半胱氨酸雙加氧酶、基因及其催化產物半胱亞磺酸的新用途的制作方法

本發明涉及基因工程技術領域，具體涉及一種半胱氨酸雙加氧酶，該酶的直接催化產物半胱亞磺酸，及該酶基因的新用途。

背景技術：

母乳是嬰兒成長最自然、最安全、最完整的天然食物，為嬰兒生長發育提供最佳的營養。調查發現，國內65.3％的哺乳期婦女為6月齡內的嬰兒提供配方奶粉喂養，其中絕大多數(86.2％)是由于母乳不足(widespreadusageofinfantformulainchina：amajorpublichealthproblem，birth41(4)：339-343，2014)。人類乳腺發育不良致母乳不足對嬰兒發育和人口質量具有長遠影響。

另據研究表明，仔豬斷奶前的生長速度及成活率與哺乳母豬乳腺發育程度密切相關，哺乳母豬泌乳不足是仔豬死亡的重要原因之一。山羊生產中也存在母羊泌乳不足造成羔羊發育不良和死亡的問題。對于奶牛，乳腺發育程度更是影響其乳產量和泌乳壽命的主要決定性因素。

半胱氨酸雙加氧酶(cysteinedioxygenase，cdo)是一種非血紅素類單亞鐵核心離子金屬酶，能催化半胱氨酸加一分子氧生成半胱亞磺酸(cysteinesulfinicacid，csa)。半胱亞磺酸在半胱亞磺酸脫羧酶(csad)作用下生成亞牛磺酸并進一步轉化為牛磺酸。小鼠、大鼠、豬、牛和人的cdo基因結構、表達規律和功能高度相似，均由5個外顯子構成，均編碼200個氨基酸，其蛋白氨基酸序列同源性高于90％。已有報道cdo基因缺陷會引起自主免疫性疾病(abnormalsulphuroxidationinsystemiclupuserythematosus，lancet339(8784)：25-26，1992)和神經性疾病(阿茲海默癥和帕金森綜合癥)(plasmacysteineandsulphatelevelsinpatientswithmotorneurone，parkinson′sandalzheimer′sdisease，neuroscilett110(1-2)：216-220，1990)。此外，cdo可能與腫瘤抑制相關(cysteinedioxygenase1isatumorsuppressorgenesilencedbypromotermethylationinmultiplehumancancers，plosone7(9)：e44951，2012；frequentinactivationofcysteinedioxygenasetype1contributestosurvivalofbreastcancercellsandresistancetoanthracyclines，clincancerres19(12)：3201-3211，2013)。

目前cdo相關的研究主要集中在牛磺酸的合成及牛磺酸的功能調控。cdo的直接催化產物半胱亞磺酸的生物學功能尚未見報道。尚未見半胱氨酸雙加氧酶及其催化產物半胱亞磺酸與乳腺發育相關的研究和報道。

技術實現要素：

本發明提供一種半胱氨酸雙加氧酶，該酶的直接催化產物半胱亞磺酸，及該酶基因的新用途，具體為半胱氨酸雙加氧酶及其基因，以及其直接催化產物半胱亞磺酸與哺乳動物乳腺發育和泌乳相關，能夠促進乳腺導管延伸和分枝，促進泌乳，可作為治療乳腺發育不良的一種手段。

本發明采取的技術方案如下：

1.半胱氨酸雙加氧酶基因、半胱氨酸雙加氧酶或其催化產物半胱亞磺酸在制備促進乳腺導管發育的藥物中的應用。

2.半胱氨酸雙加氧酶基因、半胱氨酸雙加氧酶或其催化產物半胱亞磺酸在制備促進泌乳的藥物中的應用。

3.半胱氨酸雙加氧酶基因、半胱氨酸雙加氧酶或其催化產物半胱亞磺酸在制備預防或治療乳腺發育不良的藥物中的應用。

4.半胱氨酸雙加氧酶基因、半胱氨酸雙加氧酶或其催化產物半胱亞磺酸在制備促進乳腺導管延伸與分枝的藥物中的應用。

5.半胱氨酸雙加氧酶基因、半胱氨酸雙加氧酶或其催化產物半胱亞磺酸在制備促進乳腺腺泡發育的藥物中的應用。

優選的，所述藥物以哺乳動物為治療對象。

優選的，所述哺乳動物為人、豬、牛、綿羊、山羊、小鼠或大鼠。

本發明的有益效果在于：本發明通過將雌性小鼠cdo基因敲除后發現乳腺導管系統發育嚴重受損，由于乳腺發育不良導致泌乳不足，所育后代發育受阻或死亡；而為青春期cdo基因敲除雌鼠補充cdo的直接催化產物半胱亞磺酸后，其乳腺導管系統發育得到部分恢復。對野生型小鼠(cdo未敲除)，補充一定劑量半胱亞磺酸后乳腺導管發育明顯加快(導管延伸加快、分枝增多)。本發明的研究表明，cdo通過其催化產物半胱亞磺酸促進哺乳動物乳腺導管系統發育，為乳腺發育不良的預防和治療及提高哺乳動物泌乳能力提供了新的思路。

附圖說明

圖1為cdo蛋白在小鼠各組織器官及乳腺中的westernblot分析結果；a圖中1-9依次為cdo蛋白在心臟、肝臟、脾、肺、腎、下丘腦、垂體、卵巢、乳腺中的相對表達量；b圖中1-7依次為小鼠在21日齡、6周齡、12周齡、妊娠14.5天、泌乳第一天、泌乳第7天、乳腺退化期的cdo蛋白相對表達水平；

圖2為cdo基因敲除小鼠信息；圖中a為cdo基因結構及cas9n靶點示意圖；b圖為試驗中采用的cdo突變小鼠dna測序結果(cdo基因編碼區dna序列缺失83bp，從編碼區第42位至第124位堿基缺失)；c圖為cdo突變小鼠dnasanger測序峰圖；d圖為cdo基因突變小鼠乳腺cdo蛋白表達驗證(cdo和csad抗體來自abcam公司)；

圖3cdo敲除(cdo^-/-)及野生型(cdo^+/+)雌性小鼠乳腺全組織染色結果；具體為21日齡(21day)、6周齡(6week)、12周齡(12week)野生型(cdo^+/+)小鼠和cdo敲除(cdo^-/-)小鼠乳腺全組織染色結果；

圖4半胱亞磺酸(csa)、牛磺酸(taurine)及半胱氨酸鹽酸鹽(cysteine-cl)對乳腺導管發育的影響。

圖5為半胱亞磺酸(csa)促進野生型小鼠乳腺導管延伸和分枝染色結果。

具體實施方式

下面將對本發明技術方案的實施例進行詳細的描述。以下實施例僅用于更加清楚地說明本發明的技術方案，因此只作為示例，而不能以此來限制本發明的保護范圍。

相關哺乳動物cdo基因mrna序列ncbi登錄號：

小鼠cdo基因mrna序列ncbi登錄號nm_033037；

大鼠cdo基因mrna序列ncbi登錄號nm_052809；

人cdo基因mrna序列ncbi登錄號nm_001323565、nm_001801、nm_001323566、nm_001323567；

牛cdo基因mrna序列ncbi登錄號nm_001034465；

山羊cdo基因mrna序列ncbi登錄號xm_005685043；

綿羊cdo基因mrna序列ncbi登錄號xm_015096777；

豬cdo基因mrna序列ncbi登錄號nm_001167643。

實施例1

采用westernblot方法對6周齡雌性小鼠各組織器官中cdo蛋白表達量進行相對定量分析，實驗結果表明cdo在乳腺中高表達(表達量僅次于肝臟)，而在下丘腦、垂體和卵巢等內分泌器官中表達量很低(圖1中a圖)；與現有相關報道吻合。對不同發育期雌性小鼠乳腺組織中cdo蛋白進行westernblot定量分析發現，在各發育期乳腺組織中cdo蛋白表達量呈明顯規律性變化。在青春期到成年發育期間(3周齡-12周齡，此時乳腺導管快速延伸并大量分枝)乳腺中cdo呈現高水平表達，而在妊娠期和泌乳期(此時乳腺腺泡大量分化)乳腺中cdo表達量顯著降低，而泌乳期結束后乳腺退化期(此時乳腺腺泡退化，乳腺逐漸恢復到妊娠前狀態)cdo蛋白又重新恢復到妊娠前的表達水平(圖1中b圖)。cdo蛋白在乳腺導管延伸和分枝發育期高表達，而乳腺腺泡發育期低表達的規律恰好符合乳腺“未孕-懷孕-泌乳-退化”的循環發育規律，提示cdo可能與乳腺導管延伸與分枝密切相關。

實施例2

為了揭示cdo對乳腺發育的調控作用，我們利用crispr/cas9技術，在cdo基因第一外顯子編碼區設置兩個反向縮短的sgrna靶點(圖2中a圖)配合cas9n(d10a)切刻酶，避免了脫靶的發生。利用t7轉錄試劑盒(mmessagemachinet7kit，life公司)合成cas9n基因mrna，利用t7高效轉錄試劑盒(hiscribe^tmt7highyieldrnasynthesiskit，neb)合成兩個sgrna。通過小鼠受精卵顯微注射cas9nmrna(60ng/μl)和兩個sgrna(20ng/μl)并胚胎移植獲得cdo基因移碼突變小鼠(圖2中b圖和c圖)。經擴繁獲得純合突變(cdo基因敲除)個體，通過westernblot驗證cdo敲除小鼠乳腺中cdo蛋白表達缺失(圖2中d圖)。

實施例3

經過仔細觀察發現cdo基因敲除雌鼠所育后代發育不良，且不能存活，但將其后代寄養于哺乳期野生型(cdo未敲除)雌鼠后正常存活，并健康發育。說明cdo基因敲除雌鼠泌乳不足至后代發育不良并死亡。進一步進行乳腺全組織染色，實驗步驟包括：采集小鼠第四對乳腺在玻片上鋪平，于卡諾固定液(酒精∶氯仿∶冰醋酸＝6∶3∶1體積比)中固定過夜，然后在體積分數70％的酒精中平衡5分鐘，置于醋酸洋紅染液中染色2小時，酒精梯度(80％-90％-95％-100％)脫水(每級10分鐘)，二甲苯透明10分鐘，中性樹膠封片。染色結果見圖3，結果表明，同窩的野生型(cdo^+/+)雌鼠乳腺發育正常，而cdo敲除(cdo^-/-)雌鼠乳腺導管延伸明顯變慢，而且分枝也顯著減少。

實施例4

根據半胱氨酸代謝途徑分析，cdo敲除后，一方面會導致半胱亞磺酸(csa)和牛磺酸(taurine)合成障礙，另一方面半胱氨酸(cysteine)向下代謝受阻而在細胞中積累。課題組分別對青春期cdo基因敲除(cdo^-/-)和野生型(cdo^+/+)雌鼠通過腹腔注射補充半胱亞磺酸(csa)、牛磺酸(taurine)或過量的半胱氨酸鹽酸鹽(cysteine-cl)，分析這些物質對乳腺發育的影響。具體方法為：對21日齡至35日齡cdo敲除(cdo^-/-)雌鼠通過腹腔注射csa(100mg/kg體重/天)或taurine(100mg/kg體重/天)；對21日齡至35日齡野生型(cdo^+/+)雌鼠通過腹腔注射質量分數0.8％nacl(每天0.2ml對照)、taurine(100mg/kg體重/天)、csa(100mg/kg體重/天)或cysteine-cl(200mg/kg體重/天)后乳腺全組織染色(染色步驟同實施例3)；csa、taurine和cysteine-cl分別用0.8％的nacl溶解。結果見圖4，連續補償csa(從21日齡～35日齡，100mg/kg體重/天)，不但能明顯改善cdo基因敲除雌鼠乳腺導管發育不良的問題，而且也顯著促進野生型小鼠乳腺導管的延伸和分枝發育，而牛磺酸對照處理并無明顯變化；過量的半胱氨酸鹽酸鹽(200mg/kg體重/天，從21日齡～35日齡)處理，也不影響野生型雌鼠乳腺導管發育。以上結果表明cdo主要通過其下游產物半胱亞磺酸調控乳腺導管發育。

實施例5

為了進一步驗證半胱亞磺酸促進乳腺導管發育的功能，課題組對21日齡至42日齡野生型(cdo^+/+)小鼠每天通過腹腔注射補充半胱亞磺酸(100mg/kg體重)或對照處理(質量分數0.8％nacl)，43日齡采集第四對乳腺組織進行全組織染色。結果見圖5，圖的結果表明csa處理小鼠相對于對照組(質量分數0.8％nacl)，乳腺導管延伸明顯加快、分枝顯著增多，csa能顯著促進野生型小鼠乳腺導管延伸和分枝發育。

最后應說明的是：以上各實施例僅用以說明本發明的技術方案，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本發明進行了詳細的說明，本領域的普通技術人員應當理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應技術方案的本質脫離本發明各實施例技術方案的范圍，其均應涵蓋在本發明的權利要求和說明書的范圍當中。