七鰓鰻CRBGP在制備抗惡性膠質瘤藥物中的應用的制作方法

文檔序號：11219614閱讀：563來源：國知局

本發明涉及一種七鰓鰻crbgp的新用途，尤其是一種七鰓鰻crbgp在制備抗惡性膠質瘤藥物中的應用。

背景技術：

富含半胱氨酸分泌蛋白（cysteinerichsecretoryproteins，crisp）是一類在進化上高度保守的蛋白質，含有16個高度保守的半胱氨酸殘基，可形成8對二硫鍵。空間結構主要由n端的pr-1結構域（pathogenesis-relatedgroup1domain）、c端的crd結構域（cysteine-richdomain）以及連接這兩個結構域的鉸鏈區域三部分組成。近年來研究發現，哺乳動物中的crisp家族各成員主要分布于生殖道中，在精子的成熟、精卵融合以及免疫系統中發揮著非常重要的作用；而非哺乳動物中的crisp家族成員則主要分布于腺體的分泌液中，能夠阻斷k⁺、ca²⁺及環核苷酸門控通道等，并與炎癥反應密切相關。

七鰓鰻crbgp是從日本七鰓鰻（lampetrajaponica）口腔腺中分離純化出的一種新型富含半胱氨酸分泌蛋白，因與crisp家族成員具有高度同源性，同樣具有16個高度保守的半胱氨酸殘基，因此將其命名為富含半胱氨酸的口腔腺分泌蛋白(cysteine-richbuccalglandprotein，crbgp)。

七鰓鰻crbgp的cdna序列（開放閱讀框）含有774bp，其蛋白質有257個氨基酸組成，質譜測定分子量為25.6kda，其cdna序列及由其推導的蛋白質氨基酸序列如下：

atgttcactaacctcgtgaccccggcggcgttggcgttggtgttc45

mftnlvtpaalalvf

151015

atggcgagcgtcgtggcggcgacatccgtcaacgactggaagctc90

masvvaatsvndwkl

202530

ctggacacgaagctgtcggcgaaccggaaggtcatcgtggacgtt135

ldtklsanrkvivdv

354045

cacaacgagctgcggcgcggcgtggtgcccaccgccagcaacatg180

hnelrrgvvptasnm

505560

ctcaagatggcgtacaacgaacaggcagcagagaccagccgcttg225

lkmayneqaaetsrl

657075

tgggccgccgcctgcagcttctcgcacagccccagcaacacgcgc270

waaacsfshspsntr

808590

acctggaagacgccgcaagcagagtgggactgcggagagaacctc315

twktpqaewdcgenl

95100105

ttcatgtccagcaacccacggtcgtgggacgaggcagtgcgcagc360

fmssnprswdeavrs

110115120

tggtacgacgaggtcacctcccccggcttccagtacggcacgggg405

wydevtspgfqygtg

125130135

gctgtggggcccggggccgtgggacactacactcaggtggtgtgg450

avgpgavghytqvvw

140145150

tacaagtcccaccaggtgggctgcgccgtcaactactgccccaac495

ykshqvgcavnycpn

155160165

caccccggcgccctcaagttcctctacgtgtgccactactgcccc540

hpgalkflyvchycp

170175180

gcagggaacctggtcaccaggatcaacaaaccctacgacctgggg585

agnlvtrinkpydlg

185190195

actccgtgccaggcctgcccccatagctgcgacaacaacctgtgc630

tpcqacphscdnnlc

200205210

accaacccgtgcccctacgtggaccagttcagcaactgcccgcag675

tnpcpyvdqfsncpq

215220225

ctgttcagcgcccacggctgcgcgaacgacggcgcggggggaacc720

lfsahgcandgaggt

230235240

ttcgtgcagacaaactgccctgccacgtgcagctgcacgacggat765

fvqtncpatcscttd

245250255

gtgcagtga774

vq*

257

目前，已經發現七鰓鰻天然crbgp是na⁺通道阻斷劑，能夠阻斷海馬神經元和背根神經元的na⁺電流，降低海馬神經元和背根神經元的動作單位從而抑制神經元的興奮性；還發現七鰓鰻crbgp對海馬神經元的k⁺通道也具有阻斷作用；此外也發現七鰓鰻crbgp具有抗血管新生活性。但是，迄今為止尚未見有關七鰓鰻crbgp作為鈉離子通道阻斷劑在制備抗惡性膠質瘤藥物中的應用的報道。

技術實現要素：

本發明發現了七鰓鰻crbgp具有抑制惡性膠質瘤的活性，從而發明了七鰓鰻crbgp在制備抗惡性膠質瘤藥物中的應用。

本發明的技術解決方案是：一種七鰓鰻crbgp在制備抗惡性膠質瘤藥物中的應用，所述七鰓鰻crbgp是作為鈉離子通道阻斷劑在制備抗惡性膠質瘤藥物中的應用。

本發明發現了七鰓鰻天然及重組crbgp能夠有效抑制惡性膠質瘤u251細胞的增殖、粘附、遷移及浸潤等過程，并呈劑量依賴性。因此，七鰓鰻crbgp可作為鈉離子通道阻斷劑在制備抗惡性膠質瘤藥物中應用，具有低毒、高效等優點。

附圖說明

圖1本發明實施例crbgp抑制u251細胞增殖示意圖。

圖2本發明實施例crbgp抑制u251細胞粘附示意圖。

圖3本發明實施例crbgp抑制u251細胞遷移的結果及示意圖。

圖4本發明實施例crbgp抑制u251細胞浸潤的結果及示意圖。

具體實施方式

1．天然crbgp的純化

處死七鰓鰻，剝離其口腔腺，并用注射器將口腔腺內的液體吸出于-80℃保存。采用含有50mmtris-hcl，50mmnacl（ph為7.4）的緩沖液將抽出的液體稀釋至24mg/ml，然后，4℃、10000rpm離心10min取上清。將約380μl的上清液加入到1米長的sephadexg-75層析柱中，樣品流速為700μl/min，每個eppendor管收集約1.2ml的洗脫液。采用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳（sds-page）檢測蛋白質的純度，bca法測定蛋白質的濃度。

2．重組crbgp的表達及純化

（1）將去掉信號肽的crbgp基因與載體pegx-4t-1分別雙酶切，于16℃過夜連接，并將連接產物轉化至克隆菌rosettablue中，藍白斑篩選陽性轉化子。

（2）1mm的iptg、16℃過夜誘導重組crbgp的表達；

（3）采用gstresin柱純化重組crbgp，bca及12%sds-page分別測定重組crbgp的濃度和純度。

3．mtt

（1）將狀態良好的u251細胞接種于96孔板中，并在dmem培養液中培養24h；

（2）加藥組依次加入無血清dmem培養液梯度稀釋的crbgp，對照組加入等體積的pbs，繼續培養24h；

（3）加入終濃度為0.5mg/ml的mtt溶液，并于37°c，co2培養箱中繼續培養4h；

（4）吸去培養液，但不要將結晶紫吸出，再加入與培養液等體積的dmso，在37°c的搖床中振蕩培養10min。

（5）利用酶標儀測定u251細胞在492nm處的吸收值，每組實驗均為3次實驗取平均值。

（6）將對照組u251細胞的增值率定義為100%，計算加藥組u251細胞的增殖率=加藥組u251細胞在492nm下吸收值的平均值/對照組u251細胞在492nm下吸收值的平均值×100%。

結果如圖1所示：顯著性差異用星號顯示（*：p<0.05；**：p<0.01；***：p<0.001），mtt檢測結果表明crbgp能夠以劑量依賴性的方式顯著抑制惡性膠質瘤u251細胞的增殖，其半數有效抑制濃度ic50為8.4μm。

4．粘附實驗

（1）用pbs分別將細胞外基質蛋白膠原iv、纖連蛋白和層粘連蛋白稀釋，終濃度為0.1mg/ml細胞外基質蛋白稀釋液，并向96孔板分別加入40μl的細胞外基質蛋白稀釋液，于4°c包被過夜后棄掉。

（2）將u251細胞懸液與6.5μm和13μm的crbgp混勻即為加藥組，對照組加入等體積的pbs，分別接種于已經包被好細胞外基質蛋白的96孔板中。

（3）將96孔板放入溫度為37°c的co2細胞培養箱粘附4h，然后用pbs清洗（將未粘附的細胞洗掉）。

（4）使用顯微鏡拍攝細胞的粘附形態。

（5）采用mtt法檢測粘附在細胞培養板上的u251細胞。以對照組u251細胞的粘附率為100%，計算加藥組u251細胞的粘附率=加藥組u251細胞在492nm下吸收值的平均值/對照組u251細胞在492nm下吸收值的平均值×100%。

結果如圖2所示：顯著性差異用星號表示（***：p<0.001）。結果表明6.5和13μm的crbgp能夠分別抑制13%±18.43%以及78%±5.35%（p<0.001）的u251細胞粘附至膠原iv；6.5和13μm的crbgp能夠分別抑制14.31%±6.67%以及57.86%±6.7%（p<0.001）的u251細胞粘附至纖連蛋白；6.5和13μm的crbgp能夠分別抑制41.14%±4.82%（p<0.001）以及72.07%±1.27%（p<0.001）的u251細胞粘附至層粘連蛋白。

5．遷移實驗

（1）在transwell培養板的下室加入含有15%胎牛血清的dmem培養液和成纖維細胞生長因子（basicfibroblastgrowthfactor，bfgf，終濃度3ng/ml)，bfgf作為趨化因子誘導u251細胞發生遷移。

（2）緩慢并輕輕地將transwell培養板的上室固定到培養板上，放置過程中要避免產生氣泡；

（3）用無血清的dmem培養液將u251細胞制成細胞懸液，并分別與6.5μm和13μm的crbgp混勻（加藥組），對照組加入等體積的pbs，然后分別加入至transwell細胞培養板的上室，于37°c，co2培養箱中培養22h。

（4）棄去培養液，用棉棒輕輕檫掉transwell多聚碳酸鹽膜上表面的細胞，并用4%的多聚甲醛固定10min。

（5）用刀片取下多聚碳酸鹽膜，并將膜輕輕地放在載玻片上，使用吉姆薩染液染色5min。

（6）超純水清洗多聚碳酸鹽膜，蓋上蓋玻片，避免氣泡產生。采用顯微鏡觀隨機選取4個視野拍照。

（7）采用nis-elementsd軟件統計遷移的u251細胞。以對照組u251細胞的遷移率為100%，計算加藥組u251細胞的遷移率=加藥組u251細胞遷移個數的平均值/對照組u251細胞遷移個數的平均值×100%。

結果如圖3所示：顯著性差異用星號表示（***：p<0.001）。結果表明6.5和13μm的crbgp能夠有效地抑制u251細胞的遷移，抑制率分別為38.46%±1.57%（p<0.001）和59.65%±2.86%（p<0.001）。

6．侵襲實驗

（1）由于matrigel膠在4°c時為液態，溫度升高即變為固態，所以將槍頭、transwell培養板放入-20°c冰箱預冷，將含有15%胎牛血清的dmem培養液放入37°c培養箱預熱。

（2）在transwell上室的聚碳酸鹽膜上加入matrigel膠，操作在冰塊上完成，避免氣泡產生。然后，將transwell培養板放入37°c的co2培養箱中30min，使matrigel膠變為固態。

（3）在transwell培養板的下室加入預熱的培養液和bfgf（終濃度3ng/ml）。

（4）用無血清的dmem培養液將u251細胞制成細胞懸液，并分別與6.5μm和13μm的crbgp混勻為加藥組，對照組加入等體積的pbs，然后分別加入至含有matrigel膠的transwell細胞培養板的上室，于37°c，co2培養箱中培養48h。

（5）棄去培養液，使用棉棒擦掉transwell多聚碳酸鹽膜上matrigel膠和未穿過多聚碳酸鹽膜的細胞，然后將transwell內的多聚碳酸鹽膜用4%的多聚甲醛固定10min。

（6）用刀片取下多聚碳酸鹽膜，將膜輕輕地放在載玻片上，使用吉姆薩染液染色5min。

（7）超純水清洗，蓋上蓋玻片，避免氣泡產生。采用顯微鏡觀隨機選取4個視野拍照。

（8）采用nis-elementsd軟件統計侵襲的u251細胞。以對照組u251細胞的侵襲率為100%，計算加藥組u251細胞的侵襲率=加藥組u251細胞侵襲個數的平均值/對照組u251細胞侵襲個數的平均值×100%。

結果如圖4所示：顯著性差異用星號表示（*：p<0.05；**：p<0.01）。結果表明6.5和13μm的crbgp能夠有效地抑制u251細胞的侵襲，抑制率分別為40.77%±4.35%（p<0.05）和72.48%±0.78%（p<0.01）。

因此，上述結果表明，crbgp能夠有效抑制u251細胞的增殖、粘附、遷移和侵襲過程，且呈劑量依賴性。

序列表

<110>遼寧師范大學

<120>七鰓鰻crbgp在制備抗惡性膠質瘤藥物中的應用

<130>q.gao,y.pang,y.wu,f.ma,q.w.li,[expressedsequencetags

(ests)analysisoftheoralglandoflampetrajaponica],yi

chuanxuebao32(2005)1045-1052.

<160>1

<170>patentinversion3.2

<210>1

<211>207

<212>dna

<213>lampetrajaponica

<220>

<221>exon

<222>(1)..(207)

<400>1