利用石墨烯量子點進行腫瘤檢測的方法與流程

本發明涉及一種利用石墨烯量子點進行腫瘤檢測的方法，特別是一種基于基于腫瘤內間質流體壓力響應的利用石墨烯量子點進行腫瘤檢查的方法。

背景技術：

近年來，在生物學及醫學領域，許多研究者致力于研究高性能、具有生物響應特性的材料來響應并放大腫瘤區域病變信號，從而區分腫瘤組織和正常組織。這在腫瘤診斷和治療方面正引起科學界廣泛關注，但仍存在極大的挑戰。

相異于正常組織，腫瘤內微環境存在著特異性信號：腫瘤組織血管生長異常，結構錯雜、腫瘤組織內間質流體壓力(ifp)較高、缺氧環境、酸性ph環境、存在癌細胞特異性生物標記物等。利用這一系列特性，可區分正常組織及腫瘤組織。目前，文獻曾報道，利用癌細胞特異性標記物如egfr，her2/neu等，設計熒光染料抗體進行標記檢測，但這類標記物及其表達水平與具體腫瘤種類有密切關系，無法廣泛應用于大范圍普遍的腫瘤檢測。也有研究利用腫瘤微環境中血管形成異常及酸性環境，設計具有ph響應的材料進行腫瘤檢測，但材料制備非常復雜。利用腫瘤組織特異性信號檢測腫瘤靈敏度高、實用性強，但目前腫瘤類型的局限性、缺少新型材料的制備、背景干擾等方面還存在許多問題需要解決。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種具有流體壓力響應以及腫瘤細胞核靶向的石墨烯量子點生物熒光探針進行腫瘤檢測的新方法?

為達到上述目的,克服這些問題，我們利用腫瘤內ifp效應來檢測區分腫瘤及正常組織，因腫瘤內ifp較高，是實體瘤內普遍存在的性質，適用性廣泛，可用于普遍的腫瘤檢測。根據這一特性，我們設計合成了一種具有ifp響應的石墨烯量子點(gqds)，制備方法詳見專利：(磺酸基石墨烯量子點生物熒光探針及其應用)（201510394852.8）。在正常組織，正常壓力下無法穿透細胞；而在腫瘤組織內，ifp較高時，具有ifp響應的gqds容易透過細胞膜，靶向標記腫瘤細胞核。經我們驗證，在多種腫瘤組織內皆有此現象，并且這種材料具有低毒、量子產率高、高熒光強度的優點，并且可高效快速靶向腫瘤細胞核(0.5h)，非常適用于對腫瘤細胞的檢測。

根據上述機理，本發明采用如下技術方案：

一種利用石墨烯量子點進行腫瘤檢測的方法，其特征在于具有以下的過程和步驟：建立動物腫瘤模型，每隔一天將石墨烯量子點gqds按(30～200mg/kg靜脈注射入動物模型，0.5h后，檢測腫瘤內壓力，并切片觀察gqds在腫瘤組織內分布，在2-7mmhg腫瘤內壓條件下，gqds無法靶向腫瘤組織，無法標記細胞核；>11mmhg，gqds可以特異靶向腫瘤組織，并高效標記腫瘤組織細胞核。

腫瘤壓力響應，藥物降壓后，無法標記腫瘤細胞核

當用藥物降低腫瘤組織內ifp后，gqds在腫瘤組織內分布無腫瘤靶向，并且不能標記細胞核，說明此量子點靶向腫瘤組織細胞核的性能與ifp有密切聯系，具有良好的腫瘤ifp響應性能，可以應用于腫瘤組織細胞核標記診斷檢測。降低內壓的具體方法如下：煙酰酸和伊馬替尼溶于生理鹽水中，煙酰酸通過腹腔注射(500mg/kg,0.01ml/g，注射后1h檢測)；伊馬替尼通過灌胃注射(50mg/kg,每日給藥，四天后檢測)。利用“針芯”技術來檢測腫瘤內ifp值。將標準23號注射針填充尼龍線和生理鹽水(其中添加50ie/ml肝素)，將其插入腫瘤組織中心，注射器連接至壓力傳感器。此裝置可以連續而穩定地檢測流體壓力。檢測過程中，通過壓縮和解壓縮方式確定針頭與傳感器之間流體的連通性。腫瘤ifp值取兩次讀數平均值，肌肉或皮下組織內ifp值作為空白，此方法處理后，腫瘤ifp值下降40%以上。

利用壓力響應的gqds(30-200mg/kg)靜脈注射進入動物模型，0.5h后，gqds特異靶向腫瘤組織，并高效標記腫瘤組織細胞核，我們利用兩種可降低腫瘤組織內ifp的藥物煙酰酸以及伊馬替尼，使腫瘤組織內ifp分別降低了60%以及40%后(相比于空白)，也發現gqds無法靶向小鼠腫瘤組織，無法標記細胞核。gqds在小鼠腫瘤組織內分布比較分散，在組織間質內分散。印證了此量子點靶向腫瘤組織細胞核的性能與腫瘤ifp敏感性。

體內，體外均無毒，并且可以快速，完全代謝

gqds體內體外毒性均很低，靜脈注射0.5h后，立即特異靶向腫瘤組織，并高效標記腫瘤組織細胞核，24h后大部分從體內代謝出來，在體內低毒。gqds大量聚集在腫瘤組織細胞內，只有少量存在于正常組織間質內，并不進入正常組織細胞核。

本發明方法的優點和特點如下所述:

(1)石墨烯量子點對腫瘤細胞核特異性靶向。進行標記識別的方法簡單，低毒，高熒光強度，不需要對材料進行二次修飾?

(2)石墨烯量子點對腫瘤細胞核靶向特性具有良好的腫瘤ifp響應效應?

(3)在體內可以直接標記腫瘤細胞的細胞核，靶向效率高，應用范圍廣。

附圖說明

圖1石墨烯量子點(gqds)體內高效靶向腫瘤組織細胞核的壓力敏感響應。其中a:ifp隨皮下腫瘤體積增長的變化趨勢。b:不同ifp條件下，gqds在腫瘤組織內分布變化。綠色：gqds；紅色：syto-17紅色細胞核染料。標尺：10μm。

圖2經過煙酰酸改變腫瘤ifp后，gqds在小鼠乳腺癌組織內分布情況變化。a：經過煙酰酸降壓藥物處理后，小鼠乳腺癌組織內間質流體壓力(ifp)變化情況。b,c：ifp改變后，60mg/kggqds在體內腫瘤組織內分布情況變化。b：空白，c：煙酰酸藥物處理。綠色：gqds；紅色：syto-17紅色細胞核染料。標尺：10μm。

圖3經過伊馬替尼改變腫瘤ifp后，gqds在小鼠乳腺癌組織內分布情況變化。a：經過伊馬替尼降壓藥物處理后，小鼠乳腺癌組織內ifp變化情況。b,c：ifp改變后，60mg/kggqds在體內腫瘤組織內分布情況變化。b：空白，c：伊馬替尼藥物處理。綠色：gqds；紅色：syto-17紅色細胞核染料。標尺：10μm。

圖4gqds在體內體外毒性情況。a：小鼠乳腺癌細胞與不同濃度gqds共孵育12和24h后細胞活力檢測。b：gqds體內分布情況。60mg/kggqds靜脈注射入動物模型，0.5-24h后，在臟器內分布情況。c：gqds體內血生化毒性檢測。60mg/kggqds靜脈注射進入動物模型，0.5，24和96小時，檢測血生化指標。腎功能指標：血尿素氮(bun)和肌酐(crea)；肝指標：丙氨酸氨基轉移酶(alt)、谷草轉氨酶(ast)、堿性磷酸酶(alp)、總膽紅素(tbil)。

具體實施方式

現將本發明的具體實施例敘述于后?

實施例1:

gqds對腫瘤內壓力響應能力：

壓力響應gqds對腫瘤特異性靶向能力的實驗，通過皮下移植法，在小鼠右后肢接種乳腺癌腫瘤，建立動物腫瘤模型。每隔一天將gqds(30-200mg/kg)靜脈注射入動物模型，0.5h后，檢測腫瘤內壓力，并切片觀察gqds在腫瘤組織內分布。利用“針芯”技術來檢測腫瘤內ifp值。將標準23號注射針填充尼龍線和生理鹽水(其中添加50ie/ml肝素)，將其插入腫瘤組織中心，注射器連接至壓力傳感器。此裝置可以連續而穩定地檢測流體壓力。檢測過程中，通過壓縮和解壓縮方式確定針頭與傳感器之間流體的連通性。腫瘤ifp值取兩次讀數平均值，肌肉或皮下組織內ifp值作為空白。為研究低ifp是否會阻礙gqds對腫瘤細胞核靶向性，60mg/kggqds注射入動物模型0.5h后，將腫瘤組織取出后，組織樣品制成20μm厚的冷凍切片樣品，用于進行激光共聚焦顯微鏡觀察gqds在腫瘤組織內分布情況。發現ifp小于等于7mmhg腫瘤內壓條件下，gqds在腫瘤組織內分布比較分散，在組織間質內分散，無法靶向腫瘤組織，無法標記細胞核。當ifp大于等于11mmhg時，gqds可以特異靶向腫瘤組織，并高效標記腫瘤組織細胞核。說明此量子點靶向腫瘤組織細胞核的性能與腫瘤ifp有密切聯系，具有良好的腫瘤ifp響應性能，可以應用于腫瘤組織診斷檢測。具體結果參見圖1。

實施例2:

gqds腫瘤壓力響應敏感，藥物降壓后，無法標記腫瘤細胞核：

煙酰酸溶于生理鹽水中，煙酰酸通過腹腔注射(500mg/kg,0.01ml/g，注射后1h檢測)；此方法處理后，ifp下降了60%。伊馬替尼溶于生理鹽水中，伊馬替尼通過灌胃注射(50mg/kg,每日給藥，四天后檢測)。利用上述“針芯”技術來檢測腫瘤內ifp值。腫瘤ifp值取兩次讀數平均值，肌肉或皮下組織內ifp值作為空白，此方法處理中腫瘤ifp值下降了40%。隨后60mg/kggqds注射入動物模型0.5h后，將腫瘤組織取出，制成20μm厚的冷凍切片樣品，用于進行激光共聚焦顯微鏡觀察gqds在腫瘤組織內分布情況，發現gqds在未處理的腫瘤組織內，ifp大于11mmhg,gqds可以特異性靶向腫瘤細胞核?而通過煙酰酸和伊馬替尼處理后的小鼠腫瘤組織內，ifp小于7mmhg，無細胞核靶向性能。說明此量子點靶向腫瘤組織細胞核的性能與腫瘤ifp有密切聯系。具體結果參見圖2，3。

實施例3:

gqds體內，體外均無毒，并且可以快速，完全代謝：

在壓力敏感響應腫瘤細胞核體內靶向標記的過程中，gqds均不產生毒性，能夠快速代謝出細胞和組織。尾靜脈注射0.5h后，體內立即特異靶向腫瘤組織，并高效標記腫瘤組織細胞核，24h后大部分從體內代謝出來，在體內低毒。gqds大量聚集在腫瘤組織細胞內，只有少量存在于正常組織間質內，并不進入正常組織細胞核。此方法無腫瘤特異性，具有普適性和應用性。