本發明涉及一種納米羥基磷灰石-聚乙烯醇多孔支架的制備方法，屬于醫用納米材料制備技術領域。
背景技術：
組織工程支架材料是指能與組織活體細胞結合并能植入生物體內的材料，它是工程化組織的最基本構架。細胞支架不僅為特定細胞提供結構支撐作用，而且還起到模版作用，引導組織再生和控制組織結構。因此，在組織工程中，除了考慮材料的化學性質、表面性能外，還應考慮三維多孔細胞支架的結構，如孔隙形態、大小、連通性、孔隙率等，以利于細胞的黏附、滲透和營養物質的傳送及代謝產物的交換。
聚乙烯醇（pva）由于具有韌性好、無毒、生物相容性好以及易于加工等特點，在骨、軟骨、人造皮膚、人工角膜、義眼臺等方面有廣泛的應用，為了增加其生物活性，往往在人工角膜、骨等生物材料中添加羥基磷灰石。要使組織長入材料內部，需要對其制孔，常用的方法是溶劑澆鑄/粒子瀝濾法，首先用有機溶劑溶解聚乙烯醇，加入致孔劑氯化鈉、酒石酸鈉和檸檬酸鈉等水溶性無機鹽或糖粒子并混合均勻，成型后，用水去除致孔劑而得到pva多孔結構。但此種方法存在孔隙間的相互連通程度不高，并且連通大小和形態不規則、不可控制，而且殘余的有機溶劑還可能影響細胞的生長。
技術實現要素：
本發明主要解決的技術問題是：針對傳統聚乙烯醇多孔支架材料在制備過程中采用水溶性無機鹽或糖粒子為致孔劑，所得多孔支架孔隙率低，且孔隙間相互連通程度不高的問題，提供了一種納米羥基磷灰石-聚乙烯醇多孔支架的制備方法。
為了解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案是：
（1）將聚乙烯醇、谷朊粉和水攪拌溶脹，再加熱攪拌溶解，得預制混合液，再將預制混合液、納米羥基磷灰石、表面活性劑op-10和無水乙醇高速攪拌混合后，注入模具，經冷凍解凍循環后，脫模，得預制支架材料；
（2）將變質后的牛奶涂布于自制固體培養基表面，進行微生物培養，經去離子水淋洗得菌絲懸浮液，再將預制支架材料浸沒于菌絲懸浮液中，經超聲處理后恒溫靜置，再經清洗、滅菌和干燥，即得納米羥基磷灰石-聚乙烯醇多孔支架。
本發明的有益效果是：
（1）本發明利用含高蛋白的谷朊粉良好的延展性，提高支架材料在乳化發泡過程中的彈性和韌性，避免乳化過程中微泡破裂，經固化交聯后，采用變質牛奶培養微生物，針對性消耗谷朊粉中蛋白質，使谷朊粉分解去除，從而使支架內部孔隙打通，使多孔支架的孔隙率和連通率得到有效提高，應用于人體皮膚及骨組織支架材料時，有利于營養物質運輸和細胞代謝廢物及時排出，相比于傳統支架材料，更有利于細胞組織的生長，患者在治療過程中，炎癥反應逐漸減輕，傷口愈合速度加快，傷口愈合時間較使用傳統支架材料而言，縮短10～15%；
（2）本發明利用冷凍解凍循環，在冷凍過程中，內部水分形成細小冰晶，體積膨脹，使孔隙擴大打通，解凍后，水分進一步滲透，經冷凍解凍循環，使孔隙進一步打通，且解凍過程為自然解凍，反應調節溫和，使支架材料內部孔隙得到有效保護。
具體實施方式
本發明所需要的原料有：聚乙烯醇、谷朊粉、去離子水、納米羥基磷灰石、表面活性劑op-10、無水乙醇、牛奶、瓊脂、蔗糖、葡萄糖、氯化鎂、磷酸二氫鉀、、牛肉膏、蛋白胨。
依次稱取20～35g聚乙烯醇，2.6～2.8g谷朊粉，倒入盛有200～300ml溫度為20～25℃去離子水的燒杯中，用玻璃棒攪拌混合10～15min后，靜置2～4h，在靜置過程中，使聚乙烯醇和谷朊粉充分吸水溶脹，再將燒杯移入數顯測速恒溫磁力攪拌器，于溫度為85～90℃，轉速為300～500r/min條件下，恒溫攪拌2～4h，通過加熱使聚乙烯醇和谷朊粉溶解，得預制混合液；依次取100～150ml預制混合液，6～8g納米羥基磷灰石，3～5g表面活性劑op-10，6～8ml無水乙醇，倒入帶攪拌器的三口燒瓶中，以800～1000r/min轉速高速攪拌混合20～30min，在高速攪拌下乳化發泡，利用谷朊粉提高發泡成膜的彈性和韌性，避免乳液中微泡破裂，再將三口燒瓶中物料迅速轉入模具中，并將模具移入冰箱中，于溫度為-18～-20℃條件下冷凍6～8h，再將冷凍后的模具取出，于室溫條件下自然解凍4～6h，如此冷凍、解凍循環3～5次，利用冷凍解凍循環過程中，聚乙烯醇交聯固化，得益于納米羥基磷灰石和谷朊粉配合形成的支架結構，脫模，得預制支架材料；量取60～80ml牛奶，倒入燒杯中，再將燒杯置于避光通風處，靜置直至牛奶變質，再取4～6ml變質牛奶，并均勻涂布于自制固體培養基表面，再將固體培養基轉入恒溫培養箱中，于溫度為35～37℃條件下，恒溫培養3～5天，并用300～500ml去離子水淋洗培養基表面，利用變質牛奶培養微生物，得菌絲懸浮液；所述的自制固體培養基是由30～50g瓊脂，4～5g蔗糖，2～4g葡萄糖，0.1～0.3g氯化鎂，0.6～0.8g磷酸二氫鉀，4～6g牛肉膏，3～5g蛋白胨與400～500ml去離子水混合而成；將預制支架材料移入燒杯中，再向燒杯中加入所得菌絲懸浮液，直至將燒杯中預制支架材料完全淹沒，并將燒杯移入超聲振蕩儀，以40～42khz頻率超聲處理8～10min，利用超聲分散作用，使菌絲懸浮液充分滲透進入支架材料內部，再將燒杯移入恒溫培養箱中，于溫度為35～37℃條件下恒溫靜置13～15h，利用變質牛奶培養的微生物對谷朊粉蛋白質的消耗分解而使谷朊粉溶解去除，使支架材料內部孔隙打通，從而提高產品的孔隙率和連通率，且整個溶解去除過程反應條件溫和，形成的孔隙結構均勻，再將燒杯中預制支架材料取出，用去離子水沖洗3～5次后，紫外滅菌處理30～45min，再將滅菌后的預制支架材料轉入真空冷凍干燥箱中，干燥4～6h，出料，即得納米羥基磷灰石-聚乙烯醇多孔支架。
實例1
依次稱取35g聚乙烯醇，2.8g谷朊粉，倒入盛有300ml溫度為25℃去離子水的燒杯中，用玻璃棒攪拌混合15min后，靜置4h，再將燒杯移入數顯測速恒溫磁力攪拌器，于溫度為90℃，轉速為500r/min條件下，恒溫攪拌4h，得預制混合液；依次取150ml預制混合液，8g納米羥基磷灰石，5g表面活性劑op-10，8ml無水乙醇，倒入帶攪拌器的三口燒瓶中，以1000r/min轉速高速攪拌混合30min，再將三口燒瓶中物料迅速轉入模具中，并將模具移入冰箱中，于溫度為-20℃條件下冷凍8h，再將冷凍后的模具取出，于室溫條件下自然解凍6h，如此冷凍、解凍循環5次，脫模，得預制支架材料；量取80ml牛奶，倒入燒杯中，再將燒杯置于避光通風處，靜置直至牛奶變質，再取6ml變質牛奶，并均勻涂布于自制固體培養基表面，再將固體培養基轉入恒溫培養箱中，于溫度為37℃條件下，恒溫培養5天，并用500ml去離子水淋洗培養基表面，得菌絲懸浮液；所述的自制固體培養基是由50g瓊脂，5g蔗糖，4g葡萄糖，0.3g氯化鎂，0.8g磷酸二氫鉀，6g牛肉膏，5g蛋白胨與500ml去離子水混合而成；將預制支架材料移入燒杯中，再向燒杯中加入所得菌絲懸浮液，直至將燒杯中預制支架材料完全淹沒，并將燒杯移入超聲振蕩儀，以42khz頻率超聲處理10min，再將燒杯移入恒溫培養箱中，于溫度為37℃條件下恒溫靜置15h，再將燒杯中預制支架材料取出，用去離子水沖洗5次后，紫外滅菌處理45min，再將滅菌后的預制支架材料轉入真空冷凍干燥箱中，干燥6h，出料，即得納米羥基磷灰石-聚乙烯醇多孔支架。
實例2
依次稱取20g聚乙烯醇，2.6g谷朊粉，倒入盛有200ml溫度為20℃去離子水的燒杯中，用玻璃棒攪拌混合10min后，靜置2h，再將燒杯移入數顯測速恒溫磁力攪拌器，于溫度為85℃，轉速為300r/min條件下，恒溫攪拌2h，得預制混合液；依次取100ml預制混合液，6g納米羥基磷灰石，3g表面活性劑op-10，6ml無水乙醇，倒入帶攪拌器的三口燒瓶中，以800r/min轉速高速攪拌混合20min，再將三口燒瓶中物料迅速轉入模具中，并將模具移入冰箱中，于溫度為-18℃條件下冷凍6h，再將冷凍后的模具取出，于室溫條件下自然解凍4h，如此冷凍、解凍循環3次，脫模，得預制支架材料；量取60ml牛奶，倒入燒杯中，再將燒杯置于避光通風處，靜置直至牛奶變質，再取4ml變質牛奶，并均勻涂布于自制固體培養基表面，再將固體培養基轉入恒溫培養箱中，于溫度為35℃條件下，恒溫培養3天，并用300ml去離子水淋洗培養基表面，得菌絲懸浮液；所述的自制固體培養基是由30g瓊脂，4g蔗糖，2g葡萄糖，0.1g氯化鎂，0.6g磷酸二氫鉀，4g牛肉膏，3g蛋白胨與400ml去離子水混合而成；將預制支架材料移入燒杯中，再向燒杯中加入所得菌絲懸浮液，直至將燒杯中預制支架材料完全淹沒，并將燒杯移入超聲振蕩儀，以40khz頻率超聲處理8min，再將燒杯移入恒溫培養箱中，于溫度為35℃條件下恒溫靜置13h，再將燒杯中預制支架材料取出，用去離子水沖洗3次后，紫外滅菌處理30min，再將滅菌后的預制支架材料轉入真空冷凍干燥箱中，干燥4h，出料，即得納米羥基磷灰石-聚乙烯醇多孔支架。
實例3
依次稱取30g聚乙烯醇，2.7g谷朊粉，倒入盛有250ml溫度為22℃去離子水的燒杯中，用玻璃棒攪拌混合12min后，靜置3h，再將燒杯移入數顯測速恒溫磁力攪拌器，于溫度為87℃，轉速為400r/min條件下，恒溫攪拌3h，得預制混合液；依次取120ml預制混合液，7g納米羥基磷灰石，4g表面活性劑op-10，7ml無水乙醇，倒入帶攪拌器的三口燒瓶中，以900r/min轉速高速攪拌混合25min，再將三口燒瓶中物料迅速轉入模具中，并將模具移入冰箱中，于溫度為-19℃條件下冷凍7h，再將冷凍后的模具取出，于室溫條件下自然解凍5h，如此冷凍、解凍循環4次，脫模，得預制支架材料；量取70ml牛奶，倒入燒杯中，再將燒杯置于避光通風處，靜置直至牛奶變質，再取5ml變質牛奶，并均勻涂布于自制固體培養基表面，再將固體培養基轉入恒溫培養箱中，于溫度為36℃條件下，恒溫培養4天，并用400ml去離子水淋洗培養基表面，得菌絲懸浮液；所述的自制固體培養基是由40g瓊脂，4g蔗糖，3g葡萄糖，0.2g氯化鎂，0.7g磷酸二氫鉀，5g牛肉膏，4g蛋白胨與450ml去離子水混合而成；將預制支架材料移入燒杯中，再向燒杯中加入所得菌絲懸浮液，直至將燒杯中預制支架材料完全淹沒，并將燒杯移入超聲振蕩儀，以41khz頻率超聲處理9min，再將燒杯移入恒溫培養箱中，于溫度為36℃條件下恒溫靜置14h，再將燒杯中預制支架材料取出，用去離子水沖洗4次后，紫外滅菌處理40min，再將滅菌后的預制支架材料轉入真空冷凍干燥箱中，干燥5h，出料，即得納米羥基磷灰石-聚乙烯醇多孔支架。