一種特異性磁性Endoglin適配體成像探針系統的制備方法與流程

本發明屬于生物醫學工程領域，具體涉及一種能靶向的特異性磁性endoglin適配體成像探針系統（mend-fe3o4@cmcs）的制備方法。

背景技術：

endoglin（cd105）是一種分子量約為68kd的細胞膜糖蛋白，是轉化生長因子-β（tgf-β）受體復合物的組成成分之一，能獨立存在于細胞表面，是與內皮細胞增殖相關且可被缺氧環境誘導的蛋白。核酸適配體（aptamer）是一類具有高度特異性以及高親和力的核酸分子，通過指數富集系統（selex）從隨機的寡核苷酸庫中篩選而得到的小分子dna或rna，因此它對靶點具有較高的親和力和特異性，可用于疾病的診斷和靶向治療。磁性納米材料具有磁學性能，使它能夠對外加的磁信號或外部的磁場做出迅速的磁響應，通過一定的方法控制磁刺激信號，能使其高效地運用在磁性分離純化、腫瘤藥物靶向遞送、腫瘤熱療以及核磁共振成像等方面。公開號為cn201410209779.8的發明專利，公開了一種靶向抗肝癌納米粒子及其制備方法，此方法操作復雜、費時且技術要求高，有副作用。制備由endoglin適配體修飾的磁性mend-fe3o4@cmcs納米探針，該探針能特異性結合肝癌新生腫瘤血管內皮細胞的方法未見報道。

技術實現要素：

本發明所要解決的技術問題是提供一種平均粒徑大小為87.15±1.66nm、成像效率好的特異性磁性endoglin適配體成像探針mend-fe3o4@cmcs的制備方法，利用此探針系統能有效的靶向小鼠腫瘤新生血管內皮細胞（mtec）表面cd105分子，實現對荷肝癌移植瘤小鼠的mri成像能力。

為了解決這個技術問題，本方法采用如下步驟：

a．水熱法制備磁性fe3o4納米粒子；

b.磁性殼聚糖納米顆粒fe3o4@cmcs的制備；

c.磁性endoglin適配體成像探針mend-fe3o4@cmcs的制備：將步驟b中的磁性殼聚糖納米顆粒fe3o4@cmcs溶解于hepes緩沖液中，加入sulfo-smcc，恒溫搖床孵育；

磁力架分離已交聯smcc的磁性顆粒，加入2-endoglin適配體到交聯過的磁性粒子中，混勻，恒溫搖床孵育，然后加入牛血清蛋白，封閉；

用偶聯緩沖液洗滌納米粒子2-3次，磁分離，得到磁性endoglin適配體成像探針mend-fe3o4@cmcs。

本發明與現有技術相比具有如下優點

1)由本方法制備的磁性endoglin適配體成像探針mend-fe3o4@cmcs能夠特異性的與肝癌中表達cd105分子的新生血管內皮細胞結合，阻斷endoglin受體抑制cd105⁺cells對靶向性納米材料的內吞作用，具有較好的靶向cd105⁺cells的能力，靈敏度高，且其靶向作用具有劑量依賴性。

2)由本方法制備的磁性endoglin適配體成像探針mend-fe3o4@cmcs平均粒徑大約87.15±1.66nm，表面電位為-31.9±0.5mv，無明顯團聚現象，通過ge3.0tmri成像儀對其進行成像分析，t2成像效率更好，mri造影效果顯著提高，對腫瘤細胞的診斷和治療有更好的指導作用。

3)本發明制備工藝簡單，易于實現大規模工業化生產，具有粒徑小、飽和磁化率高、懸浮分散穩定，同時低毒性、馳豫率高、生物相容性好且對肝脾具有靶向性等優點。

4)本發明的其他優點和效果將在下面繼續說明。

附圖說明

圖1：fe3o4、fe3o4@cmcs、mend-fe3o4@cmcs納米粒子tem表征圖。

圖2：納米粒子ftir結果圖（a）cmcs（b）fe3o4（c）mend-fe3o4@cmcs。

圖3：納米材料熱重分析曲線圖。

圖4：mend-fe3o4@cmcs特異性結合表達cd105+的細胞：熒光顯微鏡觀察（a）fitc標記的mend-fe3o4@cmcs處理后不同細胞系的熒光圖片。（b）fitc標記的rs-fe3o4@cmcs處理不同細胞系的熒光圖片。（c）未標記的endoglin-aptamer競爭封閉細胞表面受體后mend-fe3o4@cmcs結合cd105⁺cells的結果。fitc（綠色），dapi（藍色）。

圖5：流式分析儀檢測不同納米材料分別與293t、h22、cd105^-cells或cd105⁺cells細胞的結合能力圖。

圖6：mend-fe3o4@cmcs、rs-fe3o4@cmcs、fe3o4分別標記cd105⁺cells后普魯士藍染色細胞實驗結果圖。pbs為對照control組。

圖7：細胞內鐵的吞噬量（a）cd105⁺cells吞噬不同納米顆粒的定量分析圖（b）cd105⁺cells吞噬不同濃度mend-fe3o4@cmcs納米顆粒的定量分析圖。

圖8：納米材料對cd105⁺cells，cd105^-cells，293t和h22細胞的毒性作用（a）fe3o4（b）mend-fe3o4@cmcs。

圖9：fe3o4、mend-fe3o4@cmcs體外t2-weightedmri成像結果圖。

圖10：不同納米材料與cd105⁺cells孵育后體外mri成像結果圖。

圖11：fe3o4、rs-fe3o4@cmcs和mend-fe3o4@cmcs在小鼠體內mri成像結果圖。

圖12：對小鼠的重要臟器（心、肝臟、肺、脾臟、腎臟）he染色結果圖。

具體實施方式

本發明提供的一種能靶向的特異性磁性endoglin適配體成像探針系統（mend-fe3o4@cmcs）的制備方法總體思路是：mend-fe3o4@cmcs經過了親水性的殼聚糖包裹和修飾。修飾后的mend-fe3o4@cmcs能夠特異性的與肝癌中表達cd105分子的新生血管內皮細胞結合，阻斷endoglin受體抑制cd105⁺cells對靶向性納米材料的內吞作用，具有較好的靶向cd105⁺cells的能力，從而提高了材料的成像效率。

下面結合具體實例對本發明進行進一步描述。

實施例1

水熱法制備磁性fe3o4納米粒子：

稱取2.502g（0.009mol）七水硫酸亞鐵，溶解于30ml的ddh2o中，并加入濃度為50g/l的peg-2000水溶液10ml，充分攪拌混勻，并逐滴加入30ml稀氨水，繼續快速攪拌，并逐滴加入270μlh2o2溶液，至溶液呈現黑色后，繼續攪拌20min；將溶液轉移至高壓反應釜中，于160℃下恒溫反應6h后，磁分離洗滌3次，70℃烘干，即得磁性fe3o4納米粒子。

實施例2

磁性殼聚糖納米顆粒fe3o4@cmcs的制備：

稱取羧甲基殼聚糖cmcs0.4g于20mlddh2o中，待攪拌完全溶解后過濾，濾液備用；在濾液中加入0.4g制備好的fe3o4磁性納米粒子，超聲5min，得到分散均勻的fe3o4磁性納米粒子分散液；于250ml的三口瓶里加入58.2ml液體石蠟油，1.8mlspan-80；然后邊攪拌邊加入中分散均勻的fe3o4磁性納米粒子分散液（水相），混合液超聲30min，使其分散均勻，充分攪拌反應2h；加入25%的戊二醛溶液2ml，繼續攪拌反應1.5h；待反應完全后用石油醚磁分離洗滌3次，再用丙酮磁分離洗滌3次；所得產物于真空干燥箱70℃干燥，研磨得到磁性殼聚糖納米顆粒fe3o4@cmcs。

實施例3

磁性endoglin適配體成像探針mend-fe3o4@cmcs的制備：

將磁性殼聚糖納米顆粒fe3o4@cmcs（-nh2）溶解于ph為7.2的hepes緩沖液中，加入40μlsulfo-smcc（4-（n-馬來酰亞胺甲基）環己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽（4-（n-maleimidomethyl）cyclohexane-1-carboxylicacid3-sulfo-n-hydroxysuccinimideestersodiumsalt）），恒溫搖床4℃孵育2h，用磁力架分離已交聯smcc的磁性顆粒，除去多余的交聯劑后加入2-endoglin適配體，修飾巰基到交聯過的磁性粒子中，混勻；利用溫度恒溫搖床4℃孵育2h；加入100μl1%的牛血清蛋白封閉30min；用1ml偶聯緩沖液洗滌納米粒子2-3次，使用磁力架分離所得磁性顆粒，得到磁性endoglin適配體成像探針mend-fe3o4@cmcs。

磁性endoglin適配體成像探針mend-fe3o4@cmcs納米材料的性能測定：

圖1為實施例1、實施例2、實施例3所制備的fe3o4、fe3o4@cmcs、mend-fe3o4@cmcs納米粒子的tem表征圖，結果表明單純fe3o4顆粒形態不規則，聚集現象嚴重。fe3o4@cmcs與mend-fe3o4@cmcs顆粒呈圓形，平均粒徑大約87.15±1.66nm，分布均勻，無明顯團聚現象。

圖2為實施例1、實施例2、實施例3所制備的fe3o4、fe3o4@cmcs、mend-fe3o4@cmcs納米粒子ftir結果圖，紅外分析結果顯示，mend-fe3o4@cmcs（c）基本保留了cmcs的特征峰，并在584cm-1處出現了fe3o4的特征峰，證明cmcs成功包裹fe3o4。

圖3為實施例1、實施例2、實施例3所制備的fe3o4、fe3o4@cmcs、mend-fe3o4@cmcs納米材料熱重分析曲線圖，熱重（tg）曲線顯示在600℃-800℃區間內，mend-fe3o4@cmcs基本維持不變，表明mend-fe3o4@cmcs的熱穩定性好。

圖4為實施例3所制備的mend-fe3o4@cmcs特異性結合表達cd105+的細胞：熒光顯微鏡觀察（a）fitc標記的mend-fe3o4@cmcs處理后不同細胞系的熒光圖片。（b）fitc標記的rs-fe3o4@cmcs處理不同細胞系的熒光圖片。（c）未標記的endoglin-aptamer競爭封閉細胞表面受體后mend-fe3o4@cmcs結合cd105⁺cells的結果。fitc（綠色），dapi（藍色），mend-fe3o4@cmcs探針與cd105⁺cells結合后的熒光強度明顯減弱，表明阻斷endoglin受體可以抑制cd105⁺cells對靶向性納米材料的內吞作用。

圖5為流式分析儀檢測實施例2、實施例3所制備的fe3o4@cmcs、mend-fe3o4@cmcs分別與293t、h22、cd105^-cells或cd105⁺cells細胞的結合能力圖，結果表明通過流式細胞術的方法檢測細胞結合fitc熒光強度，cd105⁺cells與mend-fe3o4@cmcs探針結合后其細胞熒光明顯增強。

圖6為實施例1、實施例2、實施例3所制備的fe3o4、fe3o4@cmcs、mend-fe3o4@cmcs分別標記cd105⁺cells后普魯士藍染色細胞實驗結果圖。pbs為對照control組，藍色代表了細胞攝取的含鐵納米材料，細胞著色越深說明細胞內吞噬的鐵離子含量越多。cd105+cells經過與不同材料fe3o4、rs-fe3o4@cmcs、mend-fe3o4@cmcs分別共培養后，加入mend-fe3o4@cmcs探針共培養組的細胞胞內染色（藍色）最多，顏色深，進入cd105+cells的鐵納米材料更多。

圖7為細胞內鐵的吞噬量（a）cd105⁺cells吞噬實施例1、實施例2、實施例3所制備的fe3o4、fe3o4@cmcs、mend-fe3o4@cmcs的定量分析圖（b）cd105⁺cells吞噬不同濃度實施例3所制備的mend-fe3o4@cmcs納米顆粒的定量分析圖，如圖7a所示，分別加入鐵離子濃度為50μg/ml的fe3o4、mend-fe3o4@cmcs、rs-fe3o4@cmcs不同材料與cd105+cells共培養后，與mend-fe3o4@cmcs共孵育的細胞組平均細胞內鐵含量為16.78pgfe/cell，較其他各組明顯升高（*p＜0.05）；同時，如圖7b所示，隨著加入mend-fe3o4@cmcs探針濃度的增加，cd105⁺cells胞內的鐵離子含量也隨之相應的增加，表明經endoglin適配體修飾的磁性mend-fe3o4@cmcs納米材料具有較好的靶向cd105⁺cells的能力，且其靶向作用具有劑量依賴性。

圖8為實施例1、實施例3所制備的fe3o4、mend-fe3o4@cmcs對cd105⁺cells，cd105^-cells，293t和h22細胞的毒性作用（a）fe3o4（b）mend-fe3o4@cmcs，用cck-8法檢測fe3o4和mend-fe3o4@cmcs對不同細胞的毒性。分別與293t、h22、cd105-cells或cd105⁺cells等細胞共培養24h后，隨著培養液中mend-fe3o4@cmcs探針濃度的增加，細胞活力仍然大于80%，對細胞存活率無明顯抑制作用。而隨著加入fe3o4的濃度的增加，fe3o4對各種細胞的存活率的抑制明顯增大，當鐵濃度大于40μg/ml時，可見明顯的細胞活性的下降，表現出明顯的細胞毒性。表明經適配體修飾及殼聚糖包裹后的磁性endoglin適配體成像探針mend-fe3o4@cmcs細胞毒性更小。

圖9為實施例1、實施例3所制備的fe3o4、mend-fe3o4@cmcs體外t2-weightedmri成像結果圖，制備的fe3o4和mend-fe3o4@cmcs顆粒都能明顯的縮短t2弛豫時間，有良好的t2增強作用，并能引起mri成像上的變化，表現為：隨著納米材料濃度的增加，mri信號強度隨之降低，圖像上顯示為暗信號，并且隨著濃度的遞增而暗信號越強。當加入相同的鐵濃度時，mend-fe3o4@cmcs組的暗信號明顯的強于fe3o4組。經過了親水性的殼聚糖包裹和修飾能夠促進水分子進一步接觸磁性納米顆粒，從而可以提高材料的成像效率。

圖10為實施例1、實施例2、實施例3所制備的fe3o4、fe3o4@cmcs、mend-fe3o4@cmcs與cd105⁺cells孵育后體外mri成像結果圖，結果顯示不同的造影劑t2加權圖，在同一fe離子濃度的條件下，mend-fe3o4@cmcs組的信號下降最明顯，而fe3o4和rs-fe3o4@cmcs組的信號與空白細胞組的信號強度基本無變化。

圖11為實施例1、實施例2、實施例3所制備的fe3o4、fe3o4@cmcs、mend-fe3o4@cmcs在小鼠體內mri成像結果圖，結果顯示mend-fe3o4@cmcs組小鼠荷瘤部位信號明顯降低，說明mend-fe3o4@cmcs可以顯著的降低小鼠荷瘤部位的t2信號強度，提高balb/c小鼠肝癌移植瘤部位成像對比度，使得兩者的交界面得以清楚顯示。

圖12為實施例3所制備的mend-fe3o4@cmcs對小鼠的重要臟器（心、肝臟、肺、脾臟、腎臟）的he染色結果圖，結果表明mend-fe3o4@cmcs對小鼠的主要臟器無毒性損傷。

對于本領域技術人員而言，顯然本發明不限于上述示范性實施例的細節，而且在沒有背離本發明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現本發明。因此，無論從哪一點來看，均應將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發明的范圍由所附權利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權利要求的等同腰間的含義和范圍內的所有變化囊括在本發明內。

此外，應當理解，雖然本說明書按照實施例加以描述，但并非每個實施方式僅包含一個獨立的技術方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領域技術人員應當將說明書作為一個整體，各實施例中的技術方案也可以經適當組合，形成本領域技術人員可以理解的其他實施方式。