本發(fā)明涉及一種中藥刺人參提取物，特別涉及一種具有抗疲勞作用的刺人參提取物及其制備方法。
背景技術(shù)：
隨著生活水平的提高，社會(huì)節(jié)奏加快，疲勞正成為21世紀(jì)危害人類健康的重要因素，逐漸引起人們的關(guān)注。據(jù)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，有一半以上的人會(huì)在日常工作中感到疲勞，其中有超過1/3的人明確表示受到疲勞的影響，生活質(zhì)量和工作效率嚴(yán)重降低。然而疲勞的危害已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了人們的想象，報(bào)告顯示，僅青少年中就有1.4%的人群患有持續(xù)性疲勞，而他們中間60%都伴有潛在活動(dòng)不能自理。通過國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)分析，我們發(fā)現(xiàn)近20年來(lái)，研究領(lǐng)域?qū)ζ诘年P(guān)注度正逐漸升高，疲勞的研究熱點(diǎn)主要集中在運(yùn)動(dòng)型疲勞和心理性疲勞。疲勞既可以作為某種疾病的伴隨癥狀，如惡性腫瘤、多發(fā)性硬化綜合征、缺鐵性貧血等出現(xiàn)，又可以作為一種獨(dú)立的疾病單獨(dú)出現(xiàn)，如慢性疲勞綜合征。盡管在日常生活中，“疲勞”已成為一種普遍的亞健康狀態(tài)的表述，然而隨著時(shí)代的發(fā)展，疲勞逐漸成為人們健康的“隱形殺手”。自從世界衛(wèi)生組織在報(bào)告中將疲勞列為21世紀(jì)危害人類健康的主要因素之一，疲勞逐漸引起了研究領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。
目前，中草藥物及中醫(yī)針灸干預(yù)是治療疲勞的重要方法之一。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)疲勞一般以治療基礎(chǔ)疾病為應(yīng)對(duì)，加上后期的休息調(diào)養(yǎng)，別無(wú)他法；與之相比，中醫(yī)對(duì)疲勞的認(rèn)識(shí)已有二千多年歷史，中醫(yī)經(jīng)典《黃帝內(nèi)經(jīng)》、《金匱要略》等均對(duì)疲勞有較多的論述。中醫(yī)藥在抗疲勞的過程中，積累了豐富的理論知識(shí)和臨床經(jīng)驗(yàn)。以患者癥狀為主要依據(jù)，并以舌、脈象為輔助，表明疲勞是一種以虛證為主的臨床表現(xiàn)，涉及到氣、血、精液、臟腑等方面，充分體現(xiàn)了中醫(yī)的整體觀念。近年來(lái)，運(yùn)用中藥抗疲勞的作用研究及臨床應(yīng)用屢見報(bào)道，但是現(xiàn)在臨床中使用的中藥制劑，大都藥味眾多、配伍不合理、作用機(jī)制不明確，致使臨床應(yīng)用療效不顯著。而單味中藥中，盡管已發(fā)現(xiàn)部分藥物具有一定的抗疲勞作用，但因?yàn)閱挝吨兴幊煞值亩鄻有院退幮У膹?fù)雜性，亦使治療效果并不顯著。所以，真正意義上抗疲勞的純中藥制劑仍處于相對(duì)缺乏狀態(tài)。刺人參（oplopanaxelatusnakai）別名刺參、東北刺人參，系五加科刺參屬多年生落葉灌木。特異生長(zhǎng)在東北林區(qū)，具有補(bǔ)氣壯陽(yáng)、止咳，通絡(luò)等功效。用于氣虛體弱，神疲乏力等癥。刺人參在民間常被用于治療失眠，而大量的藥理實(shí)驗(yàn)研究表明刺人參有明顯的改善睡眠作用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的之一是提供一種具有緩解疲勞作用的刺人參提取物。
本發(fā)明的目的之二是提供上述刺人參提取物的制備方法及提高其抗疲勞活性。
一種具有抗疲勞作用的刺人參提取物，它是由刺人參根莖經(jīng)15倍量75%乙醇加熱回流提取3次，每次1.5小時(shí)，過濾，合并濾液，回收乙醇提取液，濃縮至相對(duì)密度為1.00-1.05，濾液加95%乙醇至醇濃度為80%，靜置24小時(shí)，過濾，沉淀?xiàng)壢?，上清液回收濃縮至濃度為0.1g/ml，上d101型大孔樹脂柱，上樣量為藥材/樹脂比1：20，首先用8bv蒸餾水沖洗，流速為2bv/h，再用8bv30%乙醇以1bv/h流速洗脫，最后用95%乙醇洗脫，收集95%乙醇洗脫液，濃縮、干燥，即得刺人參抗疲勞作用的有效部位提取物。
所述的提取物，其用于治療慢性疲勞綜合征或其他以慢性疲勞為伴隨癥狀的相關(guān)疾病。
所述的提取物用于制備緩解疲勞或與抗輻射相關(guān)的疾病的藥物組合物。
所述的藥物提取物其被制成片劑、膠囊、口服液、注射劑、粉劑、膏劑或外用藥液。
所述的提取物在制備用于緩解疲勞或與抗輻射功能相關(guān)的疾病的藥物及保健品中的應(yīng)用。
該發(fā)明是對(duì)刺人參藥材經(jīng)75%乙醇加熱回流提取，除多糖，經(jīng)d101型大孔樹脂柱，分別以蒸餾水，30%乙醇，95%乙醇洗脫，收集并濃縮得各提取液進(jìn)行抗疲勞實(shí)驗(yàn)研究，通過對(duì)icr小鼠分別實(shí)行力竭游泳、負(fù)重力竭游泳實(shí)驗(yàn)、抗輻射實(shí)驗(yàn)，并對(duì)其肝糖原、血乳酸(lac)、血清尿素氮(bun)、胸腺指數(shù)、存活率等進(jìn)行測(cè)定，確定其抗疲勞的有效部位為刺人參95%乙醇洗脫組分。
一種具有抗疲勞作用的刺人參提取物制備方法，包括以下步驟：
將刺人參根莖經(jīng)15倍量75%乙醇加熱回流提取3次，每次1.5小時(shí)，過濾，合并濾液，回收乙醇提取液，濃縮至相對(duì)密度為1.00-1.05(60℃)，濾液加95%乙醇至醇濃度為80%，靜置24小時(shí)，過濾，沉淀?xiàng)壢?，上清液回收濃縮至濃度為0.1g/ml，上d101型大孔樹脂柱，上樣量為藥材/樹脂比1：20，首先用8bv蒸餾水沖洗，流速為2bv/h，再用8bv30%乙醇以1bv/h流速洗脫，最后用95%乙醇洗脫，收集95%乙醇洗脫液，濃縮，此95%乙醇洗脫組分為刺人參抗疲勞有效部位。
將刺人參抗疲勞有效成分提取物加入藥學(xué)上可接受的輔料可進(jìn)一步制成膠囊劑、片劑、顆粒劑、丸劑、口服液、注射劑。
有益效果：
本發(fā)明提供一種具有抗疲勞作用的中藥有效部位，該有效部位由刺人參95%乙醇洗脫組分組成，其能夠用于緩解疲勞。
近來(lái)我們研究發(fā)現(xiàn)，將刺人參分別用水、正丁醇、95%乙醇洗脫組分等進(jìn)行有效部位提取，發(fā)現(xiàn)刺人參95%乙醇洗脫組分可改善疲勞狀態(tài)，而且刺人參95%乙醇洗脫組分用于抗疲勞還未見報(bào)道。本發(fā)明人經(jīng)過長(zhǎng)期和艱苦的研究實(shí)驗(yàn)，并經(jīng)藥理活性檢測(cè)，最終確定了刺人參95%乙醇洗脫組分具有良好的抗疲勞作用。
本發(fā)明采用現(xiàn)代工藝制成刺人參抗疲勞有效部位，建立小鼠力竭游泳實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，證明刺人參95%乙醇洗脫組分可以顯著延長(zhǎng)小鼠力竭游泳時(shí)間；繼而建立小鼠負(fù)重力竭游泳模型，表明刺人參95%乙醇洗脫組分組在延長(zhǎng)小鼠負(fù)重力竭游泳時(shí)間的同時(shí)，還可以顯著提高肝糖原含量，降低血乳酸(lac)和血清尿素氮(bun)的含量。上述結(jié)果證實(shí)了刺人參95%乙醇洗脫組分在抗疲勞作用上具有獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)，此發(fā)明為中藥刺人參在抗疲勞、增強(qiáng)機(jī)體的抵抗力方面的開發(fā)和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
具體實(shí)施方式
一種具有抗疲勞作用的刺人參提取物制備方法，包括以下步驟：
它是由刺人參根莖經(jīng)15倍量75%乙醇加熱回流提取3次，每次1.5小時(shí)，過濾，合并濾液，回收乙醇提取液，濃縮至相對(duì)密度為1.00-1.05，濾液加95%乙醇至醇濃度為80%，靜置24小時(shí)，過濾，沉淀?xiàng)壢?，上清液回收濃縮至濃度為0.1g/ml，上d101型大孔樹脂柱，上樣量為藥材/樹脂比1：20，首先用8bv蒸餾水沖洗，流速為2bv/h，再用8bv30%乙醇以1bv/h流速洗脫，最后用95%乙醇洗脫，收集95%乙醇洗脫液，濃縮、干燥，即得刺人參抗疲勞作用的有效部位提取物。
所述的提取物，其用于治療慢性疲勞綜合征或其他以慢性疲勞為伴隨癥狀的相關(guān)疾病。
所述的提取物用于制備緩解疲勞或與抗輻射相關(guān)的疾病的藥物組合物。
所述的藥物提取物，其被制成片劑、膠囊、口服液、注射劑、粉劑、膏劑或外用藥液。
所述的提取物在制備用于緩解疲勞或與抗輻射功能相關(guān)的疾病的藥物及保健品中的應(yīng)用。
藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究
1、刺人參各部位提取物對(duì)icr小鼠力竭游泳時(shí)間的影響
1.1實(shí)驗(yàn)材料
1.1.1動(dòng)物
icr小鼠，雄性，體重18-22g，spf級(jí)，由黑龍江省中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評(píng)價(jià)中心（glp實(shí)驗(yàn)室）提供，許可證書：scxk（黑）2013-004。標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，室溫25±1℃。
實(shí)驗(yàn)用藥
刺人參（oplopanaxelatusnakai），產(chǎn)自吉林省集安市野生藥材種植基地，采于春季，植株高約1.5米。將其根莖去殘莖及須根，洗凈，切段曬干備用。將刺人參根莖經(jīng)75%乙醇加熱回流提取，過濾，除多糖，經(jīng)d101型大孔樹脂柱，分別以蒸餾水，30%乙醇，95%乙醇洗脫，收集并濃縮各提取液，分別得到刺人參75%乙醇提取總組分，水洗脫組分，30%乙醇洗脫組分，95%乙醇洗脫組分。
實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1動(dòng)物分組及給藥
icr小鼠，雄性，隨機(jī)分為5組，空白對(duì)照組、刺人參75%乙醇提取總組分，水洗脫組分，30%乙醇洗脫組分，95%乙醇洗脫組分，每組各12只，體重18-22g。受試藥物以無(wú)菌水配置，空白組給予無(wú)菌水，連續(xù)灌胃7天，小鼠灌胃體積為20ml/kg-1。
小鼠力竭游泳實(shí)驗(yàn)方法
末次給予小鼠受試藥物30min后，置小鼠于游泳箱中游泳，水深為35cm，水溫為25±1℃，記錄小鼠從游泳開始至死亡的時(shí)間，作為小鼠游泳時(shí)間。
統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
采用spss13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，結(jié)果以（±s）表示，用組間t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較，p<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
由表1可知，小鼠用不同濃度的刺人參提取液灌胃7天后，進(jìn)行力竭游泳實(shí)驗(yàn)，與空白對(duì)照組相比，刺人參75%乙醇提取總組分組和95%乙醇洗脫組分組均可延長(zhǎng)小鼠力竭游泳時(shí)間，但95%乙醇洗脫組分組能延長(zhǎng)小鼠力竭游泳時(shí)間具有顯著意義（p<0.01）。
表1刺人參95%乙醇洗脫組分對(duì)icr小鼠力竭游泳時(shí)間的影響（
注：與空白對(duì)照組比，*p<0.05，**p<0.01；
1、刺人參95%乙醇洗脫組分對(duì)icr小鼠負(fù)重力竭游泳時(shí)間的影響
2.1實(shí)驗(yàn)材料同上。
實(shí)驗(yàn)方法
2.2.1動(dòng)物分組及給藥
icr小鼠，雄性，隨機(jī)分為4組，空白對(duì)照組、刺人參95%乙醇洗脫組分高中低組，各12只，體重18-22g。受試藥物以無(wú)菌水配置，空白組給予無(wú)菌水，連續(xù)灌胃7天，小鼠灌胃體積為20ml/kg-1。
小鼠負(fù)重力竭游泳模型建立
在參考王君耀等建立的小鼠負(fù)重力竭游泳模型基礎(chǔ)上，加以改良復(fù)制出以下小鼠負(fù)重力竭游泳模型：末次給予小鼠受試藥物30min后，在小鼠尾部負(fù)荷相對(duì)于體質(zhì)量5%的鉛皮，置小鼠于游泳箱中游泳，水深為35cm，水溫為25±1℃，記錄小鼠游泳至頭部深入水中10s不再浮起結(jié)束，記錄小鼠負(fù)重力竭游泳時(shí)間。
統(tǒng)計(jì)學(xué)處理同上。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
由表2可知，小鼠用不同濃度的刺人參95%乙醇洗脫組分灌胃7天后，進(jìn)行力竭游泳實(shí)驗(yàn)，與空白對(duì)照組相比，中、高劑量組能顯著延長(zhǎng)小鼠力竭游泳時(shí)間（p<0.01），其中高劑量組優(yōu)于中劑量組，表明該實(shí)驗(yàn)方法可靠。
表2刺人參95%乙醇洗脫組分對(duì)icr小鼠負(fù)重力竭游泳時(shí)間的影響（
注：與空白對(duì)照組比，*p<0.05，**p<0.01；
1、刺人參95%乙醇洗脫組分對(duì)icr小鼠肝糖原、血乳酸(lac)和血清尿素氮(bun)的影響
3.1實(shí)驗(yàn)材料同上。
試劑
糖元測(cè)試盒（貨號(hào)a043）均由南京建成生物工程研究所提供。
實(shí)驗(yàn)方法
3.2.1動(dòng)物分組及給藥同上。
肝糖原、血乳酸(lac)和血清尿素氮(bun)的測(cè)定
末次給予小鼠受試藥物30min后，立即取肝臟和后肢肌肉，置于冰凍生理鹽水中，剔除結(jié)締組織，用濾紙吸干，精確稱重各100mg；按樣本重量（mg）:堿液體積（μl）=1:3，一起加入試管中，沸水欲煮20min，流水冷卻；肝糖原檢測(cè)液為1%，加入蒸餾水的量為肝臟重量×96；肌糖原檢測(cè)液為5%，加入蒸餾水的量為肌肉重量×16；將上述配置好的肝糖原、肌糖原檢測(cè)液混勻后，置沸水中煮5min，冷卻后用620nm波長(zhǎng)，1cm光徑，空白管調(diào)零，測(cè)各管od值。計(jì)算肝糖原、肌糖原含量。
統(tǒng)計(jì)學(xué)處理同上。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
由表3可知，小鼠用不同濃度的刺人參95%乙醇洗脫組分灌胃7天后，進(jìn)行肝糖原、血乳酸(lac)和血清尿素氮(bun)的測(cè)定，與空白對(duì)照組相比，低、中、高劑量組均能顯著提高肝糖原，降低lac和bun的含量（p<0.05），其中高劑量組優(yōu)于中低劑量組，具有顯著性差異（p<0.01）。
表3刺人參95%乙醇洗脫組分對(duì)icr小鼠肝糖原、肌糖原的影響（
注：與空白對(duì)照組比，*p<0.05，**p<0.01；
4刺人參95%乙醇洗脫組分抗輻射作用研究
4.1實(shí)驗(yàn)材料同上。
實(shí)驗(yàn)方法
icr小鼠，雄性，隨機(jī)分為4組，空白對(duì)照組、刺人參95%乙醇洗脫組分高中低組，各20，體重18-22g。60coγ-射線全身照射小鼠(正常組除外)，強(qiáng)度為7.5gy。受試藥物以無(wú)菌水配置，空白組給予無(wú)菌水，連續(xù)灌胃7天，小鼠灌胃體積為20ml/kg-1?；顨⒑蠓Q取小鼠胸腺重量，觀察30d存活率，結(jié)果見表4。
統(tǒng)計(jì)學(xué)處理同上。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
從表4可以看出，由胸腺指數(shù)可知，刺人參95%乙醇洗脫組分可以顯著提高受7.5gyγ-射線照射小鼠的胸腺指數(shù)，提示其具有免疫增強(qiáng)作用。由存活率數(shù)據(jù)結(jié)果可知，刺人參95%乙醇洗脫組分高中劑量組均有一定的抗輻射作用，能提高受照動(dòng)物的存活率，尤其是其高劑量組的抗輻射作用具有顯著性意義著(p＜0.01)。
表4刺人參95%乙醇洗脫組分對(duì)受7.5gyγ-射線照射小鼠某些指標(biāo)的影響（
注：#與對(duì)照組比較，#p＜0.05，##p＜0.01
5、結(jié)論
疲勞的評(píng)價(jià)方法有2種，耐力實(shí)驗(yàn)和生化指標(biāo)的檢查。運(yùn)動(dòng)耐力的提高是抗疲勞能力加強(qiáng)的主要指標(biāo)，游泳時(shí)間的長(zhǎng)短可以反應(yīng)機(jī)體運(yùn)動(dòng)疲勞的程度。根據(jù)上述小鼠力竭游泳及負(fù)重力竭游泳實(shí)驗(yàn)，刺人參95%乙醇洗脫組分組與空白組相比能夠明顯延長(zhǎng)小鼠游泳時(shí)間（p<0.01），其中高劑量組優(yōu)于中低劑量組。
肝糖元儲(chǔ)存在肝臟中，可以與血糖相互轉(zhuǎn)換；肌糖原是糖在肌肉中的儲(chǔ)存形式，在劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)其分解供能，故肝糖原及肌糖原是抗疲勞實(shí)驗(yàn)的重要檢測(cè)指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，在給藥7d后給藥組小鼠體內(nèi)肝糖元含量升高，這就為耐疲勞提供了很好的供能基礎(chǔ)。
lac是糖無(wú)氧酵解的產(chǎn)物，長(zhǎng)時(shí)間劇烈運(yùn)動(dòng)使體內(nèi)lac的積累過多就會(huì)影響機(jī)體內(nèi)環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定和體內(nèi)的正常代謝過程，因此lac的堆積是引起運(yùn)動(dòng)性疲勞的一個(gè)重要原因，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，刺人參95%乙醇洗脫組分組小鼠的lac水平明顯低于對(duì)照組，從而說(shuō)明蘆薈多糖能夠降低lac水平，延長(zhǎng)運(yùn)動(dòng)時(shí)間，延緩疲勞的產(chǎn)生。
bun是蛋白質(zhì)的代謝產(chǎn)物，機(jī)體bun含量隨運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的增加而增加，身體對(duì)負(fù)荷的適應(yīng)性越差，則產(chǎn)生的bun越多。刺人參95%乙醇洗脫組分組小鼠游泳后bun明顯減少，可能是由于加強(qiáng)了糖原、脂肪在運(yùn)動(dòng)中的供能，相對(duì)減少了肌肉中蛋白質(zhì)的消耗比例，維持肌肉中能量平衡以使肌體對(duì)負(fù)荷的適應(yīng)性增強(qiáng)，疲勞消除加快。
綜上所述，刺人參95%乙醇洗脫組分可顯著延長(zhǎng)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間，明顯提高小鼠運(yùn)動(dòng)后肝糖原的含量，降低bun和lac的含量，提高小鼠抗運(yùn)動(dòng)疲勞的能力。此外，刺人參95%乙醇洗脫組分還有明顯的抗輻射作用及增強(qiáng)免疫的作用。因此，刺人參95%乙醇洗脫組分為刺人參緩解疲勞的有效部位，該有效部位在抗疲勞、增強(qiáng)機(jī)體的抵抗力方面具有廣闊的開發(fā)和應(yīng)用前景。