本發明涉及一種聚吡咯生物導電水凝膠及其制備方法和應用，屬于生物醫學材料領域。
背景技術：
周圍神經損傷在臨床上十分常見，迄今為止，經歷了神經吻合、自體神經移植、同種異體神經移植、自體非神經組織移植和生物材料替代等幾個過程，但幾種治療方式各有利弊，未使神經缺損的問題得到根本性的解決。通過研究表明，神經生長因子(ngf)具有神經營養及神經保護作用，能促進神經損傷的修復，誘導神經纖維定向生長，刺激胞體和樹突的發育，促進神經元的分化發育。同時大量實驗證實，一定條件內的電刺激對周圍神經再生與神經細胞生長，不論是局部還是全身應用，或電場類型、脈沖頻率、波長以及時間長短,，均具有促進的作用。
在以往，神經營養物質如神經生長因子(ngf)通過注射作用于神經損傷部位，但其中大多數生物半衰期短，容易遭受破壞失去生活活性，且在直接注入后無法解決突釋的問題，無法達到長時間修復神經損傷的作用。因此找到一種合適的藥物載體，既可以對藥物的釋放進行一定控制，且兼具導電特性能輔助進行電刺激修復，能促進神經細胞的增殖分化，將為修復神經損傷提供很好的研究方向與幫助。
水凝膠是一種由親水性聚合物所形成的不溶于水的高度交聯系統，由于其具有含水量高，與人體組織力學性能相似等特點，使得水凝膠材料廣泛應用在藥物控釋及活性細胞包覆等生物醫用領域。合成水凝膠的材料主要包括天然高分子材料如絲素蛋白、殼聚糖、透明質酸、明膠等，以及人工合成可降解材料如聚乳酸、聚乙醇酸、聚己內酯等。這些材料在一定程度上能起到促進周圍神經再生的效果，所以充分利用天然材料的生物活性基元及便于大批量生產及成本低等特點，可制備出內部結構多孔，生物相容性優良的水凝膠。
水凝膠與導電聚合物(cps)組成的復合材料被稱為導電水凝膠，它是理想的生物醫用材料，可應用于組織工程中修復受損的組織和器官、電化學生物傳感器以及可控制藥物釋放體系。導電水凝膠結合了cps的電性能與水凝膠的機械性能，使其成為可控制藥物釋放領域的新型熱點材料。該體系可以達到較高的載藥量水平，而且可以解決單純cps對中性藥物加載不理想以及大體積藥物無法從cps體系中釋放等問題。
殼聚糖(cs)是一種多糖類天然高分子，具有優良的生物相容性、可降解性、低毒及較好的生物活性和力學性能等。研究表明，一些組織細胞易黏附于殼聚糖表面并促進其增殖，還具有藥物活性，而且能夠能促進傷口愈合及軟、硬組織的重建等生物活性。其含有豐富的氨基和羥基，在堿性條件下，與氯乙酸反應脫氯化氫可以得到羧甲基化的殼聚糖(cmcs)。通過化學交聯羧甲基殼聚糖，可以制備材料所需的水凝膠。
吡咯單體是一種c，n五元雜環分子，微溶于水，無毒，在電場或氧化劑的作用下易被氧化，進而發生聚合反應生成高分子聚合物聚吡咯。聚吡咯除了具有導電聚合物共同的特征以外，還具有單體無毒，容易制備，電導率高，機械性能好穩定等優點。通過電化學方法或其他手段把藥物分子或離子加入到聚合物中，可組成修飾電極或復合材料，將包含的藥物分子或離子釋放出去，可以實現藥物在體內的控制釋放。這種方法可以更好的提高藥物的藥效，還可以實現更為智能化的功能,即通過神經細胞發出的電信號來實現病人自主的釋放過程。對于這種體系的要求是藥物載體結合牢固，對體液穩定，藥物負載量大,，釋放率高，載體無毒，無排異反應。而聚吡咯復合材料恰恰滿足這些要求，可以作為一種優良的藥物釋放載體。
技術實現要素：
本發明所要解決的技術問題是提供一種聚吡咯生物導電水凝膠及其制備與應用，其適于周圍神經損傷，具有電刺激修復以及神經營養因子誘導的雙重功效系統。該導電水凝膠生物相容性好，對于ngf具有高載藥率，能對藥物的釋放起到緩釋作用，且通過外加電刺激或生物電刺激能輔助治療，可以為神經修復與神經細胞的再生提供更優越的藥物載體與細胞依附組織。
本發明解決上述技術問題所采用的技術方案是：聚吡咯生物導電水凝膠，其組分包括有羧甲基殼聚糖、交聯劑、吡咯單體、摻雜劑、神經生長因子和去離子水，其用量配比為羧甲基殼聚糖：交聯劑：吡咯單體：摻雜劑：神經生長因子：去離子水＝1：0.08-0.16：0.06-0.12：0.09-0.18：0.08-0.16：150-200，以重量比計。
聚吡咯生物導電水凝膠的制備方法，包括以下步驟：將羧甲基殼聚糖通過交聯劑在一定條件下制備羧甲基殼聚糖水凝膠，凍干處理；與此同時將吡咯單體電化學合成聚吡咯并加入摻雜劑進行改性，將改性的聚吡咯進行球磨粉碎得到改性的聚吡咯顆粒，使其顆粒尺寸與羧甲基殼聚糖水凝膠孔隙的孔徑相匹配；隨后將神經生長因子融入水中，加入改性的聚吡咯顆粒，攪拌分散均勻，放入羧甲基殼聚糖水凝膠，使溶液完全吸收，再加入水，震蕩，充分溶脹平衡，即得到聚吡咯生物導電水凝膠。
按上述方案，所述的羧甲基殼聚糖水凝膠的制備方法是：將交聯劑1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(edc)和n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)加入到二甲基亞砜(dmso)中，攪拌溶解，再將其加入到羧甲基殼聚糖的水溶液中，進行反應，即得羧甲基殼聚糖水凝膠。
按上述方案，所述的改性的聚吡咯的制備方法是：將摻雜劑對甲基苯磺酸鈉加入去離子水中，溶解后，再加入吡咯單體，震蕩分散均勻，配置成為電解液，運用循環伏安法電化學合成得到改性的聚吡咯。
按上述方案，所述的聚吡咯生物導電水凝膠的基質組分含量為：神經生長因子6％-10％，改性的聚吡咯顆粒12％-18％，羧甲基殼聚糖水凝膠凍干物74％-80％，以重量比計；聚吡咯生物導電水凝膠的基質與去離子水的用量比為1：80-120。
按上述方案，所述的粉碎后的改性的聚吡咯顆粒的粒徑為50-80μm，制得的羧甲基殼聚糖水凝膠孔隙的孔徑為80-200μm。
所述的聚吡咯生物導電水凝膠作為注射的藥物載體的應用，可以注射進神經導管內。
本發明以具有優良機械性能與生物相容性的水凝膠為基底，摻雜具有高電導率的改性聚吡咯顆粒，并包埋神經營養因子類型的模型藥物，制備得到生物導電水凝膠。在用于神經修復時，既能完成對神經營養因子的緩釋，且能經由生物電或外加電刺激對神經細胞進行一定的電刺激，通過電刺激與神經營養因子誘導的雙重作用，促進神經細胞增殖分化，引導神經軸突生長，使能在修復神經損傷時取得更好的效果。
本發明的優點：
(1)制備的生物導電水凝膠系統穩定，且有良好的生物相容性
本發明制備的水凝膠與聚吡咯的復合材料穩定性好，無生物毒性，且結構具有仿生性，不會產生排異反應且能為細胞生長提供優良的細胞外基質環境。
(2)摻雜的聚吡咯顆粒尺寸可調節，解決聚吡咯在體內不可降解的問題
以往通過電化學合成聚吡咯通常是為了得到高電導率的聚吡咯導電薄膜，本發明將電化學合成的聚吡咯通過細胞粉碎儀進行粉碎處理，得到均勻分散的，顆粒大小可調節的聚吡咯導電顆粒。在生物導電水凝膠分解后可隨人體體液循環排出；
(3)制備的生物導電水凝膠對模型藥物如ngf有高載藥率且具有緩釋作用
本發明的水凝膠結構多孔，且孔徑可調節。同樣的，摻雜的聚吡咯顆粒尺寸也可進行調節，可將二者進行同步調整，來滿足裝載不同模型藥物，提高載藥率，對藥物進行緩釋；
(4)電刺激與神經營養因子誘導的雙重作用，提高了對于修復神經損傷和促進神經細胞生長的功效。
附圖說明
圖1為聚吡咯生物導電水凝膠的掃描電鏡結構圖，其中圖1(a)為改性聚吡咯顆粒、圖1(b)為羧甲基殼聚糖水凝膠、圖1(c)為聚吡咯生物導電水凝膠。
具體實施方式
為了更好地理解本發明，下面結合實施例進一步闡明本發明的內容，但本發明的內容不僅僅局限于下面的實施例。
實施例1
1)高分子水凝膠的制備
采用均相edc/nhs催化體系，交聯羧甲基殼聚糖制備水凝膠。在250ml三口燒瓶中加入0.1gcmcs，再加入30ml去離子水，磁力攪拌30～60min，溶解。將0.01gedc和0.006gnhs加入到40ml二甲基亞砜(dmso)中，磁力攪拌溶解。將dmso溶液轉移到滴液漏斗中，逐滴加入到羧甲基殼聚糖水溶液中，反應溫度25℃，反應時間15h。羧甲基殼聚糖的交聯過程反應方程式是：
產物透析48h，冷凍干燥24h，得到羧甲基殼聚糖水凝膠凍干物；通過圖1(b)羧甲基殼聚糖水凝膠的電鏡圖測得水凝膠的孔隙孔徑為80-200μm。
2)聚吡咯的制備
采用三電極系統，ito導電玻璃作為工作電極，鉑絲作為輔助電極，飽和甘汞電極作為參比電極，以電化學工作站作為電源。電解液由對甲基苯磺酸鈉與水配成，配制稱取1g對甲基苯磺酸鈉加入100ml去離子水，攪拌溶解10min。再向溶液中加入0.5ml吡咯單體，繼續攪拌至分散均勻。將工作電極插入配置的電解液中，采用循環伏安法制備。起始電壓為0v，掃描區間設定為0-2.5v，加壓速率為0.01v/s，掃描周期為100周。
聚吡咯的摻雜和脫摻雜的過程如下反應式所示：
掃描完成后，將工作電極上生成的聚吡咯剝離，多次洗滌后烘干，將聚吡咯放入行星式球磨儀進行研磨，轉速為360r/min，時間為4min，得到尺寸均勻的改性的聚吡咯顆粒，通過圖1(a)改性聚吡咯顆粒的電鏡圖測得顆粒尺寸為50-80μm；
3)聚吡咯生物導電水凝膠的制備
將0.005gngf溶于10ml水中，待完全溶解后，加入0.01g改性的聚吡咯顆粒，超聲震蕩至完全分散，放入0.05g水凝膠凍干物，使溶液完全吸收，再加入10ml水，震蕩，使充分溶脹平衡，得到聚吡咯生物導電水凝膠。通過圖1(c)聚吡咯生物導電水凝膠的電鏡圖我們觀察到最終產物的結構多孔且層次分明，尺寸均勻的改性聚吡咯顆粒摻雜進結構特征明顯的水凝膠中，為細胞吸附生長創造了良好的模擬環境并使載體附帶了適度的電導特性。
制得的聚吡咯生物導電水凝膠的電導率為：
實施例2
1)高分子水凝膠的制備
以羧甲基殼聚糖(cmcs)為例。采用均相edc/nhs催化體系，交聯羧甲基殼聚糖制備水凝膠。在250ml三口燒瓶中加入0.2gcmcs，再加入30ml去離子水，磁力攪拌30～60min，溶解。將0.02gedc和0.012gnhs加入到60ml二甲基亞砜(dmso)中，磁力攪拌溶解。將dmso溶液轉移到滴液漏斗中，逐滴加入到羧甲基殼聚糖水溶液中，反應溫度25℃，反應時間15h。產物透析48h，冷凍干燥24h，得到水凝膠凍干物；
2)聚吡咯的制備
采用三電極系統，ito導電玻璃作為工作電極，鉑絲作為輔助電極，飽和甘汞電極作為參比電極，以電化學工作站作為電源。電解液由對甲基苯磺酸鈉與水配成，配制稱取2g對甲基苯磺酸鈉加入100ml去離子水，攪拌溶解10min。再向溶液中加入1ml吡咯單體，繼續攪拌至分散均勻。將工作電極插入配置的電解液中，采用循環伏安法制備。起始電壓為0v，掃描區間設定為0-2.5v，加壓速率為0.01v/s，掃描周期為100周。掃描完成后，將工作電極上生成的聚吡咯剝離，多次洗滌后烘干，將聚吡咯放入行星式球磨儀進行研磨，轉速為360r/min，時間為5min，得到尺寸均勻的改性的聚吡咯顆粒。
3)聚吡咯生物導電水凝膠的制備
將0.01gngf溶于20ml水中，待完全溶解后，加入0.02g的聚吡咯顆粒，超聲震蕩至完全分散，放入0.1g水凝膠凍干物，使溶液完全吸收。再加入20ml水，震蕩，使充分溶脹平衡，得到聚吡咯生物導電水凝膠。
實施例3
1)高分子水凝膠的制備
以羧甲基殼聚糖(cmcs)為例。采用均相edc/nhs催化體系，交聯羧甲基殼聚糖制備水凝膠。在250ml三口燒瓶中加入0.3gcmcs，再加入50ml去離子水，磁力攪拌30～60min，溶解。將0.03gedc和0.018mgnhs加入到60ml二甲基亞砜(dmso)中，磁力攪拌溶解。將dmso溶液轉移到滴液漏斗中，逐滴加入到羧甲基殼聚糖水溶液中，反應溫度25℃，反應時間15h。產物透析48h，冷凍干燥24h，得到水凝膠凍干物；
2)聚吡咯的制備
采用三電極系統，ito導電玻璃作為工作電極，鉑絲作為輔助電極，飽和甘汞電極作為參比電極，以電化學工作站作為電源。電解液由對甲基苯磺酸鈉與水配成，配制稱取3g對甲基苯磺酸鈉加入100ml去離子水，攪拌溶解10min。再向溶液中加入1.5ml吡咯單體，繼續攪拌至分散均勻。將工作電極插入配置的電解液中，采用循環伏安法制備。起始電壓為0v，掃描區間設定為0-2.5v，加壓速率為0.01v/s，掃描周期為100周。掃描完成后，將工作電極上生成的聚吡咯剝離，多次洗滌后烘干，將聚吡咯放入行星式球磨儀進行研磨，轉速為360r/min，時間為6min，得到尺寸均勻的聚吡咯顆粒。
3)聚吡咯生物導電水凝膠的制備
將0.015gngf溶于20ml水中，待完全溶解后，加入0.03g的聚吡咯顆粒，超聲震蕩至完全分散，放入0.15g水凝膠凍干物，使溶液完全吸收。再加入30ml水，震蕩，使充分溶脹平衡，得到聚吡咯生物導電水凝膠。
實施例4
1)高分子水凝膠的制備
以羧甲基殼聚糖(cmcs)為例。采用均相edc/nhs催化體系，交聯羧甲基殼聚糖制備水凝膠。在250ml三口燒瓶中加入0.6gcmcs，再加入100ml去離子水，磁力攪拌30～60min，溶解。將0.06gedc和0.036gnhs加入到80ml二甲基亞砜(dmso)中，磁力攪拌溶解。將dmso溶液轉移到滴液漏斗中，逐滴加入到羧甲基殼聚糖水溶液中，反應溫度25℃，反應時間15h。產物透析48h，冷凍干燥24h，得到水凝膠凍干物；
2)聚吡咯的制備
采用三電極系統，ito導電玻璃作為工作電極，鉑絲作為輔助電極，飽和甘汞電極作為參比電極，以電化學工作站作為電源。電解液由對甲基苯磺酸鈉與水配成，配制稱取6g對甲基苯磺酸鈉加入100ml去離子水，攪拌溶解10min。再向溶液中加入3ml吡咯單體，繼續攪拌至分散均勻。將工作電極插入配置的電解液中，采用循環伏安法制備。起始電壓為0v，掃描區間設定為0-2.5v，加壓速率為0.05v/s，掃描周期為100周。掃描完成后，將工作電極上生成的聚吡咯剝離，多次洗滌后烘干，將聚吡咯放入行星式球磨儀進行研磨，轉速為360r/min，時間為7min，得到尺寸均勻的聚吡咯顆粒。
3)聚吡咯生物導電水凝膠的制備
將0.03gngf溶于40ml水中，待完全溶解后，加入0.06g的聚吡咯顆粒，超聲震蕩至完全分散，放入0.3g水凝膠凍干物，使溶液完全吸收。再加入60ml水，震蕩，使充分溶脹平衡，得到聚吡咯生物導電水凝膠。
實施例5
1)高分子水凝膠的制備
以羧甲基殼聚糖(cmcs)為例。采用均相edc/nhs催化體系，交聯羧甲基殼聚糖制備水凝膠。在250ml三口燒瓶中加入1gcmcs，再加入120ml去離子水，磁力攪拌30～60min，溶解。將0.1gedc和0.06gnhs加入到100ml二甲基亞砜(dmso)中，磁力攪拌溶解。將dmso溶液轉移到滴液漏斗中，逐滴加入到羧甲基殼聚糖水溶液中，反應溫度25℃，反應時間15h。產物透析48h，冷凍干燥24h，得到水凝膠凍干物；
2)聚吡咯的制備
采用三電極系統，ito導電玻璃作為工作電極，鉑絲作為輔助電極，飽和甘汞電極作為參比電極，以電化學工作站作為電源。電解液由對甲基苯磺酸鈉與水配成，配制稱取10g對甲基苯磺酸鈉加入100ml去離子水，攪拌溶解10min。再向溶液中加入2ml吡咯單體，繼續攪拌至分散均勻。將工作電極插入配置的電解液中，采用循環伏安法制備。起始電壓為0v，掃描區間設定為0-2.5v，加壓速率為0.1v/s，掃描周期為100周。掃描完成后，將工作電極上生成的聚吡咯剝離，多次洗滌后烘干，將聚吡咯放入行星式球磨儀進行研磨，轉速為360r/min，時間為8min，得到尺寸均勻的聚吡咯顆粒。
3)聚吡咯生物導電水凝膠的制備
將0.05gngf溶于50ml水中，待完全溶解后，加入0.1g的聚吡咯顆粒，超聲震蕩至完全分散，放入0.5g水凝膠凍干物，使溶液完全吸收。再加入100ml水，震蕩，使充分溶脹平衡；或先將0.5g聚吡咯顆粒反散投入含有1gcmcs的120ml去離子水溶液中，磁力攪拌60min，再加入含有0.1gedc和0.06gnhs的100ml二甲基亞砜(dmso)進行交聯反應，時間24h，產物進行凍干處理后，將0.6g的凍干產物加入含有0.05gngf的50ml水中，待溶液完全吸收，再加入60ml水，震蕩，使充分溶脹平衡，得到聚吡咯生物導電水凝膠。