatcacgaattggatgtgaaagctggattcgtggccccaactgccgatgaaacaatt360gccccttctaaggatatcgtggaacttccgtttcgcacctgtgacttggacgattcatct420gctaccgcttgcgtgcgaaatcactgccaggccggacacgacggagttatccacctcccg480atcctttctggagatttcaaattgcctaacgaacaccctaccaaaccgttggacgatacg540caccctcacgacaaggtgctgactcgctgccctaagactggactcctcctcgtgcacgac600actcacgcacacgccaccgccgtagttgccaccgctgctacgagagctatcctcatgcac660gacctccttacatcagcgaacgcggatgacggacaccaagcacgttcagcttgctacgga720ccagcgtttaacaacctgaccttcgcttgccactcaacctgtgcttcagatatggctcac780ttcgactgcggacagatcgttggactcgacttgcacgtggaaccatcagattaaggtacc840當前第1頁12當前第1頁12