用于修復胰腺組織的胰腺基質水凝膠的制備方法和用途與流程

本發明屬于組織工程與再生醫學技術領域，具體涉及一種具有促再生功能的豬組織來源的用于修復胰腺組織的胰腺基質水凝膠的制備方法和用途。

背景技術：

重癥急性胰腺炎(severeacutepancreatitis，sap)病情兇險、進展快、并發癥多，病死率高達30％。該病是由各種致病因素引起的胰腺腺泡損傷，觸發活性胰酶釋放入血，激活巨噬細胞和中性粒細胞而釋放大量炎性因子，導致全身性炎癥反應與代償性抗炎反應的失衡，其中巨噬細胞浸潤與激活在sap發生、發展和演進過程中扮演著至關重要的角色。業已證實，巨噬細胞具有高度可塑性，可依賴局部微環境刺激產生促炎性巨噬細胞或抗炎性巨噬細胞。目前已有研究采用藥物調控巨噬細胞的功能，然而其治療大多是全身給藥，藥物副作用大，臨床可操作性差。因此，尋找一種安全、有效、簡便的調控巨噬細胞功能策略，恢復受損的胰腺功能，已成為臨床上亟需解決的問題。

生物材料可調控巨噬細胞的命運，研究證實支架材料的特性如形貌、彈性、孔隙度等均可影響巨噬細胞的表型。因此，研發具有促再生功能的材料已成為當今生物材料發展的重要趨勢。在這方面，來源于天然組織/器官的胞外基質(ecm)生物材料，鑒于其具有最接近天然的組織結構、豐富的生物活性成分、組織特異的微環境以及低免疫原性等優點，已成為組織再生領域有應用前景的生物材料。特別是其水凝膠形式，可通過微創注射的方法遞送到組織損傷部位，具有微創、安全、可控性強等優點大大增強了其在臨床上的應用潛力。然而，目前尚無關于胰腺基質水凝膠制備及其用于胰腺再生的報道。

技術實現要素：

本發明的目的在于解決以上現有技術中存在的技術問題的至少一項，本發明提供一種解決現有胰腺組織工程材料在組分、結構和力學彈性方面的不足，提供可適宜胰腺細胞生長的天然微環境，以期達到促進重癥胰腺炎胰腺組織的內源性修復的用于修復胰腺組織的胰腺基質水凝膠的制備方法和用途。

本發明的目的是通過以下技術方案實現的：

豬胰腺基質水凝膠在制備促進胰腺修復的藥物中的用途。

進一步地，豬胰腺基質水凝膠在制備治療壞死性胰腺炎的藥物中的用途。

進一步地，所述藥物為注射劑。

發明人通過將豬的胰腺組織制成豬胰腺基質水凝膠，并將該物質通過注射的方式注入成功造模的實驗用sd大鼠的胰腺位置，24小時后，取材觀察其對胰腺損傷的修復情況表明，胰腺腺泡細胞壞死和炎癥細胞浸潤顯著減少，組織病理學評分也表明，ecm組與sap相比評分明顯降低。從而，證實本發明對于胰腺損傷和胰腺炎癥等病癥具有較好的改善效果。

進一步地，所述注射劑為含有豬脫細胞胰腺組織的鹽酸-胃蛋白酶溶液。

進一步地，每毫升鹽酸-胃蛋白酶溶液中含有豬脫細胞胰腺組織8mg。

進一步地，所述含有豬脫細胞胰腺組織的鹽酸-胃蛋白酶溶液的ph值為7.4。

一種用于修復胰腺組織的胰腺基質水凝膠的制備方法，包括步驟：

b.豬胰腺基質水凝膠的制備：

將脫細胞胰腺組織冷凍干燥后做成粉末，然后按比例與鹽酸-胃蛋白酶溶液混合，調節ph值至生理狀態，即得豬胰腺基質水凝膠。

進一步地，所述的用于修復胰腺組織的胰腺基質水凝膠的制備方法，還包括步驟：

a.胰腺的脫細胞化：

(1)將胰腺組織切成薄片，并用生理鹽水漂洗，得到胰腺組織薄片；

(2)將所述胰腺組織薄片浸于含有十二烷基硫酸鈉的生理鹽水溶液中攪拌，得到胰腺組織；

(3)將所述胰腺組織浸于tritonx-100溶液中攪拌至所述胰腺組織透明后，用生理鹽水漂洗后得到脫細胞胰腺組織。

進一步地，所述步驟b中采用濃度為0.1mol/l氫氧化鈉溶液和10xpbs調節ph值至7.4；所述脫細胞胰腺組織與鹽酸-胃蛋白酶溶液的比例關系為：在調節ph值之前，每毫升鹽酸-胃蛋白酶溶液中含有脫細胞胰腺組織的量為10mg；在調節ph值之后，每毫升鹽酸-胃蛋白酶溶液中含有脫細胞胰腺組織的量為8mg。

進一步地，所述鹽酸-胃蛋白酶溶液中胃蛋白酶的質量占所述鹽酸-胃蛋白酶溶液總重的1％，所述鹽酸-胃蛋白酶溶液中鹽酸的濃度為0.1mol/l；所述含有十二烷基硫酸鈉的生理鹽水溶液中十二烷基硫酸鈉的重量占含有十二烷基硫酸鈉的生理鹽水溶液總重的0.5％；所述tritonx-100溶液中tritonx-100的重量百分數為1％。

本發明相對于現有技術的有益效果是：本發明的胰腺基質水凝膠不但具有溫敏性、低免疫原性及能提供最天然的細胞外微環境等優點，而且操作工藝簡單、實施條件溫和，為胰腺組織工程提供了一種新型水凝膠材料。該材料適宜于胰腺細胞的生長，可調控巨噬細胞向抗炎性m2型極化，進而促進重癥胰腺炎胰腺組織的內源性修復，因此有望發展為一種用于治療重癥急性胰腺炎藥物用途的產品，這對改進重癥急性胰腺炎的臨床治療具有重要意義。

附圖說明

圖1he染色觀察脫細胞化的胰腺組織切片的脫細胞胰腺基質圖像。

圖2免疫熒光染色觀察細胞外i型膠原保留情況圖像。

圖3免疫熒光染色觀察細胞外iv型膠原保留情況圖像。

圖4免疫熒光染色觀察細胞外層粘連蛋白保留情況圖像。

圖5免疫熒光染色觀察細胞外纖連蛋白保留情況圖像。

圖6本發明的豬胰腺基質水凝膠在常溫下的狀態示意圖。

圖7本發明的豬胰腺基質水凝膠在37℃下的狀態示意圖。

圖8he染色觀察本發明的豬胰腺胞外基質(ecm)水凝膠與皮下組織的生物相容性圖像。

圖9用sd大鼠建立sap模型后其胰腺圖像。

圖10掃描電鏡下觀察本發明的豬胰腺基質水凝膠圖像。

圖11sap組胰腺組織he染色圖像。

圖12豬胰腺基質水凝膠注射組胰腺組織he染色圖像。

圖13sap組免疫熒光染色觀察胰腺巨噬細胞m2型(cd68+/cd206+)極化情況圖。

圖14ecm組免疫熒光染色觀察胰腺巨噬細胞m2型(cd68+/cd206+)極化情況圖。

圖15sham組、sap組和ecm組的大鼠胰腺體重比(pancreas/bodyweight)對比示意圖。

圖16sham組、sap組和ecm組的淀粉酶(amylase)對比示意圖。

圖17sham組、sap組和ecm組的脂肪酶(lipase)對比示意圖。

圖18sham組、sap組和ecm組的髓過氧化物酶(myeloperoxidase，mpo)對比示意圖。

其中，上述圖中的sham組，sap組，ecm組分別表示：假手術組、重癥急性胰腺炎組、ecm水凝膠注射組；

其中，圖15-圖18中的*表示p<0.05，#表示p<0.01，p為統計學顯著性指標。

具體實施方式

以下通過附圖結合實施例來描述說明但不限制本發明。以下結合實施例對本發明的技術方案進行詳細的說明，應當說明的是，以下僅是本發明的優選實施方式，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明創造構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些應當都屬于本發明的保護范圍。

0.5％十二烷基硫酸鈉/生理鹽水指的是十二烷基硫酸鈉的重量占含有十二烷基硫酸鈉的生理鹽水溶液總重的0.5％。

豬胰腺基質水凝膠在制備促進胰腺內源性修復的藥物中的用途。

進一步地，豬胰腺基質水凝膠在制備治療壞死性胰腺炎的藥物中的用途。

進一步地，所述藥物為注射劑。

發明人通過將豬的胰腺組織制成豬胰腺基質水凝膠，并將該物質通過注射的方式注入成功造模的實驗用sd大鼠的胰腺位置，24小時后，取材觀察其對胰腺損傷的修復情況表明，胰腺腺泡細胞壞死和炎癥細胞浸潤顯著減少，組織病理學評分也表明，ecm組與sap相比評分明顯降低。從而，證實本發明對于胰腺損傷和胰腺炎癥等病癥具有較好的改善效果。

進一步地，所述注射劑為含有豬脫細胞胰腺組織的鹽酸-胃蛋白酶溶液。

進一步地，每毫升鹽酸-胃蛋白酶溶液中含有豬脫細胞胰腺組織8mg。

進一步地，所述含有豬脫細胞胰腺組織的鹽酸-胃蛋白酶溶液的ph值為7.4。

一種用于修復胰腺組織的胰腺基質水凝膠的制備方法，包括步驟：

b.豬胰腺基質水凝膠的制備：

將脫細胞胰腺組織冷凍干燥后做成粉末，然后按比例與鹽酸-胃蛋白酶溶液混合，調節ph值至生理狀態，即得豬胰腺基質水凝膠。

進一步地，所述的用于修復胰腺組織的胰腺基質水凝膠的制備方法，還包括步驟：

a.胰腺的脫細胞化：

(1)將胰腺組織切成薄片，并用生理鹽水漂洗，得到胰腺組織薄片；

(2)將所述胰腺組織薄片浸于含有十二烷基硫酸鈉的生理鹽水溶液中攪拌，得到胰腺組織；

(3)將所述胰腺組織浸于tritonx-100溶液中攪拌至所述胰腺組織透明后，用生理鹽水漂洗后得到脫細胞胰腺組織。

進一步地，所述步驟b中采用濃度為0.1mol/l氫氧化鈉溶液和10xpbs調節ph值至7.4；所述脫細胞胰腺組織與鹽酸-胃蛋白酶溶液的比例關系為：在調節ph值之前，每毫升鹽酸-胃蛋白酶溶液中含有脫細胞胰腺組織的量為10mg；在調節ph值之后，每毫升鹽酸-胃蛋白酶溶液中含有脫細胞胰腺組織的量為8mg。

進一步地，所述鹽酸-胃蛋白酶溶液中胃蛋白酶的質量占所述鹽酸-胃蛋白酶溶液總重的1％，所述鹽酸-胃蛋白酶溶液中鹽酸的濃度為0.1mol/l；所述含有十二烷基硫酸鈉的生理鹽水溶液中十二烷基硫酸鈉的重量占含有十二烷基硫酸鈉的生理鹽水溶液總重的0.5％；所述tritonx-100溶液中tritonx-100的重量百分數為1％。

實施例1豬胰腺基質水凝膠的制備

具體步驟如下:

(1)豬胰腺的脫細胞化:首先將豬胰腺組織切為約2毫米厚的薄片并用生理鹽水漂洗，然后將其浸沒于0.5％十二烷基硫酸鈉/生理鹽水中，室溫攪拌24小時；最后將其轉移于1％tritonx-100溶液，室溫攪拌直至組織透明，約需1小時，并用生理鹽水漂洗3-5次，每次15分鐘，去除殘余的洗滌劑。

(2)豬胰腺基質水凝膠的制備:將低溫凍干的脫細胞胰腺組織，用粉碎機磨成粉末，然后按照10mg/ml比例加入鹽酸-胃蛋白酶溶液中，室溫緩慢攪拌至溶解狀態，通過加入0.1m氫氧化鈉和10xpbs調至生理狀態(ph＝7.4)，使水凝膠終濃度為8mg/ml，置于37℃下數分鐘即可成膠。

豬胰腺基質水凝膠體內移植治療：使用時，將上述制備的8mg/ml水凝膠懸液注射到sap大鼠胰腺組織內，觀察其對胰腺損傷的修復情況。

實施例2豬胰腺基質水凝膠在制備促進胰腺內源性修復的藥物中的用途

a、豬胰腺基質水凝膠的制備和鑒定

(1)豬胰腺基質水凝膠制備：取豬新鮮胰腺，剪去表面的脂肪組織和外膜，將豬胰腺組織切為約2毫米厚的薄片并用生理鹽水漂洗數次除去血細胞，然后將其浸沒于0.5％十二烷基硫酸鈉/生理鹽水中，室溫攪拌24小時；最后將其轉移于1％tritonx-100溶液，室溫攪拌直至組織透明，約需1小時，并用生理鹽水漂洗3-5次，每次15分鐘，去除殘余的洗滌劑。脫細胞化的胰腺儲存于-80℃。

(2)豬胰腺脫細胞鑒定：將脫細胞化的豬胰腺組織直接用組織包埋劑oct(tissueoct-freezemedium)包埋，做冰凍切片后，一方面用蘇木素和伊紅染色觀察細胞殘留情況，可見沒有細胞核殘留(圖1)；另一方面用免疫熒光染色觀察胞外基質成分保留情況。根據圖2-圖5所示，所制備的豬胰腺脫細胞基質保留了i型膠原、iv型膠原、層粘連蛋白、纖連蛋白等主要細胞外基質成分。

(3)將脫細胞的豬胰腺組織置于低溫凍干機上進行干燥，用粉碎機將其磨成粉末，并在使用前通過暴露于環氧乙烷中16小時進行滅菌。

(4)按照10mg/ml濃度(每毫升鹽酸-胃蛋白酶溶液中含有脫細胞胰腺組織的量為10mg)將上述胰腺脫細胞粉末溶解于鹽酸-胃蛋白酶溶液中，室溫緩慢攪拌至溶解狀態，超速離心除去未消化的大顆粒物，取上清液低溫儲存待用。

(5)通過加入0.1m氫氧化鈉和10xpbs調至生理狀態(ph＝7.4)，使水凝膠終濃度為8mg/ml，置于37℃數分鐘即可成膠，常溫下表現為液態(圖6)，當置于37℃數分鐘即可成膠，如圖7所示，即為所制備的豬胰腺基質水凝膠。如圖10所示，掃描電鏡檢測顯示豬胰腺基質水凝膠呈現為多孔狀結構，不同粗細豬胰腺基質水凝膠纖維呈網狀分布。

b、豬胰腺基質水凝膠生物相容性檢測

通過皮下注射本發明的豬胰腺基質水凝膠(采用現有的商業化的膠原水凝膠作對照)于大鼠腹股溝處，觀察其生物相容性，如圖8所示，he染色結果顯示膠原水凝膠組可見較多的炎性細胞浸潤，本發明的豬胰腺基質水凝膠材料可均勻分布于皮膚組織，沒有明顯的炎性細胞浸潤，這表明本發明的豬胰腺基質水凝膠具有良好的組織相容性。

c、動物的選擇和sap模型制備

本發明選擇sd大鼠作為實驗對象，實驗用sd大鼠(250-300g左右)，用戊巴比妥鈉進行腹腔麻醉后，行開腹術，充分暴露胰腺，使用微量輸液泵以12ml/h速度逆行向胰膽管注入5％牛磺膽酸鈉溶液(0.1ml/100g大鼠體重)，維持10min后關腹。3小時后可以看到腹腔內腹水形成和臟器造化斑形成，sap模型建立前后的sd大鼠胰腺對比圖如圖11和圖12所示，用sd大鼠建立sap模型后其胰腺圖像如圖9所示。

本發明中將sd大鼠分組進行實驗，將sd大鼠分成sham組，sap組和ecm組即假手術組、重癥急性胰腺炎組和ecm水凝膠注射組，分別觀察各個組內sd大鼠的胰腺修復情況。

d、豬胰腺基質水凝膠修復胰腺功能

(1)豬胰腺基質水凝膠移植sap大鼠胰腺:通過胰腺內多點注射于成功造模的sap大鼠，24后取材觀察其對胰腺損傷的修復情況，如圖14-16所示，ecm組與sap組相比，胰腺腺泡細胞壞死和炎癥細胞浸潤顯著減少，組織病理學評分也表明，ecm組與sap相比評分明顯降低。這表面本發明的豬胰腺基質水凝膠對胰腺損傷具有較好的修復能力。

(2)豬胰腺基質水凝膠可調控巨噬細胞m2型極化:通過對比圖13和圖14，通過免疫染色檢測胰腺組織內巨噬細胞表型，結果顯示該水凝膠移植sap模型后，如圖14所示，損傷部位可見大量的m2巨噬細胞(cd68/cd206)出現，這表明本發明的豬胰腺基質水凝膠可通過提供天然胰腺組織微環境進而調控巨噬細胞m2型極化。

(3)豬胰腺基質水凝膠可改善胰腺功能：如圖15-18所示，胰腺基質水凝膠移植后，可見大鼠胰腺體重比降低(圖15)，elisa檢測血清胰酶、脂肪酶和mpo的表達水平，結果顯示與sap組比較，ecm組血清胰酶、脂肪酶和mpo水平顯著降低(圖16-18)，這表明本發明的豬胰腺基質水凝膠降低了胰腺的損傷程度，改善了胰腺功能。從而，本發明的豬胰腺基質水凝膠能夠促進胰腺的修復。

綜上，本發明的豬胰腺基質水凝膠能夠應用在制備促進胰腺內源性修復的藥物中。具體地，本發明的胰腺基質水凝膠能夠應用于治療重癥急性胰腺炎的藥物中。較佳地，所述重癥急性胰腺炎為急性壞死性胰腺炎。所述液態水凝膠為豬胰腺來源的脫細胞化細胞外基質，其中所述水凝膠具有溫敏性，可通過注射的方式輸送到胰腺受損部位，在體溫即可轉變為水凝膠形式，其不但可為受損的胰腺細胞提供接近天然的胰腺組織微環境，而且巨噬細胞也可響應微環境的改變而向抗炎性巨噬細胞極化，因此該水凝膠降低了炎性介質的表達，進而改進了胰腺功能。

根據本說明書的記載即可較好的實現本發明的技術方案。