本發明涉及藥學技術領域，尤其是大通塔提取物在制備治療羊體內蠕蟲病藥物中的應用及制備方法。
背景技術：
長期以來，我國在中獸醫培養人才上重視不夠，中獸醫發展滯后，掌握中草藥防治畜禽疾病的獸醫人員很少。加上，使用時大多以傳統的使用方法，用量大，使用麻煩等原因，還有就是中獸藥的療程相對要長。而西藥具有療效快、用量少、使用方便等特點更受獸醫人員青睞。因此，近些年來，西藥防治畜禽疾病已成了主流，用于防治畜禽疾病的西藥藥物的數量和種類不斷增加，從目前來看，畜牧業寄生蟲病的防治主要用阿(伊)維菌素、左旋咪唑、阿苯達唑和吡酮喹等西藥為主。使用這些藥物往往殘留在畜禽體內，直接或間接地威脅著人們的健康。隨著科技的不斷進步，人們對一些藥物有了新的認識，國家適時出臺相關文件禁止生產和使用一些危害人類身體健康的藥物，今后畜禽疾病的防治趨勢主要提倡非抗生化、非激素化。由于大多數中草藥無毒無害，無副作用或副作用較小，無殘留或殘留量很少，無礙畜禽和人體健康，甚至對畜體和人體健康有促進作用。因此，隨著人們對肉食品的原生態化的消費需求，開展中草藥代替西藥防治畜禽疾病，以填補這些被限量使用或禁用的藥物而帶來的問題，將是我國乃至世界今后一段時期內畜牧業發展過程中的重大轉變，是生產綠色肉食品、原生態肉食品的最佳用藥選擇。因此，中獸醫將是今后獸醫的必然走向，研究中獸醫的發展空間很大。
大通塔又名通草、方草，適應性廣，易于繁殖，其藥用價值目前人們所掌握的主要清熱利尿，通氣下乳和抗炎作用。
技術實現要素：
本發明的目的是：提供大通塔提取物在制備治療羊體內蠕蟲病藥物中的應用。
本發明的另一個目的是：提供大通塔提取物的制備方法。
本發明是這樣實現的：大通塔提取物在制備治療羊體內蠕蟲病藥物中的應用。
大通塔提取物的制備方法，將大通塔的根皮加水，料液比為1：2-3，單位為g/ml，將加水藥物在大火中煮沸，然后文火保持最低沸騰狀態熬煮1-2h，濾掉藥渣后，獲得的藥湯即為大通塔提取物。
為了進一步驗證本發明的技術效果，申請人進行了如下實驗：
實驗方法
根據經驗初步判斷，雷山縣五七干校養羊場的羊群可能患絳蟲病，雷山縣合喜養羊場的羊群可能同時患肺絲蟲病和肝片吸蟲病。因此，本實驗分別在兩個養羊場進行實驗。五七干校養羊場進行絳蟲病的療效實驗，合喜養羊場養羊場進行肺絲蟲和肝片吸蟲的療效實驗。
(一)實驗羊的選擇
1、初選實驗羊。
(1)患絳蟲病實驗羊選擇。一般地，羊患絳蟲病后，表現為被毛粗亂、卷曲、無光澤，消瘦，患病嚴重的病羊，排出的糞便顆粒往往成團狀，甚至拉稀。有的羊排出糞便時，有呈乳白色膠樣的肉眼可見的幼蟲隨糞便一起排出體外，粘在糞便的表面或夾于羊糞之間，有一定的粘性，可將幾粒甚至10多粒的糞球粘成團。一般地說，在一個經常放牧的養羊場中，只要觀察到有羊排出的糞便帶有絳蟲幼蟲時，那么這個場的大部分羊都已經患了絳蟲病。將這些疑似病羊按順序編號，并依次取這些疑似病羊排出的新鮮糞便直接肉眼觀察或經浮聚法處理后鏡檢，確定糞樣中含有絳蟲卵、幼蟲或成蟲的相對應的羊就可作為本實驗用羊。
(2)患肺絲蟲病實驗羊選擇。患了肺絲蟲病的羊一般都是被毛粗亂、卷曲、無光澤，消瘦，經常咳嗽，噴鼻，甩頭，往往采用腹式呼吸，有時抽搐，空口磨牙，口流白沫，頭后仰。對疑似病羊分別用無抗凝劑真空采血管進行頸靜脈采血后，對分離的血清用山羊肺絲蟲試劑盒進行ELISA檢測，對呈陽性的血樣所對應的羊即可選為本實驗用羊。
(3)患肝片吸蟲病實驗羊選擇。羊體被毛粗亂、卷曲、無光澤，易脫落，消瘦，精神不振，粘膜蒼白，放牧時行走緩慢，采食逐漸減少，拉稀，患病嚴重的羊，其眼皮、下顎、胸部、腹部呈水腫現象。對疑似病羊分別用無抗凝劑真空采血管進行頸靜脈采血后，對分離的血清用山羊肝片吸蟲試劑盒進行ELISA檢測，對呈陽性的血樣所對應的羊即可選為本實驗用羊。
對經過測定為同時交叉患有肝片吸蟲病和肺絲蟲病的羊，可以同時進行實驗。
2、寄生蟲的檢測方法
(1)糞便直接觀察法
此法主要對肉眼可以直接看見的較大的成蟲和幼蟲。一般是先對新鮮羊糞的表面進行觀察，有些較大蠕蟲的成蟲和幼蟲直接附于羊糞球表現，可以肉眼觀察到。但有一些是在羊糞球內，不能直接看到，需要將羊糞盛于裝有30—37℃溫水的容器中，靜置5—20分鐘，這樣藏于糞球中的一些幼蟲或成蟲就鉆出糞球，粘在糞球表面上，或游在溫水中，也可以直接觀察到。或采用沉聚法收集寄生蟲病的成蟲、幼蟲，即將糞球搗碎，攪拌均勻，靜置沉淀10—20分鐘，棄去上清液，再于沉淀物中重新加入清水，重復3—5次，最后取沉淀物于黑色背景上，用肉眼可觀察蟲體，也可借用放大鏡進行查找。
(2)糞便鏡檢法
鏡檢法主要是檢測用肉眼不能直接看到的較小的幼蟲和蟲卵。先將每只羊的羊糞進行一定過程的處理后，對余下的糞渣或糞液在顯微鏡內鏡檢，鏡檢時，先用低倍鏡檢查，發現蟲卵、卵囊后換取高倍鏡檢查，檢查時應有順序地查遍蓋玻片下的所有部分。依此判斷該羊是否患寄生蟲病及患病類型的方法。鏡檢前先對羊糞用浮聚法和沉聚法進行處理。
①浮聚法：取新鮮羊糞5—10g，放入盛有50—100ml的飽和食鹽水(將食鹽加入沸水中，直至不再溶解生成沉淀為止，用折疊成四層的細口紗布過濾后，冷卻所得的食鹽水，1000mL水中約加食鹽400g)的杯內，攪拌均勻，然后用單層紗布過濾到另一個杯內，靜置30分鐘，這樣比飽和食鹽水比重輕的那些蟲卵就浮到液面上來，再用細鐵絲圈水平著接觸液體表面，蘸取表面液膜，抖落于載玻片上，蓋好蓋玻片，顯微鏡下檢查。
②沉聚法：取糞便5—10g置于燒杯中，加10～20倍量的清潔水，搗碎糞團，充分攪合，再用單層紗布濾過于另一杯中，濾液靜置10分鐘后，這樣比水比重大的那些蟲卵就沉于杯底，傾去上層液，再加水與沉淀物重新攪和、靜置，如此反復水洗沉淀物多次(最少5次以上)，直至上層液透明為止，最后傾去上清液，用吸管吸取沉淀物滴于載玻片上，加蓋玻片鏡檢。
(3)血液ELISA檢測法
主要檢測疑似病羊中是否患肺絲蟲病和肝片吸蟲病，采用ELISA檢測法，步驟如下：
用無抗凝劑真空采血管對疑似病羊進行頸靜脈采血，每只羊采血樣3—5ml，在80—2電動離心機下以3000轉/秒的速度進行離心5分鐘后，收集試管內的上層血清。在預先洗滌好的微孔酶標板上設置2個陰性對照組和2個陽性對照組，每個孔分別加入陰性對照和陽性對照各50μl，用10ml的移液槍將吸取每只羊的血清10μl滴入微孔酶標板的相應孔內10μl，用40μl移液槍吸取樣本稀釋液分別加入各孔內。然后在陰陽對照孔和樣本孔中每孔各加入檢測抗體-HRP標記的檢測抗原100μl，用封板膜封住反應孔，于37℃恒溫箱溫育60min，取出棄去液體，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次。每孔加入底物A、B各50μl，37℃避光孵育15min。最后在各孔中加入終止液50μl，15min內，在450nm波長處測定各孔的吸光度(OD值)。依此決斷樣品是否含有山羊肝片吸(FH)和山羊肺絲蟲(Metastrongylidae)。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色，顏色的深淺和樣品中的山羊肝片吸(FH)和山羊肺絲蟲(Metastrongylidae)都呈正相關。
3、判斷依據
本實驗采集的糞樣是活羊新排出的新鮮糞便，由于寄生蟲的年齡，宿主的免疫狀態，雌蟲的數量，糞便的濃稠度，寄生蟲卵在羊體內的分布不均勻等，影響著排出蟲卵的數量的不均勻，就無法代表體內蟲體數量的比例關系。所以，所采集的糞便，很難以具體的蟲卵數據來體現羊體內的寄生蟲數量。因此只能作為定性判斷，也即是說，對經處理后糞樣進行多次鏡檢，只要糞樣中檢測到有一例蟲卵，就確診為相對應的羊患有絳蟲病，但在實際鏡檢中，由于采集的糞樣中的蟲卵太小，或雜有其它與之形狀極為相似的蟲卵或雜物而無法準確判斷，則另采集該羊的糞樣放于一墊有單層濾紙的培養皿中，加水調成硬糊狀。將此皿置30—35℃的恒溫箱中培養，期間保持皿內濕度(墊紙保持潮濕狀態)，14d左右，有些蟲卵發育足夠大，有的蟲卵甚至發育成幼蟲，此時取其中的糞樣鏡檢，容易鑒別，易于判斷。另外，在肝片吸蟲和肺絲蟲的ELISA檢測中，呈陽性的，也能定性地判斷為相對應的羊患有肝片吸蟲病和肺絲蟲病，但不能判斷其中的含有量。因此，總的來說，本實驗只是定性實驗。
(1)絳蟲病的判斷依據：
成蟲或幼蟲的判斷：呈背腹扁平的帶狀，白色或淺黃色，一般隨糞便排出羊體外的成蟲或幼蟲的長度在1cm—10cm左右，較大的可看到比較一致的結節，有些蟲靜置3—10min后可觀察到其表現輕微蠕動。在放大鏡下可清楚地看到球狀的頭部。
蟲卵的判斷：在高倍鏡下，絳蟲卵一般呈無色或灰色的近圓形或三角形卵。其蟲卵中央有一橢圓形具有三對胚鉤的六鉤蚴，內外胚膜分開，中間含有或多或少的液體，并有顆粒狀內含物[2]。
(2)肝片吸蟲病和肺絲蟲病的判斷：
試驗有效性：陽性對照孔OD值平均值≥1.00；
陰性對照孔OD值平均值≤0.15
臨界值(Cut off)的計算：臨界值＝陰性對照孔平均值+0.15；
陰性判斷：樣品OD值＜臨界值(Cut off)，樣品為陰性；
陽性判斷：樣品OD值＞臨界值(Cut off)，樣品為陽性。
準確性：陽性對照孔OD值平均值≥1.00；陰性對照孔OD值平均值≤0.15，說明試驗結果有效。
樣品OD值大于臨界值(Cut off)時，即為該羊患有相應的寄生蟲病。
(二)實驗羊分組及飼養管理
1、實驗分組
(1)絳蟲病羊實驗分組
從確診患絳蟲病的50只羊中選30羊，分成3個組——空白對照組、西藥治療組和中草藥治療組，每組10只。
(2)肝片吸蟲病羊和肺絲蟲病羊實驗分組
選60份進行ELISA檢測同時患肝片吸蟲病和肺絲蟲病的血樣相對應的21只羊，分成3個組——空白對照組、西藥治療組和中草藥治療組，每組7只。
2、實驗羊飼養管理
實驗羊選定后，按實驗要求分組，每個組關于一個預先清掃干凈的設有可臨時拆裝的漏縫木式床板的圈舍內進行舍飼，每個羊舍內有草架、料槽和飲水器。每天早晚各供一次草料，先喂精料(包谷面：麥麩：米糠：啤酒糟：豆粕＝58：13：14：8：7)，后喂青草料，以羊剛好吃飽即完，不剩余料為宜。青草料為人工栽培草皇竹草、燕麥和以芭茅為主的野生雜草，重量對半混合。供足清潔水，自由飲用。
(三)治療方法
實驗期為20天，在實驗期內空白對照組不喂任何驅蟲藥物；西藥治療組用吡喹酮+阿苯噠唑混合劑(1：1)估計實驗羊的活重每天按說明用量的1倍即150克，于實驗第一天開始，將藥物用水溶解，拌入精料飼喂，于早上喂一次，連喂3天后停藥；中草藥治療組以大通塔根皮1kg加水2.5kg，先在大火中煮沸，然后微火保持最低沸騰狀態熬1h，將棄藥渣后藥湯拌入精料投喂，每天早上喂一次，連喂3天后停藥。
(四)治效結果
1、絳蟲病治療效果實驗
(1)10—15d后，空白對照組的羊的膘情總體上沒有變化，仍然表現為被毛粗亂、卷曲、無光澤，消瘦，有的羊排出糞便還帶有肉眼可見的幼蟲；西藥治療組和中藥治療組的羊的膘情逐漸好轉，被毛開始發亮，實驗前排糞成團或拉稀的羊，排糞成分散的顆粒狀，羊只之間愛打斗。
(2)對鏡檢結果采用質量性狀計數法進行統計結果如下：
表1：大通塔治療羊絳蟲病效果統計表
注：打“√”的檢測到成蟲、幼蟲或蟲卵；打“×”的沒有檢測到成蟲、幼蟲或蟲卵。
表1中，經過治療后，空白對照組中9只羊還查到蟲卵，僅有1只羊未查到蟲卵；西藥治療組有8只羊未查到蟲卵，中藥治療組有9只羊未查到蟲卵。經顯著性檢驗表明：西藥治療組在治療前后結果差異顯著；中藥治療組在治療前后結果差異顯著；西藥治療組和中藥治療組差異不顯著。
2、肝片吸蟲病和肺絲蟲病治療效果實驗
(1)10-15d后，空白對照組的羊的膘情總體上沒有變化，仍然表現為被毛粗亂、卷曲、無光澤，消瘦，經常咳嗽，噴鼻，甩頭，有時抽搐，空口磨牙，口流白沫，頭后仰，粘膜蒼白，放牧時行走緩慢，采食逐漸減少，拉稀，患病嚴重的羊，其眼皮、下顎、胸部、腹部呈水腫現象；西藥治療組和中藥治療組的羊，有部分羊的膘情逐漸好轉，被毛開始發亮，羊只之間愛打斗。
(2)對ELISA檢測結果采用質量性狀計數法進行統計結果如下：
表2：大通塔治療羊肝片吸蟲病和肺絲病結果統計表
注：“+”表示ELISA檢測結果呈陽性；“—”表示ELISA檢測結果呈陰性
表2中，經過治療后，空白對照組中肝片吸蟲和肺絲蟲的檢測全部呈陽性，說明空白組中所有羊都還有肝片吸蟲和肺絲蟲。西藥治療組中，肝片吸蟲病經治療后，有6只羊呈陰性，說明已經治愈，僅有一只呈陽性，未治愈；肺絲蟲病經治療后，有6只羊呈陰性，說明已經治愈，僅有一只呈陽性，未治愈；中藥治療組中，肝片吸蟲病經治療后，7只羊均呈陰性，說明全部治愈；肺絲蟲病經治療后，有3只羊呈陰性，說明已經治愈，有4只呈陽性，未治愈。
經顯著性檢驗表明：
①肝片吸蟲病治療效果實驗中，西藥治療組在治療前后結果差異顯著；中藥治療組在治療前后結果差異顯著；西藥治療組和中藥治療組差異不顯著。
②肺絲蟲病治療效果實驗中，西藥治療組在治療前后結果差異顯著；中藥治療組在治療前后結果差異不顯著；西藥治療組和中藥治療組差異顯著。
結論
大通塔提取物在治療絳蟲病和肝片吸蟲病效果理想，治療肺絲蟲病時，有些羊治療有效好，有些羊治療無效。
發明人發現了大通塔提取物具有治療羊體內蠕蟲病的效用，特別是針對治療絳蟲病和肝片吸蟲病效果理想，而對于肺絲蟲病也具有一定療效，本發明的成本低廉，來源廣泛，毒副作用小。
具體實施方式
本發明的實施例：大通塔提取物在制備治療羊體內蠕蟲病藥物中的應用，將大通塔的根皮1kg加水2.5kg，將加水藥物在大火中煮沸，然后文火保持最低沸騰狀態熬煮1h，濾掉藥渣后，獲得的藥湯即為大通塔提取物。藥湯拌入精料投喂，每天早上喂一次，連喂3天后停藥。