曲安奈德PLGA緩釋微球注射劑、其制備方法及其在制備治療骨關(guān)節(jié)炎疼痛藥物中的應用與流程

本發(fā)明涉及一種用于骨關(guān)節(jié)炎疼痛治療的緩釋注射制劑，具體而言，本發(fā)明是制備一種載曲安奈德的緩釋制劑，通過關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射緩慢釋放藥物曲安奈德，同時緩釋微球中復合了玻尿酸，更增加了制劑療效，從而達到長效控制骨關(guān)節(jié)炎疼痛的效果，并且減少注射頻率，增加患者依從性，制備工藝操作簡單，緩釋注射劑毒副作用低，是極具臨床應用的新制劑。

背景技術(shù)：

炎癥中的介導因子可以激活或者敏感化痛覺感受神經(jīng)(痛覺感受器)，而在正常關(guān)節(jié)中痛覺感受器僅響應于超出關(guān)節(jié)正常工作范圍內(nèi)的重度壓力和極度運動。在合適的濃度下糖皮質(zhì)激素可以降低或消除炎癥以及炎癥引起的疼痛。曲安奈德注射液用于關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射，可作用于骨關(guān)節(jié)炎引起的痛覺過敏，恢復痛覺感受器到正常條件下的反應閾值。目前臨床使用的曲安奈德速釋混懸注射劑，在骨關(guān)節(jié)炎患者的膝關(guān)節(jié)平均滯留時間為3.8天，療效可持續(xù)約兩周，所以關(guān)節(jié)腔注射頻率較高。因此，改進曲安奈德的注射制劑，降低給藥頻率，延長骨關(guān)節(jié)炎鎮(zhèn)痛效果，具有重要意義。

傳統(tǒng)速釋曲安奈德注射劑在治療骨關(guān)節(jié)炎疼痛中需要頻繁關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射給藥，對患者造成極大負擔，單詞給藥藥效持續(xù)時間約兩周。近年來隨著生物高分子聚合物材料在醫(yī)藥學領(lǐng)域的廣泛應用，脂質(zhì)體、微球、凝膠和膠束等藥物緩控釋新制劑不斷涌現(xiàn)，逐漸成為新藥物制劑的研究熱點之一。將曲安奈德制備成具有緩釋作用的給藥系統(tǒng)，使藥物在關(guān)節(jié)和周關(guān)節(jié)組織局部緩慢、持續(xù)釋放，維持局部較高的藥物濃度，同時顯著降低關(guān)節(jié)腔注射頻率，延長鎮(zhèn)痛效果。本發(fā)明采用聚乳酸-羥基乙酸(plga)包載糖皮質(zhì)激素曲安奈德，制備一種緩釋制劑，并在plga微球中添加玻尿酸顆粒，從而進一步提高骨關(guān)節(jié)炎鎮(zhèn)痛效果。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種治療骨關(guān)節(jié)炎疼痛的載曲安奈德的plga緩釋微球，該微球以plga包載曲安奈德，同時包裹玻尿酸顆粒，可以在關(guān)節(jié)炎癥部位緩慢釋放曲安奈德，而玻尿酸是一種粘性多糖，可以進一步補充關(guān)節(jié)炎部位的粘彈性，從而緩解炎癥疼痛的效果。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案：

一種曲安奈德plga緩釋微球注射劑，所述制劑包含曲安奈德、plga共聚物和玻尿酸。所述的載曲安奈德的plga緩釋微球(下文中簡稱載藥緩釋微球)是將plga與曲安奈德通過多重乳化法制成的載藥微球。具體說：是將plga與曲安奈德以及玻尿酸通過多重乳化法制成的載藥微球，所述的載藥微球中的plga共聚物分子量為20000-50000da，共聚物乳酸(lacticacid，la)/羥基乙酸(glycolicacid，ga)的摩爾比為(75-85)∶(15～25)。plga與曲安奈德的重量比為100:(5～25)，plga與玻尿酸重量比例為100:(5～15)，在有機溶劑和聚乙烯醇溶液中采用水包油包固體(solid-in-oil-in-water)乳化制備而成。得到的微球粒徑均一，在20～80微米之間，藥物包封率在80～95％之間，穩(wěn)定性好。其中水相分散介質(zhì)采用濃度為1～6％的聚乙烯醇。

所述的曲安奈德plga緩釋微球注射劑的制備方法，所述的方法包括以下步驟：

1)將曲安奈德和plga共聚物溶于有機溶劑中作為油相，乳化劑溶于水中作為水相；

2)將玻尿酸溶液采用冷凍相分離法制成玻璃化顆粒；

3)將玻璃化玻尿酸顆粒加到曲安奈德plga油相形成油包固體乳，即solid-in-oil；

4)將以上油包固體乳和聚乙烯醇水相用高壓均質(zhì)機制成水包油包固體多重乳劑；

5)去除溶劑，在蒸餾水中硬化，洗滌三次然后冷凍干燥制成微球。

所述的油相和水相的體積比例為1:5～100；進一步的，所述的油相和水相的體積比例為1:50。

所述的有機溶劑為二氯甲烷：所述的乳化劑為1～6％w/w的聚乙烯醇(型號pva1788)。乳化采用電動均質(zhì)機(勻漿)，也或可采用超聲乳化或電動攪拌等方法。

經(jīng)過優(yōu)選后發(fā)現(xiàn)plga的分子量為20000da，la/ga＝75/25(以摩爾比計)的plga為基質(zhì)材料，plga與曲安奈德的重量比為100:15，plga與玻尿酸的重量比為100:10，二氯甲烷為有機相，3％pva為水相，1000轉(zhuǎn)/分鐘電動攪拌3min，然后加入蒸餾水磁力攪拌5hr進行固化，洗滌3次然后冷凍干燥。所制備的微球平均粒徑為43.9微米，大小較均勻一致，表面光滑、無粘連，包封率達94.6％，載藥率約為14.2％，可持續(xù)穩(wěn)定釋放藥物達3個月，緩釋效果佳，且動物實驗表明：在大鼠鏈球菌細胞壁肽聚糖關(guān)節(jié)炎模型中，本緩釋微球與市場上速釋曲安奈德注射劑相比可顯著延長鎮(zhèn)痛效果。

本發(fā)明具有如下技術(shù)效果：

本發(fā)明的載藥緩釋微球具有較好的穩(wěn)定性。采用plga微球包載曲安奈德，不僅可以緩慢釋放藥物，同時可以增加藥物穩(wěn)定性，減少藥物水解。反相疏水高效液相法檢測結(jié)果顯示，體外釋放于水溶液的速釋曲安奈德有明顯的降解吸收峰，而包載在微球內(nèi)的曲安奈德結(jié)構(gòu)較完整，無明顯降解產(chǎn)物吸收峰出現(xiàn)。玻尿酸同時起到協(xié)同增效作用，因為玻尿酸改善膝關(guān)節(jié)粘度，進一步減小曲安奈德的清除率，延長作用時間。

本發(fā)明的載藥緩釋微球注射劑適用于骨關(guān)節(jié)炎疼痛的治療，可以調(diào)整給藥次數(shù)，比如每三個月一次關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射，達到在骨關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)和周關(guān)節(jié)組織內(nèi)長效鎮(zhèn)痛效果。

本發(fā)明的載藥緩釋微球注射劑在大鼠鏈球菌細胞壁肽聚糖關(guān)節(jié)炎模型中，與市場上速釋曲安奈德注射劑相比可顯著延長鎮(zhèn)痛效果。通過病理組織學檢查，緩釋微球治療組大鼠膝關(guān)節(jié)組織結(jié)構(gòu)正常，而速釋曲安奈德注射劑組大鼠膝關(guān)節(jié)顯示出炎癥，骨吸收和軟骨損失，僅稍優(yōu)于空白對照組。本發(fā)明可顯著減少注射次數(shù)從而減輕患者負擔，增加治療依從性，并延長鎮(zhèn)痛時間，是一種極具臨床應用前景的新劑型。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的載藥緩釋微球的掃描電鏡圖。

圖2為本發(fā)明的載藥緩釋微球體外釋放曲線。

圖3為本發(fā)明的載藥緩釋微球載在大鼠scw炎癥模型中的體內(nèi)鎮(zhèn)痛效果(電子von-frey痛覺儀檢測)。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明進行詳細說明：

實施例1

1.載藥緩釋微球的制備

采用溶劑揮發(fā)法制備載曲安奈德的復合plga緩釋微球。步驟如下：

精密稱取plga50mg，溶于1ml二氯甲烷，加入曲安奈德7.5mg，以及玻尿酸冷凍誘導相分層玻璃化顆粒(含玻尿酸5mg)，渦旋振蕩充分溶解，為有機相。用1ml注射器吸取有機相，緩緩注入50ml3％pva水溶液中，1000rpm電動攪拌3分鐘，繼續(xù)磁力攪拌5小時。固化好的載藥微球經(jīng)0.22μm微孔濾膜抽濾，用500ml蒸餾水反復洗滌，收集載藥微球，真空冷凍干燥即得載曲安奈德復合plga微球。

實驗證明：當plga與曲安奈德的投料比為50mg/7.5mg時，所獲得的載藥緩釋微球具有最佳的包封率和載藥率，分別為94.6％與14.2％。

上述的plga基質(zhì)材料的分子量為20000da，la/ga＝75/25(以摩爾比計)，此材料可以是市售產(chǎn)品或采用通用的開環(huán)聚合法合成制成。

2.載藥微球表面形態(tài)觀察及粒徑測定

取適量載藥緩釋微球凍干粉，均勻分散在雙面碳膠帶上，離子鍍膜儀濺金后，掃描電鏡觀察，微球大小較均勻，表面光滑，分散良好，無粘連(圖1)。測量400個載藥微球的粒徑，平均粒徑為43.9μm。

3.載藥微球包封率和載藥率的測定

采用uplc色譜法檢測。色譜條件如下：流動相為乙腈/水＝40/60或者甲醇/水＝70/30，流速為0.5ml/min，柱溫30℃，檢測波長254nm。精密稱取曲安奈德適量，加入甲醇溶解成濃度為1mg/ml的標準貯備液。精密量取曲安奈德儲備液0.05、0.1、0.25、0.5和1.0ml置10ml量瓶中，甲醇定容得系列濃度的對照溶液。20微升進樣，以峰面積(y)對對照溶液濃度(xmg/l)進行直線回歸。

精密稱取載藥緩釋微球10mg于5ml離心管中，加入0.5ml二氯甲烷，超聲使微球溶解，再加入2.5ml甲醇，渦旋5min，4500×g離心15min，取上清液進樣20微升。測定峰面積，代入標準曲線計算曲安奈德濃度。結(jié)果，當plga與曲安奈德的投料比為50mg/7.5mg時可獲得最佳的包封率和載藥率，分別為94.6％與14.2％。

4.載藥微球的體外釋放

精密稱取載藥緩釋微球10mg置于樣品瓶中，加入30mlph為7.2的磷酸鹽緩沖液(含3％peg6000)，渦旋1min后在37℃、(75±5)rpm輕微振蕩，分別于第1、3、7、14、21、28、35、42天，3200×g離心5min，取出所有上清液，同時補充等量釋放液，繼續(xù)振蕩。uplc法測定釋放液中曲安奈德濃度。結(jié)果，載藥緩釋微球釋放較平穩(wěn)，第1天釋放了4.2％，無明顯“突釋”行為，到第42天累積釋放了65.3％，見圖2的載藥緩釋微球的體外釋放曲線圖。

5.體外釋放曲安奈德的穩(wěn)定性檢測

精密稱取載藥緩釋微球50mg置于樣品瓶中，加入30ml釋放液，37℃、(75±5)rpm輕微振蕩，在第7天，3200×g離心5min分離上清液，沉淀的載藥微球殘渣真空干燥后，用二氯甲烷溶解，甲醇萃取曲安奈德，uplc法測定釋放上清液和沉淀微球的曲安奈德，比較吸收峰的差異。用于參照的為載藥緩釋微球體外釋放前檢測的uplc結(jié)果，在保留時間約為6.5min時出現(xiàn)了曲安奈德的吸收峰。載藥緩釋微球體外釋放的上清液在保留時間約為3min時出現(xiàn)一新的吸收峰，峰面積約為曲安奈德峰面積的25％，說明體外釋放的曲安奈德出現(xiàn)了降解(降解產(chǎn)物曲安西龍)。然而體外釋放后的載藥緩釋微球在保留時間約為3min亦可見該吸收峰峰，但峰面積極小，僅為曲安奈德峰面積的4.2％。這表明包載在plga微球的曲安奈德比釋放在緩沖液中的藥物更穩(wěn)定，plga載體具有保護藥物和減少其降解的作用。

6.載藥緩釋微球關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射在大鼠鏈球菌細胞壁肽聚糖關(guān)節(jié)炎模型中的作用

從鏈球菌細胞壁中獲得的肽聚糖(pg-ps)混懸于pbs里。取10微升(含pg-ps5微克)混懸液注射于6-8周lewis大鼠(體重120-150克)右踝或者右膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)(-14天)。對照組采用類似方法注射10微升pbs。關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射14天后，靜脈注射200微克的pg-ps以再激活關(guān)節(jié)炎癥，從而造成右單側(cè)關(guān)節(jié)炎,之后每四周靜脈注射100微克pg-ps用以維持關(guān)節(jié)炎模型。通過測量踝或者膝關(guān)節(jié)直徑來評估關(guān)節(jié)炎程度。使用電子von-frey測痛儀評估大鼠的機械痛覺超敏性。

與市場上速釋曲安奈德注射劑(3-4周藥效)相比，本發(fā)明的載藥緩釋微球注射劑在大鼠鏈球菌細胞壁肽聚糖關(guān)節(jié)炎模型中，可顯著延長鎮(zhèn)痛效果至大約三個月,見圖3載藥緩釋微球大鼠體內(nèi)鎮(zhèn)痛效果。通過病理組織學檢查，緩釋微球治療組大鼠膝關(guān)節(jié)組織結(jié)構(gòu)正常，而速釋曲安奈德注射劑組大鼠膝關(guān)節(jié)顯示出炎癥，骨吸收和軟骨損失，僅稍優(yōu)于空白對照組。