用于小體積施用的同種異型選擇的抗體的超濾濃縮的制作方法

本申請是分案申請，其母案的中國申請號是201280020130.0，國際申請號是pct/us2012/035980，申請日是2012年5月1日。

發明人：lizeng、rohinimitra、edmunda.rossi、hansj.hansen、davidm.goldenberg

相關申請

本申請根據美國法典第35篇第119條(e)款要求2011年5月2日提交的臨時美國專利申請序號61/481,489和2011年7月20日提交的臨時美國專利申請序號61/509,850的權益。

序列表

本申請含有一個序列表，所述序列表已經由申請系統(efs-web)以ascii格式提交并且特此以引用的方式整體并入。于2012年4月27日創建的所述ascii副本命名為imm332wo.txt并且大小為26,386字節。

本發明涉及免疫球蛋白、抗體和/或抗原結合抗體片段的穩定的、高度濃縮的制劑的組合物和生產方法以及用途。在優選的實施方案中，免疫球蛋白、抗體或其片段可以是非特異性的人免疫球蛋白(例如，ivig)；結合抗原的抗體，如結合cd22的抗體(例如，依帕珠單抗(epratuzumab))、結合cd20的抗體(例如，維妥珠單抗(veltuzumab)；ga101)、結合cd74的抗體(例如，米拉珠單抗(milatuzumab))或結合hla-dr的抗體(例如，immu-114或hl243)，雖然可以使用對抗其它抗原性靶標的抗體。在更優選的實施方案中，抗體或其片段的同種異型被選擇為非g1m1人同種異型，如g1m3。甚至更優選的是ng1m1,2無效同種異型。抗體或其片段可以是裸露的(未綴合的)或可以與至少一種治療劑或診斷劑綴合，所述治療劑或診斷劑不是細胞毒性劑或放射性核素。濃縮的抗體制劑對各種疾病的治療有用，所述疾病如自身免疫性疾病、免疫失調疾病、感染性疾病、癌癥(例如，癌瘤、肉瘤、黑素瘤、神經膠質瘤、成神經細胞瘤、淋巴瘤、白血病、慢性淋巴細胞性白血病、濾泡性淋巴瘤、彌漫性大b-細胞淋巴瘤、t-細胞淋巴瘤或白血病、多發性骨髓瘤或非霍奇金淋巴瘤)、心血管疾病、神經疾病或代謝疾病。在其它的優選實施方案中，濃縮的抗體制劑可以通過皮下施用、肌肉內施用或經皮膚施用來施用，雖然涵蓋其它的施用方式(例如，鞘內、腹膜內、眼內、顱內等等)。在最優選的實施方案中，抗體或其片段在微酸性的水性緩沖溶液中被濃縮到至少80mg/ml、更優選地至少100mg/ml、更優選地至少125mg/ml、更優選地至少150mg/ml、更優選地至少175mg/ml、更優選地至少200mg/ml、更優選地至少225mg/ml、更優選地至少250mg/ml、更優選地至少300mg/ml。所述制劑的其它組分可以包括：緩沖劑，如檸檬酸鹽或磷酸鹽；鹽，如氯化鈉；表面活性劑，如聚山梨酯80；和/或多元醇，如甘露醇。

背景技術：

已經提議施用單克隆抗體或其片段用于診斷和/或治療各種各樣的疾病狀態，如癌癥、感染性疾病、自身免疫或免疫功能障礙疾病、神經疾病、心血管疾病以及代謝疾病。(參見，例如nadler等,1980,cancerres40:3147-54；ritz和schlossman,1982,blood59:1-11；waldmann,2003,naturemed9:269-77；ibbotson等,2003,amjcardiovascdrugs3:381-86；domer等,2009,natrevrheumatol5:433-41；pul等,2011,expertopinbiolther11:343-57)。還具體來說通過皮下注射而使用人免疫球蛋白混合物用于治療肝炎以及通過靜脈內輸注用于治療各種自身免疫性疾病(參見，例如powell等,2006,clintransplant20:524-25；stiehm,1997,pediatrinfectdisj16:696-707；zandman等,clinrevallergyimmunol[2011年7月6日的印刷前電子出版物]；kaveri等,2011,clinexpimmunol164:2-5)。

雖然靜脈內輸注已經是抗體施用的標準方式，但是輸注相關的反應(如皮疹、蕁麻疹、紅斑、瘙癢、低血壓、支氣管痙攣或過敏)可能是嚴重的并且會明顯限制抗體輸注的速率。(參見，例如kang和saif,2007.jsupportiveoncol5:451-57；vogel,2010,clinjoncolnursing14:e10-21)。在某種程度上為了解決輸注相關反應的發生，已經提議皮下施用治療性抗體(lundin等,2002,blood100:768-73；kavanaugh等,arthritisrheum,2009,60:976-86；negrea等,2011,haematologica96:567-73)。還給出肌肉內施用，如對于ivig而言(marzano等,2010,minervamed101:373-83；pauwelyn等,2010,transplantproc42:4399-402；filipponi等,2010,digliverdis42:509-14)。另一種替代方案是經皮膚施用(例如，burton等,2011,pharmres28:31-40；wendorf等,2011,pharmres28:22-30；koutsonanos等,2009,plosone4:e4773)。雖然輸注部位反應可能仍然發生，但是皮下施用、肌肉內施用或經皮膚施用將通過避免對長時間的靜脈內施用及專用的輸注套房和工作人員的需要而產生減少的醫療保健成本，并且還可能減少全身性輸注反應的發生(lundin等,2002.blood100:768-73；wasserman,2008,patientpreferenceandadherence,2:163-66；negrea等,2011,haematologica96:567-73)，以及是對患者更耐受和方便的(包括自我施用的可能性)。因為與皮下施用、肌肉內施用或經皮膚施用相關的較低注射體積，所以存在對長期穩定的并且可以被皮下施用、肌肉內施用或經皮膚施用(或通過要求小體積注射液的其它路徑而施用)的更濃縮的抗體或免疫球蛋白制劑的需要。

技術實現要素：

本發明涉及治療性免疫球蛋白、單克隆抗體或其抗原結合片段的穩定的、高度濃縮的制劑的組合物和生產方法以及用途；和用于低體積注射的用途。雖然本領域中已知許多的抗體生產方法并且可以使用這些方法，但優選地是將編碼抗體或片段的表達載體轉染至哺乳動物細胞系如speee、spesf或spesf-x中(參見，例如美國專利號：7,531,327；7,537,930；7,608,425；以及7,785,880；每一個所述專利的實施例部分以引用的方式并入本文)。更優選地，轉染和抗體表達均發生在無血清的培養基中，以減小生產費用并且去除污染性蛋白質源。將抗體產生至細胞培養基中，用于進一步純化。

在其它的優選實施方案中，可以通過連續色譜法、例如通過親和柱色譜法和離子交換柱色譜法而從細胞培養基中純化所述抗體。非限制性的實例包括在蛋白質a上的親和色譜法、在q-sepharose?上的陰離子交換色譜法以及在sp-sepharose?上的陽離子交換色譜法。更優選地，使抗體在ph5的檸檬酸鹽緩沖液中結合至sp-sepharose?樹脂，并且用含0.15mnacl的ph6的檸檬酸鹽緩沖液從柱上洗脫下來。來自sp-sepharose?柱的洗出液可以通過例如用于病毒去除的20nm過濾器來過濾。純化的抗體然后可以例如使用具有50kdmw截止過濾器的amicon?超濾單元來滲濾，以便將培養基交換成高濃度制劑緩沖液(hcf緩沖液)并且濃縮抗體用于儲存。在最優選的實施方案中，hcf緩沖溶液可以包含磷酸鹽緩沖液(ph5.2)、氯化鈉、聚山梨酯80、檸檬酸鹽以及甘露醇。聚山梨酯80用來減少蛋白質聚集，而甘露醇使抗體在水性培養基中穩定。滲濾將抗體濃縮至優選地至少80mg/ml、更優選地至少100mg/ml、更優選地至少150mg/ml、更優選地至少200mg/ml、更優選地至少300mg/ml的最終濃度。濃縮的抗體展現出少的聚集或沒有聚集，并且優選地在2℃至8℃下呈液體形式穩定至少10個月。在甚至更優選的實施方案中，聚山梨酯80在超濾步驟之后被添加至濃縮的抗體中。

穩定的、高度濃縮的抗體具有用于制備用于優選地通過皮下施用、經皮膚施用或肌肉內施用而向受試者施用的藥劑的用途。然而，熟練的技術人員將認識到本領域中已知的其它施用形式，如可以使用靜脈內施用、腹膜內施用、心室內施用、眼內施用和/或鞘內施用。

有用的抗體可以結合本領域中已知的任何疾病相關的抗原。在疾病狀態例如是癌癥的情況下，許多由腫瘤細胞表達或以另外的方式與腫瘤細胞相關的抗原是本領域中已知的，所述抗原包括但不限于：碳酸酐酶ix、α-胎蛋白、α-輔肌動蛋白-4、a3、對a33抗體有特異性的抗原、art-4、b7、ba733、bage、bre3-抗原、ca125、camel、cap-1、casp-8/m、cccl19、cccl21、cd1、cd1a、cd2、cd3、cd4、cd5、cd8、cd11a、cd14、cd15、cd16、cd18、cd19、cd20、cd21、cd22、cd23、cd25、cd29、cd30、cd32b、cd33、cd37、cd38、cd40、cd40l、cd45、cd46、cd52、cd54、cd55、cd59、cd64、cd66a-e、cd67、cd70、cd70l、cd74、cd79a、cd80、cd83、cd95、cd126、cd132、cd133、cd138、cd147、cd154、cdc27、cdk-4/m、cdkn2a、cxcr4、cxcr7、cxcl12、hif-1α、結腸特異性抗原p(csap)、cea(ceacam5)、ceacam6、c-met、dam、egfr、egfrviii、egp-1、egp-2、elf2-m、ep-cam、flt-1、flt-3、葉酸鹽受體、g250抗原、gage、gp100、grob、hla-dr、hm1.24、人絨毛膜促性腺激素(hcg)和它的亞基、her2/neu、hmgb-1、缺氧誘導因子(hif-1)、hsp70-2m、hst-2、ia、igf-1r、ifn-γ、ifn-α、ifn-β、il-2、il-4r、il-6r、il-13r、il-15r、il-17r、il-18r、il-6、il-8、il-12、il-15、il-17、il-18、il-23、il-25、胰島素樣生長因子-1(igf-1)、kc4-抗原、ks-1-抗原、ks1-4、le-y、ldr/fut、巨噬細胞游走抑制因子(mif)、mage、mage-3、mart-1、mart-2、ny-eso-1、trag-3、mcrp、mcp-1、mip-1a、mip-1b、mif、muc1、muc2、muc3、muc4、muc5、muc13、muc16、mum-1/2、mum-3、nca66、nca95、nca90、胰腺癌粘蛋白、胎盤生長因子、p53、plagl2、前列腺酸性磷酸酶、psa、prame、psma、plgf、ilgf、ilgf-1r、il-6、il-25、rs5、rantes、t101、sage、s100、存活素、存活素-2b、tac、tag-72、腱生蛋白、trail受體、tnf-α、tn抗原、thomson-friedenreich抗原、腫瘤壞死抗原、trop-2、vegfr、ed-b纖連蛋白、wt-1、17-1a-抗原、補體因子c3、補體因子c3a、補體因子c3b、補體因子c5a、補體因子c5、血管生成標記物、bcl-2、bcl-6、kras、cmet、致癌基因標記物以及致癌基因產物(參見，例如sensi等,clincancerres2006,12:5023-32；parmiani等,jimmunol2007,178:1975-79；novellino等,cancerimmunolimmunother2005,54:187-207)。優選地，抗體結合cd74、cd20、cd22或hla-dr。

可以使用的示例性抗體包括但不限于：hr1(抗igf-1r，2010年3月12日提交的美國專利申請序號12/722,645)、hpam4(抗粘蛋白，美國專利號7,282,567)、ha20(抗cd20，美國專利號7,251,164)、ha19(抗cd19，美國專利號7,109,304)、himmu31(抗afp，美國專利號7,300,655)、hll1(抗cd74，美國專利號7,312,318)、hll2(抗cd22，美國專利號7,074,403)、hmu-9(抗csap，美國專利號7,387,773)、hl243(抗hla-dr，美國專利號7,612,180)、hmn-14(抗ceacam5，美國專利號6,676,924)、hmn-15(抗ceacam6，美國專利號7,541,440)、hrs7(抗egp-1，美國專利號7,238,785)、hmn-3(抗ceacam6，美國專利號7,541,440)、ab124和ab125(抗cxcr4，美國專利號7,138,496)，每一個引用的專利或申請的實施例部分以引用的方式并入本文。更優選地，抗體是ha20(維妥珠單抗)、hll2(依帕珠單抗)、hll1(米拉珠單抗)或hl243(immu-114)。

有用的替代抗體包括但不限于：阿昔單抗(abciximab)(抗糖蛋白iib/iiia)；阿侖單抗(alemtuzumab)(抗cd52)；貝伐單抗(bevacizumab)(抗vegf)；西妥昔單抗(cetuximab)(抗egfr)；吉妥珠單抗(gemtuzumab)(抗cd33)；替伊莫單抗(ibritumomabtiuxetan)(抗cd20)；帕尼單抗(panitumumab)(抗egfr)；利妥昔單抗(rituximab)(抗cd20)；托西莫單抗(tositumomab)(抗cd20)；曲妥珠單抗(trastuzumab)(抗erbb2)；阿巴伏單抗(abagovomab)(抗ca-125)；阿德木單抗(adecatumumab)(抗epcam)；atlizumab(抗il-6受體)；貝那利珠單抗(benralizumab)(抗cd125)；cc49(抗tag-72)；ab-pg1-xg1-026(抗psma，美國專利申請11/983,372，保藏為atccpta-4405和pta-4406)；d2/b(抗psma，wo2009/130575)；托珠單抗(tocilizumab)(抗il-6受體)；巴利昔單抗(basiliximab)(抗cd25)；達利珠單抗(daclizumab)(抗cd25)；依法利珠單抗(efalizumab)(抗cd11a)；ga101(抗cd20；glycartroche)；莫羅莫那-cd3(muromonab-cd3)(抗cd3受體)；那他珠單抗(natalizumab)(抗α4整聯蛋白)；奧馬珠單抗(omalizumab)(抗ige)；抗tnf-α抗體，如cdp571(ofei等,2011,diabetes45:881-85)、mtnfai、m2tnfai、m3tnfai、m3tnfabi、m302b、m303(thermoscientific,rockford,il)；英夫利昔單抗(infliximab)(centocor,malvern,pa)；塞妥珠單抗(certolizumabpegol)(ucb,brussels,belgium)；抗cd40l(ucb,brussels,belgium)；阿達木單抗(adalimumab)(abbott,abbottpark,il)；貝利單抗(benlysta)(humangenomesciences)；用于治療阿爾茨海默病的抗體，如alz50(ksiezak-reding等,1987,jbiolchem263:7943-47)、羅氏單抗(gantenerumab)、索拉珠單抗(solanezumab)以及英夫利昔單抗(infliximab)；抗纖維蛋白抗體，像59d8、t2g1s、mh1；抗hiv抗體，如p4/d10(美國專利申請序號11/745,692)、ab75、ab76、ab77(paulik等,1999,biochempharmacol58:1781-90)；以及對抗病原體的抗體，如cr6261(抗流行性感冒)、艾韋單抗(exbivirumab)(抗肝炎b)、泛維珠單抗(felvizumab)(抗呼吸道合胞體病毒)、夫瑞韋如(foravirumab)(抗狂犬病病毒)、莫維珠單抗(motavizumab)(抗呼吸道合胞體病毒)、帕利珠單抗(palivizumab)(抗呼吸道合胞體病毒)、帕諾庫單抗(panobacumab)(抗假單胞菌)、瑞非韋魯(rafivirumab)(抗狂犬病病毒)、瑞加韋單抗(regavirumab)(抗巨細胞病毒)、司韋單抗(sevirumab)(抗巨細胞病毒)、tivirumab(抗肝炎b)以及烏珠單抗(urtoxazumab)(抗大腸桿菌(e.coli))。

有用的抗體或抗原結合片段可以是嵌合的、人源化的或人的。對親本鼠抗體而言使用嵌合抗體是優選的，因為它們擁有人抗體恒定區序列并且因此不會引起像鼠抗體那樣強烈的人抗小鼠抗體(hama)反應。使用人源化的抗體是甚至更優選的，以便進一步減小誘導hama反應的可能性。用于通過用相對應的人抗體構架區和恒定區序列替換鼠構架區和恒定區序列來進行鼠抗體的人源化的技術是本領域中眾所周知的并且已經被應用于眾多的鼠抗癌癥抗體中。抗體人源化還可以涉及用相對應的來自親本鼠構架區序列的殘基置換一個或多個人構架氨基酸殘基。如下所討論，用于生產人抗體的技術也是眾所周知的。

治療性制劑可以包含抗體片段，如f(ab')2、fab、scfv、fv或使用所述f(ab')2、fab、scfv的部分或全部輕鏈和重鏈的融合蛋白。抗體還可以是多價的、或多價且多特異性的。抗體可以包括igg1、igg2a、igg3或igg4的人恒定區。

在更優選的實施方案中，抗體的同種異型可選擇為使宿主對所施用的抗體的免疫原性反應最小化，如下所更詳細地討論。優選的同種異型是非g1m1同種異型(ng1m1)，如g1m3、g1m3,1、g1m3,2或g1m3,l,2。非g1m1同種異型對抗體免疫反應性減少而言是優選的。出人意料地，未發現濃縮的ng1m1抗體的重復皮下施用誘導明顯的免疫反應，盡管皮下施用的免疫原性增強。

各種實施方案可以涉及本發明方法和組合物治療疾病的用途，所述疾病包括但不限于：非霍奇金淋巴瘤、b細胞急性和慢性淋巴白血病、伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、毛細胞白血病、急性和慢性骨髓樣白血病、t細胞淋巴瘤和白血病、多發性骨髓瘤、神經膠質瘤、華氏巨球蛋白血癥、癌瘤、黑素瘤、肉瘤、神經膠質瘤以及皮膚癌。癌瘤可以包括口腔、胃腸道、肺道、肺、乳房、卵巢、前列腺、子宮、子宮內膜、宮頸、膀胱、胰腺、骨、腦、結締組織、肝、膽囊、腎、皮膚、中樞神經系統以及睪丸的癌瘤。

另外，本發明方法和組合物可以用來治療自身免疫性疾病，例如急性免疫性血小板減少、慢性免疫性血小板減少、皮肌炎、西登哈姆氏舞蹈病、重癥肌無力、系統性紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎、風濕熱、多腺體綜合征、大皰性類天皰瘡、尋常天皰瘡、糖尿病(例如，少年糖尿病)、亨-舍二氏紫癜、鏈球菌感染后腎炎、結節性紅斑、大動脈炎、愛迪生氏病、類風濕性關節炎、多發性硬化癥、結節病、潰瘍性結腸炎、多形性紅斑、iga腎病、結節性多動脈炎、強直性脊柱炎、古德帕斯丘氏綜合征、血栓閉塞性脈管炎、斯耶格倫氏綜合征、原發性膽汁性肝硬化、橋本氏甲狀腺炎、甲狀腺毒癥、硬皮癥、慢性活動性肝炎、多肌炎/皮肌炎、多軟骨炎、尋常天皰瘡、韋格納氏肉芽腫病、膜性腎病、肌萎縮性側索硬化癥、脊髓癆、巨細胞動脈炎/多肌痛、惡性貧血、急進性腎小球腎炎、牛皮癬或纖維性肺泡炎。

在替代實施方案中，濃縮的抗體制劑可以具有治療代謝疾病(如2型糖尿病或淀粉樣變性)、心血管疾病(如動脈粥樣硬化)或神經疾病(如阿爾茨海默病)的用途。對治療此類病狀有用的抗體是本領域中已知的，如下所更詳細地討論。

在某些實施方案中，可以通過與作為本發明的一部分的一種或多種其它治療劑的聯合治療來增強疾病治療。在本發明中有用的已知治療劑包括：免疫調節劑(如細胞因子、淋巴因子、趨化因子及生長因子以及它們的抑制劑)、鞘氨醇抑制劑、激素、激素拮抗劑、寡核苷酸(如sirna或rnai)、光活性治療劑、抗血管生成劑以及促凋亡劑。其它更多的傳統治療劑(如細胞毒性藥物或放射性核素)可以在濃縮的抗體之前、與其同時或在其之后施用。

附圖說明

提供以下附圖來說明本發明的優選實施方案。然而，所要求保護的主題決不受附圖中所公開的說明性實施方案限制。

圖1.從細胞培養基中抗體的柱色譜法純化的示例性實驗方案。

圖2.超濾濃縮的抗體的sds聚丙烯酰胺凝膠電泳：(a)非還原性凝膠，(b)還原性凝膠。兩種凝膠示出(泳道1)mw標準物；(泳道2)hll1igg，起始igg溶液(10mg/ml)；(泳道3)儲存2個月之后的濃縮的hll1igg(215mg/ml)；(泳道4)ha20igg，起始igg溶液(5.1mg/ml)；(泳道5)儲存10個月之后的濃縮的ha20igg(162mg/ml)；(泳道6)hl243igg，起始igg溶液(8.9mg/ml)；(泳道7)儲存10個月之后的濃縮的hl243igg(101mg/ml)。所使用的mw標準物分別是6.5kd、14kd、21kd、31kd、45kd、66kd、97kd、116kd以及200kd。

圖3.超濾濃縮的抗體的等電聚焦凝膠示出(泳道1)pi標準物；(泳道2)hll1igg，起始igg溶液(10mg/ml)；(泳道3)儲存2個月之后的濃縮的hll1igg(215mg/ml)；(泳道4)ha20igg，起始igg溶液(5.1mg/ml)；(泳道5)儲存10個月之后的濃縮的ha20igg(162mg/ml)；(泳道6)hl243igg，起始igg溶液(8.9mg/ml)；(泳道7)儲存10個月之后的濃縮的hl243igg(101mg/ml)。所使用的mw標準物分別是6.5kd、14kd、21kd、31kd、45kd、66kd、97kd、116kd以及200kd。

圖4.儲存10個月之后的超濾濃縮的hll1igg溶液(215mg/ml)的代表性sehplc色譜圖。

圖5.儲存10個月之后的超濾濃縮的ha20igg溶液(162mg/ml)的代表性sehplc色譜圖。

圖6.儲存10個月之后的超濾濃縮的hl243igg溶液(101mg/ml)的代表性sehplc色譜圖。

圖7.維妥珠單抗(seqidno:33)與利妥昔單抗(seqidno:34)重鏈恒定區序列的比較。相同的殘基由星號表明。兩種不同的同種異型抗體的重鏈恒定區序列中僅有四個氨基酸殘基不同。這兩種抗體之間輕鏈恒定區序列是相同的。

圖8.hl243的氨基酸序列。hl243igg4p重鏈的整個可變區和恒定區序列如seqidno:37所示，其中恒定區加有下劃線。hl243igg4p重鏈的單獨恒定區序列如seqidno:38所示。hl243輕鏈的整個可變區和恒定區序列如seqidno:39所示，其中恒定區加有下劃線。hl243輕鏈的單獨恒定區序列如seqidno:40所示。

發明詳述

定義

提供以下定義有利于理解本文中的公開內容。在沒有確切定義一個術語的情況下，所述術語根據它的平常意義和普通意義來使用。

如本文中所使用，“一個(種)”和“所述”可以是指單數或復數，除非上下文另外闡明僅意指單數。

“抗體”是指全長(即，天然存在的或通過正常免疫球蛋白基因片段重組過程所形成的)免疫球蛋白分子(例如，igg抗體)；或免疫球蛋白分子的免疫活性的(即，抗原結合的)部分，像抗體片段。

“抗體片段”是抗體的一部分，如f(ab')2、f(ab)2、fab'、fab、fv、scfv、單域抗體(dab或vhh)等，包括igg4的半分子(vanderneutkolfschoten等,2007,science317:1554-1557)。無論結構如何，抗體片段與完整抗體所識別的相同抗原結合。例如，抗cd74抗體片段與cd74的表位結合。術語“抗體片段”還包括由可變區組成的分離的片段，如由重鏈和輕鏈的可變區組成的“fv”片段；重組的單鏈多肽分子，其中輕鏈可變區和重鏈可變區由肽接頭(“scfv蛋白”)連接；以及由模仿高變區的氨基酸殘基組成的最小識別單元。

“嵌合抗體”是一種重組蛋白，其含有的可變域包括來源于一種物種的抗體(優選地嚙齒動物抗體)的互補決定區(cdr)，而抗體分子的恒定域來源于人抗體的那些恒定域。對于獸醫應用而言，嵌合抗體的恒定域可以來源于其它物種(如貓或狗)的那些恒定域。

“人源化抗體”是一種重組蛋白，其中來自一種物種的抗體(例如，嚙齒動物抗體)的cdr從嚙齒動物抗體的可變重鏈和可變輕鏈轉移至人重鏈可變域和輕鏈可變域(包括人構架區(fr)序列)中。抗體分子的恒定域來源于人抗體的那些恒定域。

“人抗體”是從轉基因小鼠中獲得的抗體，所述轉基因小鼠已經被基因工程化以作為對抗原挑戰的反應而產生特異性人抗體。在此技術中，將人重鏈基因座和輕鏈基因座的元件引入至來源于胚胎干細胞系的小鼠品系中，所述胚胎干細胞系含有內源重鏈基因座和輕鏈基因座的靶向破壞。轉基因小鼠可以合成對人抗原有特異性的人抗體，并且小鼠可以用來產生分泌人抗體的雜交瘤。用于從轉基因小鼠中獲得人抗體的方法由green等,naturegenet.7:13(1994)、lonberg等,nature368:856(1994)以及taylor等,int.immun.6:579(1994)描述。完全人抗體還可以通過基因轉染或染色體轉染方法以及噬菌體展示技術來構建，所有所述方法和技術是本領域中已知的。(參見，例如mccafferty等,nature348:552-553(1990)，公開了從來自未免疫供體的免疫球蛋白可變域基因庫(repertoire)中體外產生人抗體及其片段)。在此技術中，將抗體可變域基因框內克隆至絲狀噬菌體的主要或次要外殼蛋白基因中，并且作為功能性抗體片段展示在噬菌體顆粒表面上。因為絲狀顆粒含有噬菌體基因組的單鏈dna拷貝，所以基于抗體功能性質的選擇也導致編碼展現出那些性質的抗體的基因的選擇。以此方式，噬菌體模擬b細胞的一些性質。可以在各種形式下進行噬菌體展示，對于它們的綜述，參見例如johnson和chiswell,currentopinioninstructuralbiology3:5564-571(1993)。還可以由體外活化的b細胞來產生人抗體。(參見，美國專利號5,567,610和5,229,275)。

“治療劑”是對疾病的治療有用的原子、分子或化合物。治療劑的實例包括但不限于：抗體、抗體片段、藥物、細胞因子或趨化因子抑制劑、促凋亡劑、酪氨酸激酶抑制劑、毒素、酶、核酸酶、激素、免疫調節劑、反義寡核苷酸、sirna、rnai、螯合劑、硼化合物、光活性劑、染料以及放射性同位素。

“診斷劑”是對診斷疾病有用的原子、分子或化合物。有用的診斷劑包括但不限于：放射性同位素、染料、造影劑、熒光化合物或分子以及增強劑(例如，順磁離子)。優選地，診斷劑選自由以下組成的組：放射性同位素、增強劑以及熒光化合物。

“免疫綴合物”是抗體與原子、分子或更高有序的結構(例如，與脂質體)、治療劑或診斷劑的綴合物。“裸抗體”是沒有與任何其它藥劑綴合的抗體。

“裸抗體”通常是沒有與治療劑綴合的完整抗體。之所以如此是因為抗體分子的fc部分提供效應子功能，如補體結合和adcc(抗體依賴的細胞毒性)，其使可導致細胞溶解的機制得以實施。然而，fc部分可能不是治療功能所需要的，而其它機制(如凋亡)可以得以發揮作用。裸抗體包括多克隆抗體和單克隆抗體兩者；以及某些重組抗體，如嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。

如本文中所使用，術語“抗體融合蛋白”是重組產生的抗原結合分子，其中抗體或抗體片段被連接至另一種蛋白質或肽，如相同的或不同的抗體或抗體片段或ddd肽或ad肽。融合蛋白可以包含單一抗體組分、不同抗體組分的多價或多特異性的組合或同一抗體組分的多個拷貝。融合蛋白可以另外地包含抗體或抗體片段和治療劑。適用于此類融合蛋白的治療劑的實例包括免疫調節劑和毒素。一種優選的毒素包含核糖核酸酶(rna酶)，優選地為重組rna酶。

“多特異性抗體”是可以同時結合至少兩個具有不同結構的靶標(例如，兩個不同的抗原、在同一抗原上的兩個不同表位、或半抗原和/或抗原或表位)的抗體。“多價抗體”是可以同時結合至少兩個具有相同或不同結構的靶標的抗體。價態表明抗體對單一抗原或表位具有多少個結合臂或位點；即，一價的、二價的、三價的或多價的。抗體的多價性意味著抗體可以使用多種相互作用結合抗原，從而增加結合抗原的親合力。特異性表明抗體能夠結合多少個抗原或表位；即，單特異性的、雙特異性的、三特異性的、多特異性的。使用這些定義，天然抗體(例如，igg)是二價的，因為它具有兩個結合臂，但所述抗體是單特異性的，因為它結合一個表位。多特異性的、多價的抗體是含有多于一個具有不同特異性的結合位點的構建體。

“雙特異性抗體”是可以同時結合兩個具有不同結構的靶標的抗體。雙特異性抗體(bsab)和雙特異性抗體片段(bsfab)可以具有：至少一個臂，其特異性地結合例如b細胞抗原或表位、t細胞抗原或表位、骨髓樣細胞抗原或表位、漿細胞抗原或表位以及肥大細胞抗原或表位；和至少一個其它的臂，其特異性地結合帶有治療劑或診斷劑的可靶向的綴合物。可以使用分子工程來產生各種雙特異性抗體。

單克隆抗體的制備

本文中所描述的組合物、制劑以及方法可以包括單克隆抗體。特定抗原的嚙齒動物單克隆抗體可以通過本領域技術人員已知的方法來獲得。(參見，例如kohler和milstein,nature256:495(1975)，和coligan等,(編著),currentprotocolsinimmunology,第1卷,第2.5.1-2.6.7頁(johnwiley&sons1991))。用于克隆鼠免疫球蛋白可變域的一般技術已經例如由orlandi等,proc.nat'lacad.sci.usa86:3833(1989)的出版物公開。

嵌合抗體

嵌合抗體是一種重組蛋白，其含有的可變域包括來源于一種動物物種(如嚙齒動物抗體)的cdr，而抗體分子的其余部分(即恒定域)來源于人抗體。用于構建嵌合抗體的技術是本領域技術人員眾所周知的。例如，leung等,hybridoma13:469(1994)公開了他們如何通過使編碼ll2單克隆抗體(抗cd22抗體)的vk和vh域的dna序列與對應的人恒定區結構域和igg1恒定區結構域組合來產生ll2嵌合體。此出版物還分別提供了ll2輕鏈可變區和重鏈可變區(vk和vh)的核苷酸序列。

人源化抗體

嵌合單克隆抗體可以通過用一個或多個不同的人fr替換嵌合抗體可變域中的鼠fr的序列來人源化。確切地說，將小鼠cdr從小鼠免疫球蛋白的可變重鏈和可變輕鏈轉移至相對應的人抗體的可變域中。因為簡單地將小鼠cdr轉移至人fr中經常導致抗體親和力的減少或甚至喪失，所以可能要求額外的修飾以便恢復鼠抗體的原始親和力。這可以通過將fr區中的一個或多個某些人殘基用它們的鼠對應物替換以獲得對其表位擁有良好結合親和力的抗體來完成。(參見，例如tempest等,biotechnology9:266(1991)和verhoeyen等,science239:1534(1988))。用于產生人源化抗體的技術例如由jones等,nature321:522(1986)、riechmann等,nature332:323(1988)、verhoeyen等,science239:1534(1988)、carter等,proc.nat'lacad.sci.usa89:4285(1992),sandhu,crit.rev.biotech.12:437(1992)以及singer等,j.immun.150:2844(1993)公開。

人抗體

完全人抗體可以從轉基因的非人動物中獲得。(參見，例如mendez等,naturegenetics,15:146-156,1997；美國專利號5,633,425)。用于使用組合方法或被人免疫球蛋白基因座轉化的轉基因動物來產生完全人抗體的方法是本領域中已知的(例如，mancini等,2004,newmicrobiol.27:315-28；conrad和scheller,2005,comb.chem.highthroughputscreen.8:117-26；brekke和loset,2003,curr.opin.pharmacol.3:544-50；每個文獻以引用的方式并入本文)。此類完全人抗體預計展現出比嵌合抗體或人源化抗體甚至更少的副作用，并且在體內用作基本上內源性的人抗體。在某些實施方案中，所要求保護的方法和工序可以使用由此類技術產生的人抗體。

在一種替代方案中，噬菌體展示技術可以用來產生人抗體(例如，dantas-barbosa等,2005,genet.mol.res.4:126-40，所述文獻以引用的方式并入本文)。還可以從正常的人或從展現出特定疾病狀態(如癌癥)的人中產生人抗體(dantas-barbosa等,2005)。從患病的個體中構建人抗體的優點是：可以使循環抗體庫偏向于對抗疾病相關抗原的抗體。

在此方法的一個非限制性實例中，dantas-barbosa等(2005)從骨肉瘤患者中構建了人fab抗體片段的噬菌體展示文庫。通常，從循環血液淋巴細胞中獲得總rna(同上)。從μ、γ以及κ鏈抗體庫克隆重組的fab并且將其插入至噬菌體展示文庫中(同上)。使用針對重鏈和輕鏈免疫球蛋白序列的特異性引物，將rna轉變為cdna并且用來制作fabcdna文庫(marks等,1991,j.molbiol.222:581-97)。根據andris-widhopf等(2000年，在phagedisplaylaboratorymanual,barbas等(編著),第1版,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,ny第9.1至9.22頁中所述，所述文獻以引用的方式并入本文)進行文庫構建。用限制性核酸內切酶消化最終的fab片段并且插入至噬菌體基因組中，以制作噬菌體展示文庫。此類文庫可以通過標準的噬菌體展示方法來篩選。熟練的技術人員將認識到此技術僅是示例性的，并且可以使用任何用于通過噬菌體展示而制作和篩選人抗體或抗體片段的已知方法。

在另一種替代方案中，使用如上所討論的標準免疫實驗方案，已經被基因工程化以產生人抗體的轉基因動物可以用來產生對抗基本上任何免疫原性靶標的抗體。用于從轉基因小鼠中獲得人抗體的方法由green等,naturegenet.7:13(1994)、lonberg等,nature368:856(1994)以及taylor等,int.immun.6:579(1994)描述。這樣一個系統的非限制性實例是來自abgenix(fremont,ca)的xenomouse?(例如，green等,1999,j.immunol.methods231:11-23，所述文獻以引用的方式并入本文)。在xenomouse?和類似的動物中，小鼠抗體基因已經被滅活并且被功能性人抗體基因替換，而小鼠免疫系統的其余部分保持完整。

用含有人igh和igκ基因座的部分的種系配置的yac(酵母人工染色體)來轉化xenomouse?，所述基因座部分包括大部分可變區序列連同附屬基因和調控序列。人可變區庫可以用來獲得產抗體的b細胞，所述b細胞可以通過已知的技術加工成雜交瘤。用靶標抗原免疫的xenomouse?將通過正常的免疫反應產生人抗體，所述人抗體可以通過以上討論的標準技術收獲和/或產生。可獲得多種xenomouse?品系，其中每一種都能夠產生不同類別的抗體。已經顯示轉基因產生的人抗體具有治療潛力，同時保持正常人抗體的藥物代謝動力學性質(green等,1999)。熟練的技術人員將認識到所要求保護的組合物和方法不限于使用xenomouse?系統，而是可以使用任何已經被基因工程化以產生人抗體的轉基因動物。

抗體克隆和產生

各種技術(如嵌合或人源化抗體的產生)可以涉及抗體克隆和構建的工序。感興趣的抗體的抗原結合vκ(可變輕鏈)和vh(可變重鏈)序列可以通過各種分子克隆工序(如rt-pcr、5’-race以及cdna文庫篩選)來獲得。來自表達鼠抗體的細胞的抗體的v基因可以通過pcr擴增來克隆并且測序。為了證實其真實性，可以將克隆的vl和vh基因在細胞培養物中表達為嵌合抗體，如由orlandi等(proc.natlacadsci,usa,86:3833(1989))所描述。基于v基因序列，然后可以設計并且構建人源化抗體，如由leung等(mol.immunol.,32:1413(1995))所描述。

cdna可以通過一般的分子克隆技術由任何已知的產生鼠抗體的雜交瘤系或轉染細胞系制備(sambrook等,molecularcloning,alaboratorymanual,第2版(1989))。可以使用引物vk1back和vk1for(orlandi等,1989)或由leung等(biotechniques,15:286(1993))描述的延伸的引物組來擴增抗體的vκ序列。可以使用引物對vh1back/vh1for(orlandi等,1989)或由leung等(hybridoma,13:469(1994))描述的與鼠igg的恒定區退火的引物來擴增vh序列。可以通過長寡核苷酸模板合成與pcr擴增的組合來構建人源化v基因，如由leung等(mol.immunol.,32:1413(1995))所描述。

可以將vκ的pcr產物亞克隆進入分期載體(stagingvector)，如基于pbr327的分期載體(vkpbr)，所述分期載體含有ig啟動子、信號肽序列以及適宜的限制位點。可以將vh的pcr產物亞克隆進入類似的分期載體，如基于pbluescript的vhpbs。含有vκ和vh序列連同啟動子和信號肽序列一起的表達盒可以從vkpbr和vhpbs中切除并且分別連接入適當的表達載體，如pkh和pg1g(leung等,hybridoma,13:469(1994))。可以將表達載體共轉染進入適當的細胞并且監測上清液中嵌合、人源化或人抗體的產生。或者，可以切除vκ和vh表達盒并且亞克隆進入單一表達載體，如pdhl2，如由gillies等(j.immunol.methods125:191(1989))所描述并且還在losman等,cancer,80:2660(1997)中所示。

在一個替代實施方案中，表達載體可以被轉染進入已經在無血清培養基中預適應轉染、生長以及表達的宿主細胞。可以使用的示例性細胞系包括sp/eee、sp/esf以及sp/esf-x細胞系(參見，例如美國專利號7,531,327；7,537,930以及7,608,425；每一個所述專利的實施例部分以引用的方式并入本文)。這些示例性細胞系基于sp2/0骨髓瘤細胞系、用突變型bcl-eee基因轉染、暴露于甲氨蝶呤以擴增轉染的基因序列并且預適應無血清細胞系以用于蛋白質表達。

抗體同種異型

治療性抗體的免疫原性與輸注反應風險增加和治療性反應的持續時間減少相關(baert等,2003,nengljmed348:602-08)。治療性抗體在宿主中誘導免疫反應的程度可以部分地通過抗體的同種異型來確定(stickler等,2011,genesandimmunity12:213-21)。抗體同種異型與抗體的恒定區序列中特定位置上的氨基酸序列變化相關。含有重鏈γ-型恒定區的igg抗體的同種異型命名為gm同種異型(1976,jimmunol117:1056-59)。

對于常見的igg1人抗體而言，最普遍的同種異型是g1m1(stickler等,2011,genesandimmunity12:213-21)。然而，g1m3同種異型也頻繁地出現在白種人(caucasians)中(同上)。已經報道了當向非g1m1(ng1m1)接受者(如g1m3患者)施用時，g1m1抗體含有傾向于誘導免疫反應的同種異型序列(同上)。當向g1m1患者施用時，非g1m1同種異型抗體不是作為免疫原性的(同上)。

人g1m1同種異型包含重鏈igg1的ch3序列中的kabat位置356上的氨基酸天冬氨酸和kabat位置358上的亮氨酸。ng1m1同種異型包含kabat位置356上的氨基酸谷氨酸和kabat位置358上的甲硫氨酸。g1m1和ng1m1同種異型兩者均包含kabat位置357上的谷氨酸殘基，并且所述同種異型有時稱為del和eem同種異型。針對示例性抗體利妥昔單抗(seqidno:34)和維妥珠單抗(seqidno:33)，在圖7中顯示出g1m1和ng1m1同種異型抗體的重鏈恒定區序列的非限制性實例。

jefferis和lefranc(2009,mabs1:1-7)綜述了作為igg同種異型的特征的序列變化和它們對免疫原性的影響。他們報道了與g1m17同種異型中的kabat214上的賴氨酸殘基相比，g1m3同種異型的特征在于kabat位置214上的精氨酸殘基。ng1m1,2同種異型的特征在于kabat位置356上的谷氨酸、kabat位置358上的甲硫氨酸以及kabat位置431上的丙氨酸。g1m1,2同種異型的特征在于kabat位置356上的天冬氨酸、kabat位置358上的亮氨酸以及kabat位置431上的甘氨酸。除了重鏈恒定區序列變體之外，jefferis和lefranc(2009)報道了κ輕鏈恒定區中的同種異型變體，其中km1同種異型的特征在于kabat位置153上的纈氨酸和kabat位置191上的亮氨酸，km1,2同種異型的特征在于kabat位置153上的丙氨酸和kabat位置191上的亮氨酸，并且km3同種異型的特征在于kabat位置153上的丙氨酸和kabat位置191上的纈氨酸。

對于治療性抗體而言，維妥珠單抗和利妥昔單抗分別是對治療各種各樣血液惡性腫瘤和/或自身免疫性疾病有用的、對抗cd20的人源化和嵌合igg1抗體。表1比較了利妥昔單抗與維妥珠單抗的同種異型序列。如在表1和圖7中所示，利妥昔單抗(g1m17,1)是del同種異型igg1，在利妥昔單抗中的賴氨酸相對維妥珠單抗中的精氨酸在kabat位置214(重鏈ch1)上具有額外序列變化。已經報道了在受試者中維妥珠單抗比利妥昔單抗的免疫原性小(參見，例如morchhauser等,2009,jclinoncol27:3346-53；goldenberg等,2009,blood113:1062-70；robak&robak,2011,biodrugs25:13-25)，這種作用已經被歸因于人源化抗體與嵌合抗體之間的差異。然而，eem與del同種異型之間的同種異型差異也可能解釋維妥珠單抗的更低免疫原性。

表1.利妥昔單抗對維妥珠單抗的同種異型

為了減小治療性抗體在ng1m1基因型個體中的免疫原性，希望選擇的抗體同種異型對應于g1m3同種異型，其特征在于kabat214上的精氨酸；和ng1m1,2無效同種異型，其特征在于kabat位置356上的谷氨酸、kabat位置358上的甲硫氨酸以及kabat位置431上的丙氨酸。出人意料地，發現重復皮下施用g1m3抗體經過很長一段時間并不會導致明顯的免疫反應。在替代實施方案中，與g1m3同種異型一樣的人igg4重鏈具有kabat214上的精氨酸、kabat356上的谷氨酸、kabat359上的甲硫氨酸以及kabat431上的丙氨酸。因為免疫原性看起來似乎至少部分地與那些位置上的殘基相關，所以對于治療性抗體的人igg4重鏈恒定區序列的使用也是一個優選的實施方案。g1m3igg1抗體與igg4抗體的組合也可以是對治療性施用有用的。

已知的抗體

在各種實施方案中，所要求保護的方法和組合物可以使用任何本領域中已知的各種抗體。有用的抗體可以從眾多已知的來源商業獲得。例如，從美國模式培養物保藏所(atcc,manassas,va)可獲得各種分泌抗體的雜交瘤系。對抗各種疾病靶標(包括但不限于腫瘤相關的抗原)的許多抗體已經被保藏在atcc中和/或已經公布了可變區序列并且可供使用在所要求保護的方法和組合物中。參見，例如美國專利號：7,312,318；7,282,567；7,151,164；7,074,403；7,060,802；7,056,509；7,049,060；7,045,132；7,041,803；7,041,802；7,041,293；7,038,018；7,037,498；7,012,133；7,001,598；6,998,468；6,994,976；6,994,852；6,989,241；6,974,863；6,965,018；6,964,854；6,962,981；6,962,813；6,956,107；6,951,924；6,949,244；6,946,129；6,943,020；6,939,547；6,921,645；6,921,645；6,921,533；6,919,433；6,919,078；6,916,475；6,905,681；6,899,879；6,893,625；6,887,468；6,887,466；6,884,594；6,881,405；6,878,812；6,875,580；6,872,568；6,867,006；6,864,062；6,861,511；6,861,227；6,861,226；6,838,282；6,835,549；6,835,370；6,824,780；6,824,778；6,812,206；6,793,924；6,783,758；6,770,450；6,767,711；6,764,688；6,764,681；6,764,679；6,743,898；6,733,981；6,730,307；6,720,155；6,716,966；6,709,653；6,693,176；6,692,908；6,689,607；6,689,362；6,689,355；6,682,737；6,682,736；6,682,734；6,673,344；6,653,104；6,652,852；6,635,482；6,630,144；6,610,833；6,610,294；6,605,441；6,605,279；6,596,852；6,592,868；6,576,745；6,572,856；6,566,076；6,562,618；6,545,130；6,544,749；6,534,058；6,528,625；6,528,269；6,521,227；6,518,404；6,511,665；6,491,915；6,488,930；6,482,598；6,482,408；6,479,247；6,468,531；6,468,529；6,465,173；6,461,823；6,458,356；6,455,044；6,455,040；6,451,310；6,444,206；6,441,143；6,432,404；6,432,402；6,419,928；6,413,726；6,406,694；6,403,770；6,403,091；6,395,276；6,395,274；6,387,350；6,383,759；6,383,484；6,376,654；6,372,215；6,359,126；6,355,481；6,355,444；6,355,245；6,355,244；6,346,246；6,344,198；6,340,571；6,340,459；6,331,175；6,306,393；6,254,868；6,187,287；6,183,744；6,129,914；6,120,767；6,096,289；6,077,499；5,922,302；5,874,540；5,814,440；5,798,229；5,789,554；5,776,456；5,736,119；5,716,595；5,677,136；5,587,459；5,443,953；5,525,338，每一個所述專利的實施例部分以引用的方式并入本文。這些抗體僅是示例性的并且各種各樣的其它抗體和它們的雜交瘤是本領域中已知的。熟練的技術人員將認識到，可以通過簡單研究對抗感興趣的選擇的疾病相關靶標的抗體的atcc、ncbi和/或uspto數據庫來獲得對抗幾乎任何疾病相關抗原的抗體序列或分泌抗體的雜交瘤。使用本領域中眾所周知的標準技術，可以將克隆抗體的抗原結合域擴增、切除、連接入表達載體中、轉染進入適應的宿主細胞中并且用于蛋白質產生(參見，例如美國專利號7,531,327；7,537,930；7,608,425以及7,785,880，每一個所述專利的實施例部分以引用的方式并入本文)。

在所要求保護的方法和組合物的范圍內可以對治療癌癥有用的具體抗體包括但不限于：ll1(抗cd74)、ll2和rfb4(抗cd22)、rs7(抗上皮糖蛋白-1(egp-1))、pam4和kc4(兩者均抗粘蛋白)、mn-14(抗癌胚抗原(cea，又稱為cd66e)、mu-9(抗結腸特異性抗原p)、immu31(抗α-胎蛋白)、tag-72(例如，cc49)、tn、j591或huj591(抗psma(前列腺特異性膜抗原))、ab-pg1-xg1-026(抗psma二聚體)、d2/b(抗psma)、g250(抗碳酸酐酶ix)、hl243(抗hla-dr)、阿侖單抗(抗cd52)、貝伐單抗(抗vegf)、西妥昔單抗(抗egfr)、吉妥珠單抗(抗cd33)、替伊莫單抗(抗cd20)、帕尼單抗(抗egfr)、利妥昔單抗(抗cd20)、托西莫單抗(抗cd20)、ga101(抗cd20)以及曲妥珠單抗(抗erbb2)。此類抗體是本領域中已知的(例如，美國專利號5,686,072；5,874,540；6,107,090；6,183,744；6,306,393；6,653,104；6,730.300；6,899,864；6,926,893；6,962,702；7,074,403；7,230,084；7,238,785；7,238,786；7,256,004；7,282,567；7,300,655；7,312,318；7,585,491；7,612,180；7,642,239；以及美國專利申請公布號20040202666(現在被放棄)；20050271671以及20060193865，每一個專利的實施例部分以引用的方式并入本文)。有用的具體已知的抗體包括hpam4(美國專利號7,282,567)、ha20(美國專利號7,251,164)、ha19(美國專利號7,109,304)、himmu31(美國專利號7,300,655)、hll1(美國專利號7,312,318)、hll2(美國專利號7,074,403)、hmu-9(美國專利號7,387,773)、hl243(美國專利號7,612,180)、hmn-14(美國專利號6,676,924)、hmn-15(美國專利號7,541,440)、hr1(美國專利申請12/772,645)、hrs7(美國專利號7,238,785)、hmn-3(美國專利號7,541,440)、ab-pg1-xg1-026(美國專利申請11/983,372，保藏為atccpta-4405和pta-4406)以及d2/b(wo2009/130575)，關于附圖和實施例部分，每一個列舉的專利或申請的文本以引用的方式并入本文。

抗tnf-α抗體是本領域中已知的，并且可以對治療免疫性疾病如自身免疫性疾病、免疫功能障礙(例如，移植物抗宿主疾病、器官移植排斥反應)或糖尿病有用。已知的對抗tnf-α的抗體包括：人抗體cdp571(ofei等,2011，diabetes45:881-85)；鼠抗體mtnfai、m2tnfai、m3tnfai、m3tnfabi、m302b以及m303(thermoscientific,rockford,il)；英夫利昔單抗(centocor,malvern,pa)；塞妥珠單抗(ucb,brussels,belgium)；以及阿達木單抗(abbott,abbottpark,il)。這些和許多其它已知的抗tnf-α抗體可以用于所要求保護的方法和組合物中。對治療免疫失調或自身免疫性疾病有用的其它抗體包括但不限于：抗b細胞抗體，如維妥珠單抗、依帕珠單抗、米拉珠單抗或hl243；托珠單抗(抗il-6受體)；巴利昔單抗(抗cd25)；達利珠單抗(抗cd25)；依法利珠單抗(抗cd11a)；莫羅莫那-cd3(抗cd3受體)；抗cd40l(ucb,brussels,belgium)；那他珠單抗(抗α4整聯蛋白)以及奧馬珠單抗(抗ige)。

可以使用已知的對抗b細胞抗原的抗體來治療1型糖尿病和2型糖尿病，如對抗cd22的抗體(依帕珠單抗)、對抗cd74的抗體(米拉珠單抗)、對抗cd19的抗體(ha19)、對抗cd20的抗體(維妥珠單抗)或對抗hla-dr的抗體(hl243)(參見，例如winer等,2011,naturemed17:610-18)。還已經提議將抗cd3抗體用于治療1型糖尿病(cemea等,2010，diabetesmetabrev26:602-05)。

本發明的藥物組合物可以用來治療具有代謝疾病(如淀粉樣變性)或神經退化性疾病(如阿爾茨海默病)的受試者。巴匹珠單抗(bapineuzumab)在臨床試驗中用于阿爾茨海默病的治療。提議用于治療阿爾茨海默病的其它抗體包括alz50(ksiezak-reding等,1987,jbiolchem263:7943-47)、羅氏單抗以及索拉珠單抗。已經報道英夫利昔單抗(抗tnf-α抗體)會減少淀粉樣斑塊并且改善認知力。

在一個優選的實施方案中，使用所要求保護的組合物和方法可以治療的疾病包括心血管疾病，如纖維蛋白凝塊、動脈粥樣硬化、心肌缺血以及梗塞形成。纖維蛋白的抗體(例如，scfv(59d8)；t2g1s；mh1)是已知的并且在臨床試驗中作為用于發現所述凝塊和肺栓子的顯像劑，而抗粒細胞抗體(如mn-3、mn-15、抗nca95以及抗cd15抗體)可以靶向心肌梗死和心肌缺血。(參見，例如美國專利號5,487,892；5,632,968；6,294,173；7,541,440，每一個專利的實施例部分以引用的方式并入本文)。抗巨噬細胞、抗低密度脂蛋白(ldl)、抗mif(例如，美國專利號6,645,493；7,517,523，每個專利的實施例部分以引用的方式并入本文)以及抗cd74(例如，hll1)抗體可以用來靶向動脈粥樣硬化斑塊。阿昔單抗(抗糖蛋白iib/iiia)已經被批準用于預防經皮冠狀動脈介入中的再狹窄和治療不穩定型心絞痛的輔助用途(waldmann等,2000,hematol1:394-408)。已經報道抗cd3抗體會降低動脈粥樣硬化的發展和進展(steffens等,2006,circulation114:1977-84).對抗氧化的ldl的抗體在小鼠模型中誘導了所建立的動脈粥樣硬化的消退(ginsberg,2007,jamcollcardiol52:2319-21)。已顯示抗icam-1抗體在大鼠中腦動脈閉塞之后誘導了缺血性細胞損傷(zhang等,1994,neurology44:1747-51)。白細胞抗原的商業上可獲得的單克隆抗體由以下所代表：okt抗t-細胞單克隆抗體(從ortho制藥公司可獲得)，其結合正常的t-淋巴細胞；由雜交瘤產生的單克隆抗體，所述雜交瘤具有atcc登錄號hb44、hb55、hb12、hb78以及hb2；g7ell、w8e7、nkp15以及go22(bectondickinson)；nen9.4(newenglandnuclear)；以及fmcll(seralabs)。對抗纖維蛋白和血小板抗原的抗體的描述包含在knight,semin.nucl.med.,20:52-67(1990)中。

可以使用的其它抗體包括對抗感染性疾病因子(agent)的抗體，所述感染性疾病因子如細菌、病毒、支原體或其它病原體。許多對抗此類感染性因子的抗體是本領域中已知的，并且任何此類已知的抗體可以用于所要求的方法和組合物中。例如，對抗人免疫缺陷病毒i(hiv-1)的gp120糖蛋白抗原的抗體是已知的，并且某些此類抗體可以對人具有免疫保護作用。參見，例如rossi等,proc.natl.acad.sci.usa.86:8055-8058,1990。已知的抗hiv抗體包括由johansson等(aids.2006oct3;20(15):1911-5)描述的抗包膜抗體，以及由polymun(vienna,austria)描述和出售的抗hiv抗體，還在美國專利5,831,034、美國專利5,911,989和vcelar等,aids2007;21(16):2161-2170以及joos等,antimicrob.agentschemother.2006;50(5):1773-9中描述，所有文獻以引用的方式并入本文。對抗肝炎病毒的抗體也是已知的并且可以使用(例如，dagan和eren,curropinmolther,2003,5:148-55；keck等,2008,currtopmicrobiolimmunol317:1-38；el-awady等,2006,12:2530-35)。

對抗瘧疾寄生蟲的抗體可以針對孢子體階段、裂殖子階段、裂殖體階段以及配子體階段。已經產生了對抗孢子體(環子孢子抗原)的單克隆抗體，并且已經顯示其在體外和在嚙齒動物中可中和孢子體(n.yoshida等,science207:71-73,1980)。多個小組已經開發了剛地弓形蟲(t.gondii)的抗體，所述剛地弓形蟲是弓形蟲病中所涉及到的原生動物寄生蟲(kasper等,j.immunol.129:1694-1699,1982；同上，30:2407-2412,1983)。已經開發了對抗血吸蟲表面抗原的抗體并且已經發現其在體內或在體外起對抗血吸蟲的作用(simpson等,parasitology,83:163-177,1981；smith等,parasitology,84:83-91,1982；gryzch等,j.immunol.,129:2739-2743,1982；zodda等,j.immunol.129:2326-2328,1982；dissous等,j.immunol.,129:2232-2234,1982)。

克氏錐蟲(trypanosomacruzi)是恰加斯病的致病因子，并且通過吸血的食蟲椿象科昆蟲來傳播。已經產生在體外特異性地抑制寄生蟲的一種形式向另一種形式(上鞭毛體至錐鞭毛體階段)分化的抗體，并且所述抗體與細胞表面糖蛋白反應；然而，哺乳動物(血流)形式的寄生蟲不存在此抗原(sher等,nature,300:639-640,1982)。

抗真菌抗體是本領域中已知的，如抗-核盤菌(sclerotinia)抗體(美國專利7,910,702)；抗葡萄糖醛酸木糖甘露聚糖(antiglucuronoxylomannan)抗體(zhong和priofski,1998,clindiaglabimmunol5:58-64)；抗-假絲酵母(candida)抗體(matthews和bumie,2001,2:472-76)；以及抗鞘糖脂抗體(toledo等,2010,bmcmicrobiol10:47)。

已經開發了對抗造成大部分人感染的大多數微生物(細菌、病毒、原生生物、真菌、其它寄生蟲)的適合的抗體，并且許多已經在先前用于體外診斷目的。這些抗體和可以通過常規方法產生的更新的抗體適合用于本發明。

抗體片段

可以通過已知技術來產生識別特異性表位的抗體片段。抗體片段是抗體的抗原結合部分，如f(ab)2、fab'、fab、fv、scfv等。其它抗體片段包括但不限于：f(ab')2片段，其可以通過胃蛋白酶消化抗體分子而產生；和fab'片段，其可以通過還原f(ab')2片段的二硫橋鍵而產生。或者，可以構建fab'表達文庫(huse等,1989,science,246:1274-1281)以允許快速、容易地鑒別具有希望的特異性的單克隆fab'片段。

單鏈fv分子(scfv)包含vl域和vh域。vl域和vh域締合形成靶標結合位點。這兩個域進一步通過肽接頭(l)來共價連接。用于制作scfv分子和設計適合的肽接頭的方法公開在美國專利號4,704,692、美國專利號4,946,778、r.raag和m.whitlow,“singlechainfvs.”faseb第9卷:73-80(1995)以及r.e.bird和b.w.walker,“singlechainantibodyvariableregions,”tibtech,第9卷:132-137(1991)中。

可以通過例如由goldenberg美國專利號4,036,945和4,331,647以及其中所包含的參考文獻所公開的已知方法來制備抗體片段。還參見nisonoff等,archbiochem.biophys.89:230(1960)；porter,biochem.j.73:119(1959)；edelman等在methodsinenzymology第1卷,第422頁((academicpress1967)以及coligan在第2.8.1-2.8.10和2.10.-2.10.4頁中所述。

單一互補決定區(cdr)是結構上與抗體結合的表位互補的抗體可變區的區段，并且比可變區的剩余部分更可變。因此，cdr有時被稱為高變區。可變區包含三個cdr。可以通過構建對感興趣的抗體的cdr進行編碼的基因來獲得cdr肽。此類基因例如通過使用聚合酶鏈反應以合成來自產抗體細胞的rna的可變區來制備。(參見，例如larrick等,methods:acompaniontomethodsinenzymology2:106(1991)；monoclonalantibodies:production,engineeringandclinicalapplication,ritter等(編著),第166-179頁(劍橋大學出版社1995)中的courtenay-luck,“geneticmanipulationofmonoclonalantibodies”；以及monoclonalantibodies:principlesandapplications,birch等(編著),第137-185頁(wiley-liss,inc.1995)中的ward等,“geneticmanipulationandexpressionofantibodies”)。

另一種形式的抗體片段是單域抗體(dab)，有時被稱為單鏈抗體。用于產生單域抗體的技術是本領域中眾所周知的(參見，例如cossins等,proteinexpressionandpurification,2007,51:253-59；shuntao等,molecimmunol2006,43:1912-19；tanha等,j.biol.chem.2001,276:24774-780)。

在某些實施方案中，可以改變抗體的序列(如抗體的fc部分)以優化綴合物的生理特征，如血清中的半衰期。置換蛋白質中的氨基酸序列的方法是本領域中廣泛已知的，如通過定位誘變(例如sambrook等,molecularcloning,alaboratorymanual,第2版,1989)。在優選的實施方案中，變化可以涉及在fc序列中添加或去除一個或多個糖基化位點(例如，美國專利號6,254,868，所述專利的實施例部分以引用的方式并入本文)。在其它優選的實施方案中，可以在fc序列中做出特定氨基酸置換(例如，homick等,2000,jnuclmed41:355-62；hinton等,2006,jimmunol176:346-56；petkova等,2006,intimmunol18:1759-69；美國專利號7,217,797；hwang和foote,2005,methods36:3-10；clark,2000,immunoltoday21:397-402；jimmunol1976117:1056-60；ellison等,1982,nuclacidsres13:4071-79；stickler等,2011,genesandimmunity12:213-21)。

多特異性抗體和多價抗體

用于產生雙特異性抗體的方法包括工程化重組抗體，所述重組抗體具有額外的半胱氨酸殘基以使得它們比更為常見的免疫球蛋白同種型更有力地交聯。(參見，例如fitzgerald等,proteineng.10(10):1221-1225,(1997))。另一種方法是工程化連接兩個或更多個不同的單鏈抗體或抗體片段區段的重組融合蛋白而具有所需要的雙重特異性。(參見，例如coloma等,naturebiotech.15:159-163,(1997))。可以使用分子工程來產生各種雙特異性抗體。在一種形式中，雙特異性抗體可以由以下組成：例如，用于一種抗原的具有單個結合位點的scfv；和用于第二種抗原的具有單一結合位點的fab片段。在另一種形式中，雙特異性抗體可以由以下組成：例如，用于一種抗原的具有兩個結合位點的igg；和用于第二種抗原的具有兩個結合位點的兩個scfv。在替代實施方案中，可以使用如下所描述的對接和鎖定(dnl)技術來產生多特異性和/或多價抗體。

在某些實施方案中，雙特異性抗體可以結合兩種不同的抗原，如選自由以下組成的組的抗原：cd19、cd20、cd22、cd74、cd79a、cd40l、ilgf-r1、trop2、ceacam5、cecam6、hla-dr、ifnα、il-6以及tnf-α。在以下更詳細描述的預靶向方法中有用的其它實施方案中，雙特異性抗體可以含有至少一個用于疾病相關抗原(如腫瘤相關抗原(taa))的結合位點；和至少一個用于可靶向構建體上的半抗原的結合位點。

對接和鎖定(dnl)

在優選的實施方案中，可以使用對接和鎖定技術來產生雙特異性或多特異性的抗體或其它構建體(參見，例如美國專利號7,550,143；7,521,056；7,534,866；7,527,787；7,666,400；7,858,070；7,871,622；7,906,121；7,906,118以及7,901,680，每一個所述專利的實施例部分以引用的方式并入本文)。dnl方法使用了特異性蛋白質/蛋白質相互作用，所述相互作用發生在camp依賴性蛋白激酶(pka)的調控(r)亞基與a激酶錨定蛋白(akap)的錨定域(ad)之間(baillie等,febsletters.2005;579:3264；wong和scott,nat.rev.mol.cellbiol.2004;5:959)。1968年，首次從兔骨骼肌中分離出pka，其在由第二信使camp結合r亞基而觸發的最徹底研究的信號轉導途徑之一中起關鍵作用(walsh等,j.biol.chem.1968;243:3763)。全酶的結構由兩個催化亞基組成，所述催化亞基通過r亞基而保持處于失活的形式(taylor,j.biol.chem.1989;264:8443)。發現pka的同工酶具有兩種類型的r亞基(ri和rii)，并且每種類型具有α和β同種型(scott,pharmacol.ther.1991;50:123)。因此，pka調控亞基的四種類型是riα、riβ、riiα以及riiβ。已經將r亞基僅分離為穩定的二聚體，并且已經顯示出二聚化域由前44個氨基末端殘基組成(newlon等,nat.struct.biol.1999;6:222)。camp結合r亞基造成用于廣譜絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的活性催化亞基釋放，所述活性催化亞基通過pka的區室化經由其與akap對接而面向所選擇的底物(scott等,j.biol.chem.1990;265;21561)。

自從1984年表征了第一種akap(微管相關蛋白-2)(lohmann等，proc.natl.acad.sciusa.1984;81:6723)，已經在酵母至人范圍內的物種中鑒別出50多種具有各種不同結構的akap，其定位至各種亞細胞位點，包括質膜、肌動蛋白細胞骨架、細胞核、線粒體以及內質網(wong和scott,nat.rev.mol.cellbiol.2004;5:959)。針對pka的akap的ad是具有14至18個殘基的兩親性螺旋(carr等,j.biol.chem.1991;266:14188)。ad的氨基酸序列在個別akap之之間非常不同，其中針對rii二聚體所報道的結合親和力在2nm至90nm范圍內(alto等,proc.natl.acad.sci.usa.2003;100:4445)。akap將僅結合二聚r亞基。對于人riiα而言，ad結合由23個氨基末端殘基形成的疏水性表面(colledge和scott,trendscellbiol.1999;6:216)。因此，人riiα的二聚化域和akap結合域兩者均位于同一n-末端44個氨基酸序列內(newlon等,nat.struct.biol.1999;6:222；newlon等,emboj.2001;20:1651)，所述44個氨基酸序列在本文中稱為ddd。

我們已經開發了一種平臺技術以使用人riα、riβ、riiα或riiβ的ddd和akap的ad作為優良的接頭模塊對用于將任何兩個實體(下文中稱為a和b)對接為非共價復合體，所述非共價復合體可以通過在策略位置上將半胱氨酸殘基引入至ddd和ad兩者中以促進二硫鍵的形成而進一步鎖定為穩定拴系的結構。“對接和鎖定”方法的一般方法如下。通過將ddd序列連接至a的前體來構建實體a，從而產生下文中稱為a的第一組分。因為ddd序列將引起二聚體的自發形成，a將因此主要由a2組成。通過將ad序列連接至b的前體來構建實體b，從而產生下文中稱為b的第二組分。包含在a2中的ddd的二聚體基序將產生用于結合包含在b中的ad序列的對接位點，因而促進a2和b的迅速締合以形成主要由a2b組成的二元的、三聚體復合體。此結合事件通過隨后的反應以經由二硫橋鍵共價固定兩個實體而成為不可逆的，這基于有效局部濃度的原則而非常有效地發生，因為初始的結合相互作用會使置于ddd和ad兩者上的反應性硫醇基靠近(chimura等,proc.natl.acad.sci.usa.2001;98:8480)以位點特異性地連接。使用接頭、銜接子模塊以及前體的各種組合，可以產生并使用不同化學計量的各種各樣的dnl構建體，包括但不限于二聚體、三聚體、四聚體、五聚體以及六聚體dnl構建體(參見，例如美國專利號7,550,143；7,521,056；7,534,866；7,527,787；7,666,400；7,858,070；7,871,622；7,906,121；7,906,118以及7,901,680)。

通過遠離兩個前體的官能團而附接ddd和ad，此類位點特異性的連接也預計保留所述兩個前體的原始活性。此方法本質上是模塊化的并且可以潛在地應用于位點特異性地和共價地連接廣范圍的物質，包括肽、蛋白質、抗體、抗體片段以及其它具有廣范圍活性的效應子部分。使用以下實施例中描述的構建ad和ddd綴合的效應子的融合蛋白方法，可以使幾乎任何的蛋白質或肽并入dnl構建體中。然而，所述技術是非限制性的并且可以使用其它的綴合方法。

各種用于制作融合蛋白的方法是已知的，包括核酸合成、雜交和/或擴增以產生對感興趣的融合蛋白進行編碼的合成雙鏈核酸。通過標準分子生物學技術，可以將此類雙鏈核酸插入至表達載體中用于融合蛋白產生(參見，例如sambrook等,molecularcloning,alaboratorymanual,第2版,1989)。在此類優選的實施方案中，ad和/或ddd部分可以被附接到效應子蛋白或肽的n末端或c末端處。然而，熟練的技術人員將認識到ad或ddd部分至效應子部分的附接位點可以取決于效應子部分的化學性質和效應子部分的涉及其生理活性的部分而變化。可以使用本領域中已知的技術(如使用二價交聯試劑和/或其它化學綴合技術)進行各種效應子部分的位點特異性附接。

預靶向

可以在預靶向技術中使用雙特異性或多特異性抗體。預靶向是多步驟過程，起初被開發來解決直接靶向抗體的緩慢血液清除率，這種緩慢血液清除率促成對正常組織(如骨髓)的不希望的毒性。使用預靶向時，放射性核素或其它治療劑被附接到數分鐘內從血液中清除的小遞送分子(可靶向構建體)。首先施用具有用于可靶向構建體以及靶標抗原的結合位點的預靶向雙特異性或多特異性抗體，允許游離抗體從循環中清除，并且然后施用可靶向構建體。

預靶向方法例如公開在goodwin等,美國專利號4,863,713；goodwin等,j.nucl.med.29:226,1988；hnatowich等,j.nucl.med.28:1294,1987；oehr等,j.nucl.med.29:728,1988；klibanov等,j.nucl.med.29:1951,1988；sinitsyn等,j.nucl.med.30:66,1989；kalofonos等,j.nucl.med.31:1791,1990；schechter等,int.j.cancer48:167,1991；paganelli等,cancerres.51:5960,1991；paganelli等,nucl.med.commun.12:211,1991；美國專利號5,256,395；stickney等,cancerres.51:6650,1991；yuan等,cancerres.51:3119,1991；美國專利號6,077,499；7,011,812；7,300,644；7,074,405；6,962,702；7,387,772；7,052,872；7,138,103；6,090,381；6,472,511；6,962,702以及6,962,702中，每一個所述文獻以引用的方式并入本文。

用于治療或診斷受試者中疾病或病癥的預靶向方法可以提供為：(1)向受試者施用雙特異性抗體或抗體片段；(2)任選地向受試者施用清除組合物，并且允許所述組合物將抗體從循環中清除；以及(3)向受試者施用可靶向構建體，所述構建體含有一種或多種螯合的或化學結合的治療劑或診斷劑。

可靶向構建體

在某些實施方案中，標記有一種或多種治療劑或診斷劑以用于預靶向的可靶向構建體肽可以被選擇來結合雙特異性抗體，所述雙特異性抗體具有用于可靶向構建體肽的一個或多個結合位點和用于與疾病或病狀相關的靶標抗原的一個或多個結合位點。雙特異性抗體可以用于預靶向技術，其中首先向受試者施用所述抗體。可以允許足夠的時間使雙特異性抗體結合靶標抗原并且使未結合的抗體從循環中清除。然后可以向受試者施用可靶向構建體(如標記的肽)，并且允許結合雙特異性抗體并定位在患病的細胞或組織處。

此類可靶向構建體可以具有各種不同的結構，并且不僅選擇用于以高親和性結合可靶向構建體的抗體或片段的可用性，而且用于當在預靶向方法和雙特異性抗體(bsab)或多特異性抗體內使用時的快速體內清除。疏水劑在引發強的免疫反應方面效果最好，而親水劑優選用于快速體內清除。因此，建立了疏水特征與親水特征之間的平衡。這可以部分地通過使用親水性螯合劑以抵消許多有機部分的固有疏水性來完成。同樣，可以選擇具有相反溶解性質的可靶向構建體的亞單位，例如肽，所述肽含有氨基酸，一些氨基酸是疏水性的并且一些氨基酸是親水性的。

可以使用具有少至兩個氨基酸殘基(優選地兩個至十個殘基)的肽，并且還可以將其偶聯至其它部分，如螯合劑。接頭應當是低分子量的綴合物，優選地分子量為小于50,000道爾頓，并且有利地小于約20,000道爾頓、10,000道爾頓或5,000道爾頓。更通常地，可靶向構建體肽將具有四個或更多個殘基，如肽dota-phe-lys(hsg)-tyr-lys(hsg)-nh2(seqidno:41)，其中dota是1,4,7,10-四氮雜環十二烷1,4,7,10-四乙酸并且hsg是組胺琥珀酰基甘氨酰基。或者，dota可以被以下替換：nota(1,4,7-三氮雜-環壬烷-1,4,7-三乙酸)、teta(對溴乙酰氨基-芐基-四乙胺四乙酸)、neta([2-(4,7-二羧甲基[1,4,7]三氮雜環壬烷-1-基-乙基]-2-羧甲基-氨基]乙酸)或其它已知的螯合部分。螯合部分可以例如用于結合治療性和/或診斷性的放射性核素、順磁離子或造影劑。

可靶向構建體還可以在骨架結構中包含非天然氨基酸(例如，d-氨基酸)以增加體內中肽的穩定性。在替代實施方案中，可以使用其它的骨架結構，如由非天然氨基酸或類肽構建的那些骨架結構。

使用固相載體(support)和反復正交去保護和偶聯的標準技術，在自動化的肽合成儀上方便地合成用作可靶向構建體的肽。肽中的游離氨基(待后面用于螯合部分或其它藥劑的綴合)有利地用標準保護基團(如boc基團)封端，而n末端殘基可以被乙酰化以增加血清穩定性。此類保護基團是熟練的技術人員眾所周知的。參見greeneandwutsprotectivegroupsinorganicsynthesis,1999(johnwiley&sons,n.y.)。當制備肽用于后面在雙特異性抗體系統內使用時，所述肽有利地從樹脂上裂解以產生相對應的c末端酰胺，以便抑制體內羧肽酶活性。肽合成的示例性方法公開在以下實施例中。

在使用了用雙特異性抗體進行預靶向的情況下，抗體將含有第一結合位點和第二結合位點，所述第一結合位點用于由靶標組織產生或與靶標組織相關的抗原，所述第二結合位點用于可靶向構建體上的半抗原。示例性半抗原包括但不限于hsg和in-dtpa。針對hsg半抗原而產生的抗體是已知的(例如679抗體)，并且可以將其簡單地并入適當的雙特異性抗體中(參見，例如美國專利號6,962,702；7,138,103以及7,300,644，其關于實施例部分以引用的方式并入本文)。然而，其它半抗原和結合它們的抗體是本領域中已知的并且可以被使用，如in-dtpa和734抗體(例如，美國專利號7,534,431，實施例部分以引用的方式并入本文)。

免疫綴合物的制備

在優選的實施方案中，治療劑或診斷劑可以被共價地附接至抗體或抗體片段以形成免疫綴合物。在免疫綴合物待通過皮下遞送、肌肉內遞送或經皮膚遞送而以濃縮的形式施用的情況下，熟練的技術人員將認識到僅有非細胞毒性劑可以與抗體綴合。在第二抗體或其片段通過不同的路徑(如靜脈內)在所述皮下遞送、肌肉內遞送或經皮膚遞送之前、與其同時或在其之后而施用的情況下，那么可以與第二抗體或其片段綴合的診斷劑或治療劑的類型不受如此限制，并且可以包含本領域中已知的任何診斷劑或治療劑，包括細胞毒性劑。

在一些實施方案中，可以經由載體部分將診斷劑和/或治療劑附接至抗體或其片段。載體部分可以例如附接至還原的sh基團和/或碳水化合物側鏈。可以經由二硫鍵形成將載體部分附接在還原的抗體組分的鉸鏈區。或者，可以使用異雙官能交聯劑(如3-(2-吡啶二硫基)丙酸n-琥珀酰酯(spdp))附接此類藥劑。yu等,int.j.cancer56:244(1994)。用于此類綴合的一般技術是本領域中眾所周知的。參見，例如wong,chemistryofproteinconjugationandcross-linking(crc出版社1991)；monoclonalantibodies:principlesandapplications,birch等(編著),第187-230頁(wiley-liss,inc.1995)中的upeslacis等,"modificationofantibodiesbychemicalmethods”；monoclonalantibodies:production,engineeringandclinicalapplication,ritter等(編著),第60-84頁(劍橋大學出版社1995)中的price,“productionandcharacterizationofsyntheticpeptide-derivedantibodies”。或者，可以經由抗體的fc區中的碳水化合物部分來綴合載體部分。

用于經由抗體碳水化合物部分使官能團與抗體綴合的方法是本領域技術人員眾所周知的。參見，例如shih等,int.j.cancer41:832(1988)；shih等,int.j.cancer46:1101(1990)；以及shih等,美國專利號5,057,313，所述文獻的實施例部分以引用的方式并入本文。一般方法涉及使具有氧化的碳水化合物部分的抗體與具有至少一個游離胺官能的載體聚合物反應。此反應導致形成初始的希夫(schiff)堿(亞胺)連接鍵，所述連接鍵可以通過還原成仲胺以形成最終的綴合物來穩定。

如果免疫綴合物的抗體組分是抗體片段，則可以不存在fc區。然而，可能將碳水化合物部分引入至全長抗體或抗體片段的輕鏈可變區中。參見，例如leung等,j.immunol.154:5919(1995)；美國專利號5,443,953和6,254,868，所述文獻的實施例部分以引用的方式并入本文。工程化的碳水化合物部分用來附接治療劑或診斷劑。

用于將載體部分附接至靶向分子的替代方法涉及點擊化學反應的使用。點擊化學方法起初被認為是通過以模塊化樣式將小的亞單位接合在一起而快速產生復合物質的方法。(參見，例如kolb等,2004,angewcheminted40:3004-31；evans,2007,austjchem60:384-95)。各種形式的點擊化學反應是本領域中已知的，如huisgen1,3-偶極環加成銅催化反應(tomoe等,2002,jorganicchem67:3057-64)，這種反應經常被稱為“點擊反應”。其它替代方案包括：如狄爾斯-阿爾德(diels-alder)的環加成反應、親核取代反應(尤其針對小張力環，像環氧化合物和氮丙啶化合物)、尿素化合物的羰基化學形成以及涉及碳-碳雙鍵(如硫醇-炔反應中的炔烴)的反應。

疊氮化物-炔huisgen環加成反應在還原劑存在的情況下使用銅催化劑來催化附接至第一分子上的末端炔基的反應。在包含疊氮化物部分的第二分子存在的情況下，疊氮化物與活化的炔烴反應以形成1,4-二取代的1,2,3-三唑。銅催化的反應在室溫下發生并且是足夠特異性的，經常不需要對反應產物進行純化。(rostovstevd等,2002,angewcheminted41:2596；tornoe等,2002,jorgchem67:3057)。在水性培養基中，疊氮官能團和炔烴官能團對生物分子基本上是惰性的，從而允許反應在復雜的溶液中發生。所形成的三唑是化學穩定的并且不受酶裂解的影響，從而使點擊化學產物在生物系統中高度穩定。雖然銅催化劑對活細胞有毒性，但是基于銅的點擊化學反應可以在體外用于免疫綴合物形成。

已經提議無銅的點擊反應用于生物分子的共價修飾。(參見，例如agard等,2004,jamchemsoc126:15046-47)。無銅的反應使用環張力代替銅催化劑以促進[3+2]疊氮化物-炔烴環加成反應(同上)。例如，環辛炔是包含內炔鍵的8個碳的環結構。閉合環結構誘導乙炔的實質性的鍵角變形，這與疊氮基團有高度反應性以形成三唑。因此，環辛炔衍生物可以用于無銅的點擊反應(同上)。

另一種類型的無銅點擊反應由ning等(2010,angewcheminted49:3065-68)所報道，涉及張力促進的炔烴-硝酮環加成。為了解決原始環辛炔反應的緩慢速率，將吸電子基團附接至三鍵附近(同上)。此類取代的環辛炔的實例包括二氟化的環辛炔、4-二苯并環辛炔醇以及氮雜環辛炔(同上)。替代的無銅反應涉及張力促進的炔烴-硝酮環加成以得到n-烷基化的異噁唑啉(同上)。據報道所述反應具有異常快速的反應動力學，并且用于一鍋法三步驟的實驗方案中以用于肽和蛋白質的位點特異性修飾(同上)。通過將適當的醛與n-甲基羥基胺縮合來制備硝酮，并且環加成反應發生在乙腈和水的混合物中(同上)。這些和其它已知的點擊化學反應可以用來在體外將載體部分附接至抗體。

agard等(2004,jamchemsoc126:15046-47)證明了在全乙酰化的n-疊氮乙酰甘露糖胺存在的情況下，在cho細胞中表達的重組糖蛋白導致相對應的n-疊氮乙酰唾液酸生物并入糖蛋白的碳水化合物中。疊氮基衍生化的糖蛋白與生物素化的環辛炔進行特異性反應以形成生物素化的糖蛋白，而不具有疊氮基部分的對照糖蛋白保持為未標記的(同上)。laughlin等(2008,science320:664-667)使用了類似的技術來代謝地標記斑馬魚胚胎中的細胞表面聚糖，所述斑馬魚胚胎用全乙酰化的n-疊氮乙酰半乳糖胺進行了孵育。疊氮基衍生化的聚糖與二氟化的環辛炔(difo)試劑反應以允許體內聚糖的可視化。

狄爾斯-阿爾德反應也已經用于在體內分子的標記。rossin等(2010,angewcheminted49:3375-78)報道了在體內于帶有反式環辛烯(tco)反應性部分的腫瘤定位的抗tag72(cc49)抗體與¹¹¹in-標記的四嗪dota衍生物之間的52%產率。向帶有結腸癌異種移植物的小鼠施用tco標記的cc49抗體，接著在1天之后注射¹¹¹in-標記的四嗪探針(同上)。如通過注射放射性標記的探針之后三小時的活小鼠的spect成像所證明，放射性標記的探針與腫瘤定位的抗體的反應導致顯著的腫瘤放射活性定位，其中腫瘤與肌肉的比率為13:1(同上)。結果證實了tco與四嗪標記的分子的體內化學反應。

使用標記部分的生物并入的抗體標記技術進一步公開在美國專利號6,953,675中(所述專利的實施例部分以引用的方式并入本文)。制備此類“美化的(landscaped)”抗體以在糖基化位點上具有反應性的酮基團。方法涉及在包含糖或糖前體的酮衍生物的培養基中用表達載體轉染的表達細胞，所述載體編碼在ch1或vκ域中具有一個或多個n-糖基化位點的抗體。酮衍生化的糖或前體包括n-乙酰丙酰甘露糖胺(n-levulinoylmannosamine)和n-乙酰丙酰巖藻糖。隨后，美化的抗體與包含酮反應性部分(如酰肼基團、肼基團、羥氨基團或氨基硫脲基團)的試劑反應以形成經標記的靶向分子。附接至美化的抗體的示例性試劑包括：螯合劑，像dtpa；大的藥物分子，如阿霉素-葡聚糖；以及含有酰基-酰肼的肽。美化技術并不限于產生包含酮部分的抗體，而是可以作為替代用來將點擊化學反應基團(如硝酮、疊氮化物或環辛炔)引入到抗體或其它生物分子上。

點擊化學反應的修飾適合于體外或體內使用。可以通過化學綴合或通過生物并入來形成反應性靶向分子。可以用疊氮基部分、取代的環辛炔或炔烴基團、或硝酮部分來活化靶向分子，如抗體或抗體片段。在靶向分子包含疊氮基或硝酮基團的情況下，相對應的可靶向構建體將包含取代的環辛炔或炔烴基團，反之亦然。如上所討論，可以通過在活細胞中的代謝并入來制作此類活化的分子。

或者，將此類部分化學綴合到生物分子的方法是本領域中眾所周知的，并且可以使用任何此類已知的方法。免疫綴合物形成的一般方法例如公開在美國專利號4,699,784；4,824,659；5,525,338；5,677,427；5,697,902；5,716,595；6,071,490；6,187,284；6,306,393；6,548,275；6,653,104；6,962,702；7,033,572；7,147,856以及7,259,240中，每一個所述專利的實施例部分以引用的方式并入本文。

治療劑和診斷劑

在某些實施方案中，抗體或其片段可以與一種或多種治療劑和/或診斷劑組合使用。在將藥劑附接至待通過皮下施用、肌肉內施用或經皮膚施用濃縮的抗體制劑而進行施用的抗體或其片段的情況下，那么僅涵蓋了非細胞毒性劑。非細胞毒性劑可以包括但不限于：免疫調節劑、細胞因子(和它們的抑制劑)、趨化因子(和它們的抑制劑)、酪氨酸激酶抑制劑、生長因子、激素以及某些酶(即，不會誘導局部壞死的那些酶)或它們的抑制劑。在皮下、肌肉內或經皮膚的抗體制劑之前、與此同時或在此之后共同施用藥劑的情況下，那么可以使用細胞毒性劑。可以作為與第二抗體或其片段的免疫綴合物施用藥劑，或可以作為游離劑來施用。以下討論適用于細胞毒性劑和非細胞毒性劑兩者。

治療劑可以選自由以下組成的組：放射性核素、免疫調節劑、抗血管生成劑、細胞因子、趨化因子、生長因子、激素、藥物、前藥、酶、寡核苷酸、促凋亡劑、干擾rna、光活性治療劑、酪氨酸激酶抑制劑、鞘氨醇抑制劑、細胞毒性劑(其可為化學治療劑或毒素)以及其組合。有用的藥物可以擁有藥物性質，選自由以下組成的組：抗有絲分裂劑、抗激酶劑、烷基化劑、抗代謝物劑、抗生素劑、生物堿劑、抗血管生成劑、促凋亡劑以及其組合。

示例性藥物可以包括但不限于：5-氟尿嘧啶、脫氫膜海鞘素(aplidin)、阿扎立平(azaribine)、阿那曲唑(anastrozole)、蒽環類藥物(anthracyclines)、苯達莫司汀(bendamustine)、博來霉素(bleomycin)、硼替佐米(bortezomib)、苔蘚抑素-1(bryostatin-1)、白消安(busulfan)、刺孢霉素(calicheamycin)、喜樹堿(camptothecin)、卡鉑(carboplatin)、10-羥基喜樹堿、卡莫司汀(carmustine)、西樂葆(celebrex)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、順鉑(cisplatin)(cddp)、環氧化酶-2抑制劑(cox-2inhibitor)、伊立替康(irinotecan)(cpt-11)、sn-38、卡鉑、克拉屈濱(cladribine)、喜樹堿(camptothecan)、環磷酰胺、阿糖胞苷(cytarabine)、達卡巴嗪(dacarbazine)、多西他賽(docetaxel)、更生霉素(dactinomycin)、柔紅霉素(daunorubicin)、阿霉素(doxorubicin)、2-吡咯啉阿霉素(2-pyrrolinodoxorubicine；2p-dox)、氰基-嗎啉代阿霉素、阿霉素葡糖苷酸、表阿霉素葡糖苷酸、雌莫司汀(estramustine)、表鬼臼毒素(epipodophyllotoxin)、雌激素受體結合劑、依托泊苷(etoposide)(vp16)、依托泊苷葡糖苷酸、磷酸依托泊苷、氟脲苷(fudr)、3’,5’-o-二油酰基-fudr(fudr-do)、氟達拉濱(fludarabine)、氟他胺(flutamide)、法尼基-蛋白轉移酶抑制劑、吉西他濱(gemcitabine)、羥基脲、伊達比星(idarubicin)、異環磷酰胺(ifosfamide)、l-天冬酰胺酶、來那度胺(lenolidamide)、亞葉酸(leucovorin)、洛莫司汀(lomustine)、氮芥、美法侖(melphalan)、巰基嘌呤、6-巰基嘌呤、甲氨蝶呤(methotrexate)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光輝霉素(mithramycin)、絲裂霉素(mitomycin)、米托坦(mitotane)、諾維本(navelbine)、亞硝基脲、普卡霉素(plicomycin)、丙卡巴肼(procarbazine)、紫杉醇、噴司他丁(pentostatin)、psi-341、雷洛昔芬(raloxifene)、司莫司汀(semustine)、鏈脲霉素(streptozocin)、它莫西芬(tamoxifen)、紫杉酚、替莫唑胺(temazolomide)(dtic的水性形式)、反鉑(transplatinum)、沙利度胺(thalidomide)、硫鳥嘌呤、塞替派(thiotepa)、替尼泊苷(teniposide)、拓撲替康(topotecan)、烏拉莫司汀(uracilmustard)、長春瑞濱(vinorelbine)、長春堿(vinblastine)、長春新堿(vincristine)以及長春花生物堿。

毒素可以包括蓖麻毒素、相思豆毒素、α毒素、皂草素、核糖核酸酶(rna酶)(例如，抗腫瘤核糖核酸酶(onconase)、dna酶i)、葡萄球菌腸毒素-a(staphylococcalenterotoxin-a)、美洲商陸抗病毒蛋白、白樹毒素、白喉毒素、假單胞菌外毒素以及假單胞菌內毒素。

免疫調節劑可以選自：細胞因子、干細胞生長因子、淋巴毒素、成血因子、集落刺激因子(csf)、干擾素(ifn)、紅細胞生長素、血小板生成素以及其組合。特別有用的是：淋巴毒素，如腫瘤壞死因子(tnf)；成血因子，如白細胞介素(il)；集落刺激因子，如粒細胞集落刺激因子(g-csf)或粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)；干擾素，如干擾素-α、干擾素-β、干擾素-γ；以及干細胞生長因子，如命名為“s1因子”的干細胞生長因子。包括在細胞因子之中的是：生長激素，如人生長激素、n-甲硫氨酰基人生長激素以及牛生長激素；甲狀旁腺激素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，如促卵泡激素(fsh)、促甲狀腺激素(tsh)以及促黃體激素(lh)；肝細胞生長因子；前列腺素、成纖維細胞生長因子；催乳素；胎盤催乳素、ob蛋白；腫瘤壞死因子-α和腫瘤壞死因子-β；苗勒抑制物質；小鼠促性腺激素相關的肽；抑制素；激活素；血管內皮生長因子；整聯蛋白；促血小板生成素(tpo)；神經生長因子，如ngf-β；血小板生長因子；轉化生長因子(tgf)，如tgf-α和tgf-β；胰島素樣生長因子-i和胰島素樣生長因子-ii；紅細胞生長素(epo)；骨誘導因子；干擾素，如干擾素-α、干擾素-β以及干擾素-γ；集落刺激因子(csf)，如巨噬細胞-csf(m-csf)；白細胞介素(il)，如il-1、il-1α、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il-10、il-11、il-12、il-13、il-14、il-15、il-16、il-17、il-18、il-21、il-23、il-25、lif、kit配體或flt-3、血管抑素、血小板反應蛋白、內皮抑素、腫瘤壞死因子以及lt。

有用的趨化因子包括rantes、mcaf、mip1-α、mip1-β以及ip-10。

放射性同位素包括但不限于：¹¹¹in、¹⁷⁷lu、²¹²bi、²¹³bi、²¹¹at、⁶²cu、⁶⁷cu、⁹⁰y、¹²⁵i、¹³¹i、³²p、³³p、⁴⁷sc、¹¹¹ag、⁶⁷ga、¹⁴²pr、¹⁵³sm、¹⁶¹tb、¹⁶⁶dy、¹⁶⁶ho、¹⁸⁶re、¹⁸⁸re、¹⁸⁹re、²¹²pb、²²³ra、²²⁵ac、⁵⁹fe、⁷⁵se、⁷⁷as、⁸⁹sr、⁹⁹mo、¹⁰⁵rh、¹⁰⁹pd、¹⁴³pr、¹⁴⁹pm、¹⁶⁹er、¹⁹⁴ir、¹⁹⁸au、¹⁹⁹au以及²¹¹pb。治療性的放射性核素優選地衰變能量在20kev至6,000kev范圍內，針對俄歇(auger)發射體優選地在60kev至200kev范圍內、針對β發射體在100kev至2,500kev范圍內以及針對α發射體在4,000kev至6,000kev范圍內。有用的發射β粒子的核素的最大衰變能量優選地是20kev至5,000kev，更優選地100kev至4,000kev，并且最優選地500kev至2,500kev。還優選的是大致上具有俄歇發射顆粒的衰變的放射性核素。例如，co-58、ga-67、br-80m、tc-99m、rh-103m、pt-109、in-111、sb-119、i-125、ho-161、os-189m以及ir-192。有用的發射β粒子的核素的衰變能量優選地是<1,000kev，更優選地<100kev，并且最優選地<70kev。還優選的是大致上具有α-粒子產生的衰變的放射性核素。此類放射性核素包括但不限于：dy-152、at-211、bi-212、ra-223、rn-219、po-215、bi-211、ac-225、fr-221、at-217、bi-213以及fm-255。有用的發射α粒子的放射性核素的衰變能量優選地是2,000kev至10,000kev，更優選地3,000kev至8,000kev，并且最優選地4,000kev至7,000kev。有用的額外可能的放射性同位素包括¹¹c、¹³n、¹⁵o、⁷⁵br、¹⁹⁸au、²²⁴ac、¹²⁶i、¹³³i、⁷⁷br、^113min、⁹⁵ru、⁹⁷ru、¹⁰³ru、¹⁰⁵ru、¹⁰⁷hg、²⁰³hg、^121mte、^122mte、^125mte、¹⁶⁵tm、¹⁶⁷tm、¹⁶⁸tm、¹⁹⁷pt、¹⁰⁹pd、¹⁰⁵rh、¹⁴²pr、¹⁴³pr、¹⁶¹tb、¹⁶⁶ho、¹⁹⁹au、⁵⁷co、⁵⁸co、⁵¹cr、⁵⁹fe、⁷⁵se、²⁰¹tl、²²⁵ac、⁷⁶br、¹⁶⁹yb等。

治療劑可以包括光活性劑或染料。熒光組合物(如熒光染料)和其它色原體或染料(如對可見光敏感的卟啉)已經通過將適合的光引導至損傷而用來檢測并治療損傷。在治療中，這已經被稱為光輻射、光照療法或光動力學療法。參見jori等(編著),photodynamictherapyoftumorsandotherdiseases(libreriaprogetto1985)；vandenbergh,chem.britain(1986),22:430。此外，已經將單克隆抗體與光活化的染料偶聯用于實現光照療法。參見mew等,j.immunol.(1983),130:1473；idem.,cancerres.(1985),45:4380；oseroff等,proc.natl.acad.sci.usa(1986),83:8744；idem.,photochem.photobiol.(1987),46:83；hasan等,prog.clin.biol.res.(1989),288:471；tatsuta等,laserssurg.med.(1989),9:422；pelegrin等,cancer(1991),67:2529。

皮質類固醇激素可以增加其它化學治療劑的有效性，并且因此它們被頻繁地用于聯合治療中。強的松(prednisone)和地塞米松(dexamethasone)是皮質類固醇激素的實例。

在某些實施方案中，抗血管生成劑，如血管抑素、baculostatin、血管能抑素；乳腺絲抑蛋白；抗胎盤生長因子(pigf)肽和抗體；抗血管生長因子抗體(如抗vegf和抗plgf)；抗flk-1抗體；抗flt-1抗體和肽；抗kras抗體；抗cmet抗體；抗mif(巨噬細胞游走抑制因子)抗體；層粘連蛋白肽；纖連蛋白肽；纖溶酶原激活物抑制劑；組織金屬蛋白酶抑制劑；干擾素；白細胞介素-12；ip-10；gro-β；血小板反應蛋白；2-甲氧基雌二醇；增殖蛋白相關的蛋白質；羧胺三唑；cm101；馬立馬司他(marimastat)；戊聚糖多硫酸鹽；血管生成素-2；干擾素-α；除莠霉素a；pnu145156e；16k催乳素片段；利諾胺(linomide)；沙利度胺(thalidomide)；己酮可可堿；染料木黃酮；tnp-470；內皮抑素；紫杉醇；蛇毒解離素(accutin)；血管抑素；西多福韋(cidofovir)；長春新堿；博來霉素；agm-1470；血小板因子4或米諾環素(minocycline)可以是有用的。

治療劑可以包含寡核苷酸，如sirna。熟練的技術人員將認識到任何sirna或干擾rna種類可以附接至抗體或其片段用于遞送至靶向組織。許多對抗各種各樣靶標的sirna種類是本領域中已知的，并且任何此類已知的sirna可以被使用在所要求保護的方法和組合物中。

潛在有用的已知的sirna種類包括對以下有特異性的那些：ikk-γ(美國專利7,022,828)；vegf、flt-1以及flk-l/kdr(美國專利7,148,342)；bcl2和egfr(美國專利7,541,453)；cdc20(美國專利7,550,572)；轉導蛋白(β)-樣3(美國專利7,576,196)；kras(美國專利7,576,197)；碳酸酐酶ii(美國專利7,579,457)；補體組分3(美國專利7,582,746)；白細胞介素-1受體相關的激酶4(irak4)(美國專利7,592,443)；存活素(美國專利7,608,7070)；超氧化物歧化酶1(美國專利7,632,938)；met原癌基因(美國專利7,632,939)；淀粉樣β前體蛋白(app)(美國專利7,635,771)；igf-1r(美國專利7,638,621)；icam1(美國專利7,642,349)；補體因子b(美國專利7,696,344)；p53(7,781,575)以及載脂蛋白b(7,795,421)，每個引用的專利的實施例部分以引用的方式并入本文。

額外的sirna種類從已知的商業來源中可獲得，尤其如sigma-aldrich(stlouis,mo)、invitrogen(carlsbad,ca)、santacruzbiotechnology(santacruz,ca)、ambion(austin,tx)、dharmacon(thermoscientific,lafayette,co)、promega(madison,wi)、mirusbio(madison,wi)以及qiagen(valencia,ca)。sirna種類的其它公開可獲得的來源包括：stockholmbioinformaticscentre處的sirnadb數據庫、mit/icbpsirna數據庫、broadinstitute處的rnaiconsortiumshrna文庫以及ncbi處的探針數據庫。例如，在ncbi探針數據庫中存在30,852個sirna種類。熟練的技術人員將認識到，對于感興趣的任何基因而言，要么已經設計了一個sirna種類，要么可以使用公開可獲得的軟件工具容易地設計一個sirna種類。可以使用本發明dnl復合體遞送任何此類sirna種類。

在本領域中已知的示例性sirna種類列于表2。雖然sirna作為雙鏈分子而遞送，為簡單起見，僅有義鏈序列在表2中示出。

表2.示例性sirna序列

熟練的技術人員將認識到表2代表對本領域中已知的sirna種類的總數的非常小的取樣，以及任何此類已知的sirna可以被使用在所要求保護的方法和組合物中。

診斷劑優選地選自由以下組成的組：放射性核素、放射造影劑、順磁離子、金屬、熒光標記、化學發光標記、超聲造影劑以及光活性劑。此類診斷劑是眾所周知的，并且可以使用任何此類已知的診斷劑。診斷劑的非限制性實例可以包括放射性核素，如¹⁸f、⁵²fe、¹¹⁰in、¹¹¹in、¹⁷⁷lu、⁵²fe、⁶²cu、⁶⁴cu、⁶⁷cu、⁶⁷ga、⁶⁸ga、⁸⁶y、⁹⁰y、⁸⁹zr、^94mtc、⁹⁴tc、^99mtc、¹²⁰i、¹²³i、¹²⁴i、¹²⁵i、¹³¹i、^154-158gd、³²p、¹¹c、¹³n、¹⁵o、¹⁸⁶re、¹⁸⁸re、⁵¹mn、^52mmn、⁵⁵co、⁷²as、⁷⁵br、⁷⁶br、^82mrb、⁸³sr、或其它γ-發射體、β-發射體或正電子發射體。

有用的順磁離子可以包括：鉻(iii)、錳(ii)、鐵(iii)、鐵(ii)、鈷(ii)、鎳(ii)、銅(ii)、釹(iii)、釤(iii)、鐿(iii)、釓(iii)、釩(ii)、鋱(iii)、鏑(iii)、鈥(iii)或鉺(iii)。金屬造影劑可以包括鑭(iii)、金(iii)、鉛(ii)或鉍(iii)。

超聲造影劑可以包含脂質體，如充氣的脂質體。不透射線的診斷劑可以選自化合物、鋇化合物、鎵化合物以及鉈化合物。各種各樣的熒光標記是本領域中已知的，包括但不限于：異硫氰酸熒光素、羅丹明、藻紅蛋白、藻藍蛋白、別藻藍蛋白、鄰苯二甲醛以及熒光胺。有用的化學發光標記可以包括魯米諾、異魯米諾、芳香吖啶酯、咪唑、吖啶鹽或草酸酯。

施用方法

本發明抗體和免疫球蛋白通常可以被配制來獲得組合物，所述組合物包含一種或多種藥學上適合的賦形劑、表面活性劑、多元醇、緩沖劑、鹽、氨基酸、或額外的成分或這些物質的某一組合。這可以通過已知的方法以制備藥學上有用的劑量來完成，由此活性成分(即，標記的分子)被合并至與一種或多種藥學上適合的賦形劑的混合物中。無菌磷酸鹽緩沖鹽水是藥學上適合的賦形劑的一個實例。其它適合的賦形劑是本領域技術人員眾所周知的。參見，例如ansel等,pharmaceuticaldosageformsanddrugdeliverysystems,第5版(lea&febiger1990)和gennaro(編著),remington’spharmaceuticalsciences,第18版(mackpublishingcompany1990)以及其修訂版本。

用于施用在本文中描述的組合物的優選路徑是腸胃外注射，更優選地通過皮下遞送、肌肉內遞送或經皮膚遞送。腸胃外施用的其它形式包括靜脈內注射、動脈內注射、淋巴管內注射、鞘內注射、眼內注射、腦內注射或腔內注射。在腸胃外施用中，將與藥學上可接受的賦形劑聯合、以單位劑量可注射的形式配制組合物，所述形式如溶液、混懸液或乳狀液。此類賦形劑本質上是無毒性的和無治療性的。此類賦形劑的實例是鹽水、林格氏溶液、葡萄糖溶液以及漢克斯溶液。也可以使用非水性的賦形劑，如不揮發油和油酸乙酯。替代的賦形劑是5%葡萄糖鹽水溶液。賦形劑可以含有少量的添加劑，如增強等滲性和化學穩定性的物質，包括緩沖劑和防腐劑。

包含抗體的配制組合物可以用于皮下施用、肌肉內施用或經皮膚施用。組合物可以與添加的防腐劑一起存在于單位劑量形式中，例如在安瓶或在多劑量容器中。組合物還可以采用像在油性或水性媒介物中的混懸液、溶液或乳狀液一樣的形式，并且可以含有配制劑，如懸浮劑、穩定劑和/或分散劑。或者，組合物可以呈粉末形式用于在使用之前用適合的媒介物(例如，無菌的無熱原水)構成。

組合物可以在溶液中施用。其制劑應當處于具有適合的藥學上可接受的緩沖劑的溶液中，所述緩沖劑如磷酸鹽、tris(羥甲基)氨基甲烷-hcl或檸檬酸鹽等。緩沖劑濃度應當在1mm至100mm范圍內。配制的溶液還可以含有濃度為50mm至150mm的鹽，如氯化鈉或氯化鉀。還可以包含有效量的穩定劑，如甘露醇、海藻糖、山梨醇、甘油、白蛋白、球蛋白、洗滌劑、明膠、魚精蛋白或魚精蛋白的鹽。

對于人而言施用的抗體的劑量將取決于像患者的年齡、體重、身高、性別、一般身體狀況以及以前的病史這樣的因素。通常，希望提供接受者作為單一輸注的在約1mg至600mg范圍內的抗體劑量，雖然還可以施用更低或更高的劑量。通常，希望提供接受者每平方米(m²)體表面積約50mg范圍內的劑量或對于通常的成人而言70mg至85mg的抗體，雖然還可以施用更低或更高的劑量。可以向人受試者施用的抗體劑量的實例是1mg至1,000mg，更優選地1mg至70mg，最優選地1mg至20mg，雖然可以使用更高或更低的劑量。當需要時，可以重復劑量，例如每周一次持續4至10周，優選地每周一次持續8周，并且更優選地每周一次持續4周。還可以更低頻率給予，如每隔一周，持續數月。

最近，已經對nhl患者以80mg、160mg或320mg的每兩周重復一次的4次劑量來給予皮下施用維妥珠單抗(negrea等,2011,haematologica96:567-73)。僅觀察到偶然的、輕微至中等的以及短暫的注射反應，沒有其它安全問題(同上)。目標反應比率(cr+cru+pr)是47%，其中cr/cru(完全反應)比率是24%(同上)。有趣地是，80mg劑量組顯示出最高的目標反應百分數(2/3，67%)，其中三分之一的患者顯示出完全反應(同上)。八個目標反應中有四個持續了60周(同上)。針對haha評價的所有血清樣品是陰性(同上)。雖然在本研究中報道的低樣品總體排除了關于最佳給藥的任何決定性結論，但明顯的是在所測試的最低劑量(80mg)下觀察到治療性反應。

在某些替代實施方案中，可以通過經皮膚遞送來施用抗體。經皮膚遞送的不同方法是本領域中已知的，如通過經皮膚貼劑或通過微針裝置，并且可以使用任何此類已知的方法。在一個示例性的實施方案中，經皮膚遞送可以使用遞送裝置(如3m空心微結構經皮膚系統(hmts))用于基于抗體的治療法。hmts裝置包括一個1cm²的微針陣列，所述微針陣列由長度為950微米的18個空心微針組成，所述空心微針穿透至皮膚真皮層近似600至700微米，在那里存在高密度的淋巴通道。裝載有彈簧的裝置推動抗體組合物從流體儲罐穿過微針用于向受試者遞送。僅在注射部位處觀察到短暫紅斑和水腫(burton等,2011,pharmres28:31-40)。hmts裝置不被視為針注射器，從而導致患者依從性改進。

在替代實施方案中，經皮膚遞送肽和蛋白質可以通過以下來進行：(1)如chen等(natbiotechnol2006;24:455-460)和carmichael等(pain2010;149:316-324)所報道，與包含acssspskhcg(seqidno:42)氨基酸序列的合成肽一起共同施用；(2)如wang等(bbrc2006;346:758-767)所報道，與富含精氨酸的細胞內遞送肽一起共同施用；(3)如uchida等(chempharmbull2011;59:196)所報道，與at1002(fcigrlcg，seqidno:43)或tat(grkkrrnrrrcg，seqidno:44)一起共同施用；或(4)如jurynczyk等(annneurol2010;68:593-601)所報道，使用粘附性經皮膚貼劑。另外，可以通過如kim等(intjpharm2008;362:20-28)所報道，與帶正電荷的、成孔的蛙皮素肽組合來促進帶負電荷的藥物的經皮膚遞送。

在以濃縮制劑形式來皮下施用、肌肉內施用或經皮膚施用抗體的優選實施方案中，施用的體積優選地限制于3ml或更少、更優選地2ml或更少、更優選地1ml或更少。相對于使用要求專門裝置和成分(例如，透明質酸酶)用于皮下施用更大體積的流體(如10ml或更多)的更稀釋的抗體制劑而言，使用允許低體積皮下施用、肌肉內施用或經皮膚施用的濃縮抗體制劑是優選的。皮下遞送、肌肉內遞送或經皮膚遞送可以作為單一施用而向一個皮膚部分施用，或替代地可以重復一次或多次，或甚至在一段治療給予時間內向多于一個皮膚部位給予。然而，制劑越濃縮，注射體積越低以及注射次數越少將是每次治療給藥所需要的。

使用方法

在優選的實施方案中，濃縮的抗體是對癌癥的治療有用的。癌癥的實例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、神經膠質瘤、黑素瘤、肉瘤以及白血病或淋巴樣惡性腫瘤。此類癌癥的更具體的實例在以下指出并且包括：鱗狀細胞癌(例如上皮鱗狀細胞癌)；肺癌，包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌和肺鱗狀癌；腹膜癌；肝細胞癌；胃部的癌癥或胃癌，包括胃腸癌；胰腺癌；成膠質細胞瘤；成神經細胞瘤；宮頸癌；卵巢癌；肝癌；膀胱癌；肝細胞瘤；乳癌；結腸癌；直腸癌；子宮內膜癌或子宮癌；唾液腺癌；腎臟癌或腎癌；前列腺癌；外陰癌；甲狀腺癌；肛門癌；陰莖癌以及頭頸部癌。術語“癌癥”包括原發性惡性腫瘤細胞或腫瘤(例如，其細胞除了遷移至原始惡性腫瘤或腫瘤的部位之外沒有遷移至受試者身體中的部位的那些)和繼發性惡性腫瘤細胞或腫瘤(例如，由代謝引起、惡性腫瘤細胞或腫瘤細胞遷移至不同于原始腫瘤部位的繼發部位的那些)。

癌癥或惡性腫瘤的其它實例包括但不限于：急性兒童成淋巴細胞性白血病、急性成淋巴細胞性白血病、急性淋巴細胞性白血病、急性骨髓樣白血病、腎上腺皮質癌、成人(原發性)肝細胞癌、成人(原發性)肝癌、成人急性淋巴細胞性白血病、成人急性骨髓樣白血病、成人霍奇金病、成人霍奇金淋巴瘤、成人淋巴細胞性白血病、成人非霍奇金淋巴瘤、成人原發性肝癌、成人軟組織肉瘤、aids-相關的淋巴瘤、aids-相關的惡性腫瘤、肛門癌、星形細胞瘤、膽管癌、膀胱癌、骨癌、腦干膠質細胞瘤、腦腫瘤、乳癌、腎盂和輸尿管癌癥、中樞神經系統(原發性)淋巴瘤、中樞神經系統淋巴瘤、小腦星形細胞瘤、腦星形細胞瘤、宮頸癌、兒童(原發性)肝細胞癌、兒童(原發性)肝癌、兒童急性成淋巴細胞性白血病、兒童急性骨髓樣白血病、兒童腦干神經膠質瘤、兒童小腦星形細胞瘤、兒童腦星形細胞瘤、兒童顱外生殖細胞腫瘤、兒童霍奇金病、兒童霍奇金淋巴瘤、兒童下丘腦和視覺途徑神經膠質瘤、兒童成淋巴細胞性白血病、兒童成神經管細胞瘤、兒童非霍奇金淋巴瘤、兒童松果體和幕上原始神經外胚層腫瘤、兒童原發性肝癌、兒童橫紋肌肉瘤、兒童軟組織肉瘤、兒童視覺途徑和下丘腦神經膠質瘤、慢性淋巴細胞性白血病、慢性骨髓性白血病、結腸癌、皮膚t-細胞淋巴瘤、內分泌胰腺胰島細胞癌、子宮內膜癌、室管膜瘤、上皮癌、食道癌、尤因氏肉瘤和相關的腫瘤、外分泌胰腺癌、顱外生殖細胞腫瘤、性腺外生殖細胞腫瘤、肝外膽管癌、眼癌、女性乳癌、膽囊癌、胃癌、胃腸道類癌腫瘤、胃腸腫瘤、生殖細胞腫瘤、妊娠性滋養細胞腫瘤、毛細胞白血病、頭頸部癌、肝細胞癌、霍奇金病、霍奇金淋巴瘤、高丙種球蛋白血癥、下咽癌、腸癌、眼內黑素瘤、胰島細胞癌、胰島細胞胰腺癌、卡波濟氏肉瘤、腎臟癌、喉癌、嘴唇和口腔癌癥、肝癌、肺癌、淋巴增殖病癥、巨球蛋白血癥、男性乳癌、惡性間皮瘤、惡性胸腺瘤、成神經管細胞瘤、黑素瘤、間皮瘤、轉移性隱匿性原發性鱗狀頸部癌癥、轉移性原發性鱗狀頸部癌癥、轉移性鱗狀頸部癌癥、多發性骨髓瘤、多發性骨髓瘤/漿細胞腫瘤、骨髓增生異常綜合征、骨髓性白血病、骨髓樣白血病、骨髓增生病癥、鼻腔和副鼻竇癌癥、鼻咽癌、成神經細胞瘤、孕期的非霍奇金淋巴瘤、非黑素瘤皮膚癌、非小細胞肺癌、隱匿性原發性轉移性鱗狀頸部癌癥、口咽癌、骨/惡性纖維肉瘤、骨肉瘤/惡性纖維性組織細胞瘤、骨骼的骨肉瘤/惡性纖維性組織細胞瘤、卵巢上皮癌、卵巢生殖細胞腫瘤、卵巢低惡性潛能腫瘤、胰腺癌、副蛋白血癥、紫癜、甲狀旁腺癌、陰莖癌、嗜鉻細胞瘤、垂體腫瘤、漿細胞腫瘤/多發性骨髓瘤、原發性中樞神經系統淋巴瘤、原發性肝癌、前列腺癌、腎癌、腎細胞癌、腎盂和輸尿管癌、成視網膜細胞瘤、橫紋肌肉瘤、唾液腺癌、結節病肉瘤、賽扎里綜合征、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟組織肉瘤、鱗狀頸部癌癥、胃癌、幕上原始神經外胚層和松果體腫瘤、t-細胞淋巴瘤、睪丸癌、胸腺瘤、甲狀腺癌、腎盂和輸尿管的移行細胞癌、移行腎盂和輸尿管癌、滋養細胞腫瘤、輸尿管和腎盂細胞癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉瘤、陰道癌、視覺途徑和下丘腦神經膠質瘤、外陰癌、華氏巨球蛋白血癥、維爾姆斯瘤以及除了位于以上列出的器官系統中的瘤形成以外的任何其它過度增生性疾病。

本文中所描述和要求保護的方法和組合物可以用來檢測或治療惡性或惡化前的病狀。此類用途指示在已知的或懷疑先前進展至瘤形成或癌癥的病狀中，具體來說，其中非瘤性細胞生長由過度增生、化生組成，或最具體來說，出現發育異常(針對此類異常生長病狀的綜述，參見robbins和angell,basicpathology.第2版,w.b.saundersco.,philadelphia,第68-79頁(1976))。

發育異常常常是癌癥的預兆，并且主要發現在上皮中。它是非瘤性細胞生長的最無序形式，涉及個體細胞均勻性和細胞建筑方向的損失。發育異常特征性地發生在存在慢性刺激或炎癥的情況下。可以被檢測的發育異常病癥包括但不限于：無汗性外胚層發育異常、前面發育異常、窒息性胸廓發育異常、心房-手指發育異常、支氣管肺發育異常、腦發育異常、宮頸發育異常、軟骨外胚層發育異常、鎖骨顱骨發育異常、先天性外胚層發育異常、顱骨骨干發育異常、顱腕跗發育異常、顱干骺端發育異常、牙本質發育異常、骨干發育異常、外胚層發育異常、牙釉質發育異常、頭顱-眼睛發育異常、偏側骨骺發育異常、多發性骨骺發育異常、點狀骨骺發育異常、上皮發育異常、臉指生殖器發育異常、下顎家族性纖維性發育異常、家族性白色皺裂發育異常、肌纖維發育異常、骨骼纖維性發育異常、旺盛骨性發育異常、遺傳性腎-視網膜發育異常、有汗性外胚層發育異常、無汗性外胚層發育異常、淋巴細胞減少性胸腺發育異常、乳腺結構發育異常、下顎面發育異常、干骺端發育異常、蒙底尼發育異常、單骨性纖維性發育異常、粘膜上皮發育異常、多發性骨骺發育異常、眼耳脊椎發育異常、眼齒指發育異常、眼脊椎發育異常、牙原性發育異常、眼下顎發育異常、根尖周牙骨質發育異常、多骨性纖維性發育異常、假性軟骨發育不全脊椎骨骺發育異常、視網膜發育異常、隔視發育異常、脊椎骨骺發育異常以及心室橈骨發育異常。

可以檢測和/或治療的額外的癌前病癥包括但不限于：良性異常增生病癥(例如，良性腫瘤、纖維囊性病狀、組織肥大、腸息肉、結腸息肉以及食道發育異常)、粘膜白斑病、角化病、鮑溫氏病、慢性光化性皮炎、日光性唇炎以及日光性角化病。

額外的過度增生性疾病、病癥和/或病狀包括但不限于：惡性腫瘤和相關病癥的進展和/或轉移，所述惡性腫瘤和相關病癥如白血病(包括急性白血病(例如，急性淋巴細胞性白血病、急性髓細胞性白血病(包括成髓細胞的、早幼粒細胞的、髓單核細胞的、單核細胞的以及紅白血病))和慢性白血病(例如，慢性髓細胞的(粒細胞的)白血病以及慢性淋巴細胞性白血病))、真性紅細胞增多、淋巴瘤(例如，霍奇金病和非霍奇金病)、多發性骨髓瘤、華氏巨球蛋白血癥、重鏈疾病；和實體瘤，包括但不限于肉瘤和癌，如纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、胰腺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝癌、膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎癌、維爾姆斯瘤、宮頸癌、睪丸腫瘤、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經膠質瘤、星形細胞瘤、成神經管細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管母細胞瘤、聽神經瘤、少突神經膠質瘤、腦膜瘤、黑素瘤、成神經細胞瘤以及成視網膜細胞瘤。

以上列出的可以被治療的示例性病狀不是限制性的。熟練的技術人員將意識到對于各種各樣的病狀而言，抗體或抗體片段是已知的，所述病狀如自身免疫性疾病、移植物抗宿主疾病、器官移植排斥反應、心血管疾病、神經退化性疾病、代謝疾病、癌癥、感染性疾病以及過度增生性疾病。

示例性的自身免疫性疾病包括：急性特發性血小板減少性紫癜、慢性特發性血小板減少性紫癜、皮肌炎、西登哈姆氏舞蹈病、重癥肌無力、系統性紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎、風濕熱、多腺體綜合征、大皰性類天皰瘡、尋常天皰瘡、糖尿病、亨-舍二氏紫癜、鏈球菌感染后腎炎、結節性紅斑、大動脈炎、愛迪生氏病、類風濕性關節炎、多發性硬化癥、結節病、潰瘍性結腸炎、多形性紅斑、iga腎病、結節性多動脈炎、強直性脊柱炎、古德帕斯丘氏綜合征、血栓閉塞性脈管炎、斯耶格倫氏綜合征、原發性膽汁性肝硬化、橋本氏甲狀腺炎、甲狀腺毒癥、硬皮癥、慢性活動性肝炎、多肌炎/皮肌炎、多軟骨炎、尋常天皰瘡、韋格納氏肉芽腫病、膜性腎病、肌萎縮性側索硬化癥、脊髓癆、巨細胞動脈炎/多肌痛、惡性貧血、急進性腎小球腎炎、牛皮癬以及纖維性肺泡炎。

感染性疾病可以由各種病原生物體(如細菌、病毒或支原體)引起。示例性的已知的感染性因子包括但不限于：無乳鏈球菌(streptococcusagalactiae)、嗜肺軍團菌(legionellapneumophilia)、釀膿鏈球菌(streptococcuspyogenes)、大腸桿菌(esherichiacoli)、淋球菌(neisseriagonorrhoeae)、腦膜炎雙球菌(neisseriameningitidis)、肺炎球菌(pneumococcus)、流感嗜血桿菌b(hemophilusinfluenzaeb)、梅毒左旋體(treponemapallidum)、萊姆病螺旋體(lymediseasespirochetes)、綠膿假單胞菌(pseudomonasaeruginosa)、麻風分支桿菌(mycobacteriumleprae)、流產布魯氏桿菌(brucellaabortus)、結核分支桿菌(mycobacteriumtuberculosis)、hiv-1、hiv-2、hiv-3、肝炎a、肝炎b、肝炎c、肝炎d、狂犬病病毒、流感病毒、巨細胞病毒、單純性皰疹i和單純性皰疹ii、人血清細小病毒樣病毒、呼吸道合胞體病毒、水痘帶狀皰疹病毒、肝炎b病毒、麻疹病毒、腺病毒、人t-細胞白血病病毒、愛潑斯坦-巴爾病毒、腮腺炎病毒、水皰性口炎病毒、辛德畢斯病毒、淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒、疣病毒、藍舌病毒、仙臺病毒、呼吸道腸孤兒病毒、脊髓灰質炎病毒、登革病毒、風疹病毒、惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、剛地弓形蟲、讓氏錐蟲、克氏錐蟲、羅德西亞錐蟲、布氏錐蟲、曼氏血吸蟲、日本血吸蟲、牛巴貝蟲、柔嫩艾美耳球蟲、盤尾絲蟲、熱帶利什曼蟲、旋毛蟲、小泰累爾氏梨漿蟲、水泡絳蟲、羊絳蟲、牛肉絳蟲、細粒棘球絳蟲、科特氏中殖孔絳蟲、關節炎支原體、豬鼻支原體(m.hyorhinis)、口腔支原體(m.orale)、精氨酸支原體(m.arginini)、萊氏阿原體、唾竇支原體(m.salivarium)以及肺炎支原體(m.pneumonia)。

套件

各種實施方案可以涉及套件，所述套件含有適用于治療患者中的患病組織的組分。示例性的套件可以含有如本文中所描述的至少一種濃縮的抗體或其片段。可以包括能夠通過注射遞送套件組分的裝置，如用于皮下注射的注射器。在使用經皮膚施用的情況下，遞送裝置(如空心微針遞送裝置)可以被包括在套件中。示例性的經皮膚遞送裝置是本領域中已知的，如3m的空心微結構經皮膚系統(hmts)，并且可以使用任何此類已知的裝置。

套件組分可以被包裝在一起或分開在兩個或更多個容器中。在一些實施方案中，容器可以是小瓶，所述小瓶含有適用于復水的組合物的無菌、凍干的制劑。套件還可以含有一種或多種適用于復水和/或稀釋其它試劑的緩沖劑。或者，可以作為液體制劑遞送和儲存濃縮的抗體。可以使用的其它容器包括但不限于小袋、托盤、盒、管等。套件組分可以被包裝并且無菌地維持在容器內。可以包括的另一種組件是提供給套件使用者的說明書。

具體實施方式

實施例1.hll2抗cd22抗體的純化

如在美國專利號5,789,554和6,187,287中所描述，hll2抗cd22抗體(依帕珠單抗)被設計、構建、克隆并且轉染至骨髓瘤宿主細胞中，每一個所述專利的實施例部分以引用的方式并入本文。使用適當的前導序列導致抗體分泌至無血清的細胞培養基中。可以通過離心去除細胞，并且例如在圖1中所示從培養基中純化抗體。

通常，在以下實施例中描述的針對hll2igg和其它抗體的純化過程特征為在蛋白質a、q-sepharose?以及sp-sepharose?的三個連續柱上的色譜法。雖然sepharose?用作示例性的柱色譜樹脂，但是熟練的技術人員將認識到色譜法的替代方法和替代色譜法樹脂是本領域中已知的并且可以被使用。此外，陰離子和陽離子交換步驟不限于q-sepharose?和sp-sepharose?，而是還可以使用本領域中已知的其它陰離子交換樹脂和陽離子交換樹脂。所述過程的最后一步使用了dv20病毒去除過濾，在所述過濾之后測試產物的無菌性。

用于第一根柱子的蛋白質a親和樹脂mabselect?(gehealthcare,piscataway,nj)的結合能力為25mg/ml至30mg/ml。將樹脂填充至40cm直徑柱子中達20cm高度處，達到25l的填充床體積，其中最大裝載能力為625gm。在裝載含抗體的培養基之前，用0.1m乙酸的20%乙醇溶液對填充柱進行消毒，并且然后用0.04mpbs(ph7.4)再生。平衡之后，在300厘米/小時的最大流速下裝載上清液。用0.04mpbs(ph7.4)洗滌柱子直到吸光度返回至基線，接著在300厘米/小時下用另外的5個床層體積的0.04mpbs(ph7.4)洗滌。

在300厘米/小時的最大流速下，用0.1m檸檬酸鹽(ph3.5)洗脫結合的igg。使用流穿式分光光度計，通過280nm處的吸光度來監測洗脫分布曲線。使用3mtris/hcl(ph8.6)將收集的產物峰中和至ph為7.0至8.0。作為額外的病毒去除步驟，使用1m檸檬酸將中和的產物峰滴定至ph為3.5至3.7。在室溫下將此混合物孵育四小時，并且在孵育結束時，使用3mtris/hcl(ph8.6)將所述混合物中和至ph為7.0至8.0。

然后將混合物濃縮至5mg/ml至7mg/ml，并且滲濾至制劑中的0.02mtris/hcl、0.01mnacl(ph8.2)用于接下來的純化步驟。所滲濾的經過蛋白質a純化的hll2igg通過0.2μm過濾器過濾，并且儲存在2℃至8℃下直到進一步純化。

用于下一根柱子的陰離子交換樹脂是q-sepharose?快速樹脂(gehealthcare,piscataway,nj)。將樹脂填充至40cm直徑柱子中達20cm高度處，達到25l的填充床體積，其中最大裝載能力為625gm。在裝載經過蛋白質a純化的igg之前，用1m氫氧化鈉對填充柱進行消毒，并且然后用0.02mtris/hcl、1.0mnacl(ph8.0)再生。然后使用0.02mtris/hcl、0.01mnacl(ph8.2)平衡樹脂。在100厘米/小時的流速下裝載所滲濾的經過蛋白質a純化的igg，并且在300厘米/小時的最大流速下用0.02mtris/hcl、0.01mnacl(ph8.2)洗脫流穿峰。從蛋白質a柱上洗脫下來的污染物結合至q-sepharose?樹脂。經過q-sepharose?純化的igg使用0.2μm過濾器過濾，并且儲存在2℃至8℃下直到進一步純化。在裝載于最終柱子上之前，使用1m檸檬酸將igg滴定至ph5.0。

用于最后一根柱子的陽離子交換樹脂是sp-sepharose?快速樹脂(gehealthcare,piscataway,nj)。將樹脂填充至40cm直徑柱子中達20cm高度處，其中最大裝載能力為625gm。在裝載經過q-sepharose?純化的hll2igg之前，用1m氫氧化鈉對填充柱進行消毒，并且然后用0.025m檸檬酸鹽(ph5.0)平衡。在300厘米/小時的最大流速下裝載igg，并且在300厘米/小時下用5個床層體積的0.025m檸檬酸鹽(ph5.0)洗滌柱子。然后在300厘米/小時的最大流速下，用0.025m檸檬酸鹽、0.15m氯化鈉(ph6.0)洗脫結合的igg峰。通過280nm處的吸光度監測洗脫分布曲線。

經過純化的hll2igg使用0.2μm過濾器過濾，并且在dv20過濾之前儲存在2℃至8℃下。將igg濃縮至9.5mg/ml至10.5mg/ml，并且然后滲濾至0.04mpbs、0.075%聚山梨酯80(ph7.4)中。然后igg通過0.2μm過濾器過濾進入無菌容器，然后通過0.1μm過濾器過濾進入無菌壓力器皿，然后通過20nm過濾器過濾用于病毒去除。

實施例2.hll1抗cd74抗體的純化

如在美國專利號7,312,318；7,772,373；7,919,087以及7,931,903中所描述，hll1抗cd74抗體(米拉珠單抗)被設計、構建、克隆并且轉染至骨髓瘤宿主細胞中，每一個所述專利的實施例部分以引用的方式并入本文。

通過以上實施例1中描述的基本上相同的實驗方案來純化hll1抗體，其中具有以下差異。將蛋白質a樹脂填充至20cm直徑柱子中的20cm高度處，從而提供6.3l的填充床體積。蛋白質a柱的最大裝載能力是220gm。將q-sepharose?柱填充至30cm直徑柱子中的20cm高度處達到14.1l的填充床體積，其中最大裝載能力為300gm。將sp-sepharose?柱填充至20cm直徑柱子中的20cm高度處，其中填充床體積為6.3l并且最大裝載能力為220gm。將經過純化的hll1igg濃縮至10mg/ml至11mg/ml用于dv20過濾。過濾之后，將75ml的0.04mpbs、1%聚山梨酯80(ph7.4)添加至每升的經過純化的igg中，并且在儲存于2^o至8℃之前通過0.2μm過濾器再次過濾混合物。

實施例3.hl243抗hla-dr抗體的純化

如在美國專利號7,612,180中所描述，hl243抗hla-dr抗體被設計、構建、克隆并且轉染至骨髓瘤宿主細胞中，所述專利的實施例部分以引用的方式并入本文。

通過以上實施例1中描述的基本上相同的實驗方案來純化hl243抗體(immu-114)，其中具有以下差異。將蛋白質a樹脂填充至20cm直徑柱子中的20cm高度處，從而提供6.3l的填充床體積。蛋白質a柱的最大裝載能力是220gm。在過濾和裝載在q-sepharose?柱上之前，將經過蛋白質a純化的igg濃縮至5mg/ml至7mg/ml并且滲濾至0.02mtris/hcl0.05mnacl(ph7.5)中。

將q-sepharose?柱填充至30cm直徑柱子中的20cm高度處達到14.1l的填充床體積，其中最大裝載能力為300gm。在用1m氫氧化鈉消毒之后，用0.02mtris/hcl、0.05mnacl(ph7.5)平衡樹脂。用0.02mtris/hcl、0.05mnacl(ph7.5)洗脫流穿峰。

將sp-sepharose?柱填充至20cm直徑柱子中的20cm高度處，其中填充床體積為6.3l并且最大裝載能力為220gm。在裝載和洗滌之后，用0.025m檸檬酸鹽、0.15mnacl(ph6.0)洗脫igg。

將經過純化的hl243igg濃縮至10mg/ml至11mg/ml并且滲濾至0.04mpbs(ph7.4)中，然后在dv20過濾之前通過0.2μm和0.1μm過濾器過濾。過濾之后，將75ml的0.04mpbs、1%聚山梨酯80(ph7.4)添加至每升的經過純化的igg中，并且在儲存于2^o至8℃之前通過0.2μm過濾器再次過濾混合物。

實施例4.hl243抗hla-dr抗體的同種型

如在以上實施例3中所描述制備hl243抗hla-dr抗體。如先前所描述(losman等,1997.cancer,80:2660)，通過分別將hl243vκ和hl243vh的xbai-bamhi和xhoi/noti片段連續亞克隆至pdhl2中來構建表達載體hl243pdhl2。如gilles等(1989.j.immunol.methods125:191)所描述，表達載體pdhl2含有人γ1鏈的基因組序列，因此hl243是igg1/k同種型。

為了構建用于hl243的其它同種型(如igg4/k)的表達載體，人γ1鏈的序列被人γ4鏈的序列替換，所述人γ4鏈的序列通過pcr擴增獲得。所使用的模板是從atcccrl-11397細胞中提取的基因組dna，并且引物對如下。

sacii

ccgcggtcacatggcaccacctctcttgcagcttccaccaagggccc(seqidno:35)

eagi

ccggccgtcgcactcatttacccagagacaggg(seqidno:36)

將擴增的pcr產物克隆至topo?ta測序載體(invitrogen?)中，并且通過dna測序證實所述序列。

將點突變ser241pro(基于kabat編號)引入至γ4序列的鉸鏈區中以避免當igg4抗體在哺乳動物細胞培養物中表達時形成半分子(schuurman等,2001,mol.immunol.38:1)。在psti與stui限制位點(56bp)之間的人γ4鉸鏈區被合成dna片段替換，其中ser241的tca密碼子置換成pro的ccg密碼子。hl243pdhl2中的人γ1序列被突變的γ4序列置換，從而產生最終的表達載體(指定為hl243γ4ppdhl2)用于igg4同種型hl243。igg4同種型被用于隨后的治療功效實驗。

hl243igg4p重鏈和hl243輕鏈的氨基酸序列在圖8中示出。

實施例5.ha20抗cd20抗體的純化

如在美國專利號7,151,164和7,435,803中所描述，ha20抗cd20抗體(維妥珠單抗)被設計、構建、克隆并且轉染至骨髓瘤宿主細胞中，所述專利的實施例部分以引用的方式并入本文。

通過以上實施例1中描述的基本上相同的實驗方案來純化ha20抗體，其中具有以下差異。將具有30mg/ml最大裝載能力的蛋白質a樹脂填充至20cm直徑柱子中的19cm至21cm高度處，從而提供6.0l至6.6l的填充床體積。蛋白質a柱的最大裝載能力是近似180gm。用1m檸檬酸將經過蛋白質a純化的igg滴定至ph為3.6至3.8用于病毒去除。

將q-sepharose?柱填充至30cm直徑柱子中的19cm至21cm高度處達到13.4l至14.9l的填充床體積，其中最大裝載能力為300gm。裝載之后，用0.2mtris/hcl、0.01mnacl(ph8.0)洗脫流穿峰。

將sp-sepharose?柱填充至20cm直徑柱子中的19cm至21cm高度處，其中填充床體積為6.0l至6.6l并且最大裝載能力為180gm。在裝載和洗滌之后，用0.025m檸檬酸鹽、0.15mnacl(ph6.0)洗脫igg。

將經過純化的ha20igg濃縮至10mg/ml至11mg/ml并且滲濾至0.04mpbs(ph7.4)中，然后在dv20過濾之前通過0.2μm和0.1μm過濾器過濾。過濾之后，將75ml的0.04mpbs、1%聚山梨酯80(ph7.4)添加至每升的經過純化的igg中，并且在儲存于2℃至8℃之前通過0.2μm過濾器再次過濾混合物。

實施例6.人源化抗體在高濃度制劑緩沖液中的超濾濃縮

使用超濾，在高濃度制劑(hcf)緩沖液中將人源化的igg濃縮到至少200mg/ml，具有最少的聚集或沒有聚集。進行一系列的分析測定以監測濃縮過程期間的任何變化。沒有觀察到抗體品質或溶液特征的可檢測變化。在2℃至8℃下，液體制劑穩定至少12個月。通過se-hplc(其顯示出在吸光度跡線上基本是單個峰，圖4至圖6)在12個月中評估的穩定性是在97%至99%之間(表4)。還原性和非還原性page與hplc結果一致(圖2a至2b)。制劑適用于皮下注射(sc)。測試的示例性抗體包括米拉珠單抗(hll1，抗cd74)、依帕珠單抗(hll2，抗cd22)、維妥珠單抗(ha20，抗cd20)以及hl243(抗hla-dr；immu-114)。

開發了高濃度制劑(hcf)緩沖液，其顯示出能夠使抗體溶液穩定到至少200mg/ml濃度(表3)。除了來自iv制劑的磷酸鹽緩沖液和nacl之外，此sc制劑含有甘露醇和聚山梨酯80，所述甘露醇已經使用在蛋白質制劑中用于維持穩定性和等滲性，所述聚山梨酯80(ps-80)保護抗體以防聚集。因為大多數人源化igg1抗體的pi值是在8至9.5之間，所以使用檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖液系統(在2.5至5.6范圍內緩沖)和低ph(5.2)以確保蛋白質處于帶電荷的形式，并且因而在溶液中更穩定。

在超濾過程中使用了50kdmw阻截膜，這種截留膜保留并且濃縮150kdigg分子而允許制劑緩沖液中的水和小分子穿過。

hcf緩沖液的溶質濃度是6.2mm一水合檸檬酸、105mm氯化鈉、1.2mm二水合檸檬酸鈉、8.7mm磷酸氫二鈉、5.5mm磷酸二氫鈉、66mm甘露醇，ph為5.2，電導率為11.0ms/cm至14.0ms/cm。

使用具有50kd聚醚砜過濾器nmwl(來自millipore?，直徑44.5mm)的amicon?model8050攪拌式超濾單元(來自millipore?，50ml最大體積)來濃縮抗體。使用超純氬氣使系統加壓。

組裝具有50kd膜的uf單元并且連接至氬氣供應。沖洗所述單元并且用緩沖液填充。隨著攪拌器開動，施加壓力以使多于兩個體積的hcf緩沖液運行穿過膜。從這點開始，將膜維持在濕潤的狀態。

在沖洗攪拌的單元室之后，排出殘留的緩沖液并且用igg溶液填充所述單元。然后啟動攪拌板并且施加壓力。將抗體溶液濃縮至近似一半(1/2)的原始體積，然后使用hcf緩沖液(5倍滲余物體積)滲濾。重復所述過程3至4次直到滲濾完成，并且檢查以確保濾液的ph和電導率與hcf緩沖液相同。

濃縮后，添加聚山梨酯80以使得聚山梨酯的最終濃度為0.1%。然后igg通過0.22μm過濾器過濾，放置于透明玻璃小瓶中，并且儲存在2℃至8℃下直到進行分析測試。

在光照下對著暗的背景目測每個樣品中的任何微粒和沉淀。在連續稀釋之后，通過uv(od280)吸光度測量igg蛋白質濃度。使用預制的4%至20%梯度的凝膠進行sds-page。在存在(還原性凝膠)或不存在(非還原性凝膠)3%2-巰基乙醇溶液的情況下，在95℃將10μl約1mg/ml樣品加熱3分鐘。用0.1%考馬斯藍對凝膠進行染色。使用ph為6至10.5的梯度凝膠，通過標準技術進行等電聚焦(ief)。將樣品稀釋至2mg/ml，并且連同pi標記物和參比標準各自施加5μl。用考馬斯藍對凝膠進行染色并且掃描用于定量pi范圍。

使用具有bio-sil?sec250柱的beckman?hplc系統(model116)進行尺寸排阻hplc(se-hplc)。將樣品稀釋至約1mg/ml并且注射60μl。洗脫緩沖液主要由0.05mnah2po4、0.05mna2hpo4以及1mmedta組成，ph為6.8。通過280nm處的uv吸光度監測洗脫。

所有的分析結果概述在表4中。顯示了sds-page凝膠(圖2a非還原性和圖2b還原性)、ief凝膠(圖3)以及se-hplc色譜圖(圖4至圖6)。可以看出，在hcf緩沖液中將igg從101mg/ml超濾濃縮至213mg/ml不會導致經過純化的igg的任何可檢測的變化。

本研究證明了在hcf緩沖液中，igg可以通過超濾濃縮至213mg/ml來濃縮而不具有任何可見的聚集或沉淀作用。也維持了抗體的其它品質方面，如分子完整性、電荷變化以及溶液ph。

實施例7.用于皮下注射或肌肉內注射的高蛋白濃度抗體制劑

用于皮下施用或肌肉內施用的替代高濃度制劑可以包含氨基酸，如精氨酸或谷酰胺。使用包含糖甘露醇和/或氨基酸精氨酸和谷氨酸的三種不同制劑，針對依帕珠單抗(人源化的抗cd22)確定不具有沉淀而可達到的最大蛋白質濃度的比較(表5)。

將依帕珠單抗施加至40mlmabselect?(蛋白質a)親和色譜柱，所述柱用磷酸鹽緩沖鹽水并且然后用去離子水(dih20)洗滌以使聚山梨酯80從原始塊體材料中去除。用80ml的0.05m檸檬酸鈉(ph3.5)洗脫抗體。通過添加132ml的0.1mnah2po4中和洗出液并且通過添加60ml的1ml-精氨酸一鹽酸鹽/1ml-谷氨酸(一鈉鹽)溶液和39.6ml的1m甘露醇而配制成cprem緩沖液，用hcl調節至ph5.3并且用去離子h2o稀釋至600ml。最終的cprem制劑含有66mm甘露醇、100mm精氨酸、100mm谷氨酸、144mmna、100mmcl、7.3mm檸檬酸鹽、22mm磷酸鹽，ph為5.3。通過280nm(od280)處的uv分光光度法測量蛋白質濃度為2.56mg/ml。

使用具有50kdamwco膜的攪拌單元濃縮器將600ml溶液濃縮120倍。通過od280測量120倍濃縮物中的蛋白質濃度為238mg/ml。通過目測和se-hplc跡線表明不存在明顯的沉淀作用，所述se-hplc跡線與濃縮前的材料的se-hplc跡線不能區分，表明沒有證據證明聚集(數據未示出)。將120倍的濃縮物分成三個等分試樣。

將一個等分試樣(0.5ml)的120倍濃縮物(238mg/ml)維持在cprem制劑中并且進一步濃縮至170倍(0.35ml)，并且通過od280測量為298mg/ml的蛋白質濃度，沒有明顯沉淀作用。se-hplc分析分辨出與濃縮前材料相同的跡線而不具有聚集(數據未示出)。由于高粘度和極限體積，沒有嘗試進一步濃縮30%的蛋白質溶液。

將第二等分試樣滲濾至cpre緩沖液(100mm精氨酸、100mm谷氨酸、144mmna、100mmcl、7.3mm檸檬酸鹽、22mm磷酸鹽，ph為5.3)中，所述cpre緩沖液是不具有甘露醇的cprem緩沖液。濃縮cpre蛋白質溶液直到沉淀物明顯。這時，終止濃縮并且過濾溶液。通過od280測量經過過濾的濃縮物中的蛋白質濃度為99mg/ml。

將第三等分試樣滲濾至cpm緩沖液(66mm甘露醇、144mmna、100mmcl、7.3mm檸檬酸鹽、22mm磷酸鹽，ph為5.3)中，所述cpm緩沖液是不具有精氨酸和谷氨酸的cprem。濃縮cpm蛋白質溶液直到沉淀物明顯。這時，終止濃縮并且過濾溶液。通過od280測量經過過濾的濃縮物中的蛋白質濃度為137mg/ml。

這些結果表明，將精氨酸和谷氨酸添加至實施例6的hcf緩沖液中增加了可以維持而不具有沉淀的最大抗體濃度，高達至少300mg/ml。此外，因為可以在hcf緩沖液中獲得的hll1抗體的最大濃度不高于其它測試抗體所獲得的最大濃度，并且基本上低于hcf緩沖液中hll1抗體所獲得的最大濃度(表4)，預計對于其它高度濃縮的抗體而言可以獲得可比的不具有沉淀的穩定抗體濃度的增加。

表5.高濃度依帕珠單抗制劑

每種制劑含有144mmna、100mmcl、7.3mm檸檬酸鹽、22mmpo4，ph5.3

c^max，在蛋白質沉淀點^?或極限粘度*下的最大可達到濃度

實施例8.在非霍奇金淋巴瘤(nhl)中低劑量維妥珠單抗的皮下注射

如以上實施例5和實施例6中所描述，制備維妥珠單抗用于皮下施用。具有先前未治療的或復發的nhl的十七位患者每兩周接受皮下注射的80mg、160mg或320mg維妥珠單抗的4次給藥(negrea等,2011,haematologica96:567-573)。通過ct掃描評估反應，而其它評價包括不良事件、b細胞血液水平、血清維妥珠單抗水平以及人抗維妥珠單抗(haha)滴度。

采用皮下注射僅看到偶然的、輕微至中等的短暫注射反應，并且沒有觀察到其它安全問題。皮下注射的維妥珠單抗在幾天的時間里展現出緩慢的釋放模式，其中在每次注射80mg、160mg或320mg的劑量下的平均最大血清濃度為19μg/ml、25μg/ml以及64μg/ml。在維妥珠單抗的所有劑量水平下觀察到短暫的b細胞耗盡。目標反應率(部分反應加上完全反應加上未證實的完全反應)是47%(8/17)，其中完全反應/未證實的完全反應率是24%(4/17)。八個目標反應中有四個持續了60周或更久。在皮下注射的維妥珠單抗的所有劑量水平下觀察到目標反應。對于人抗維妥珠單抗抗體(haha)而言評價的所有血清樣品是陰性。

結論是，在惰性非霍奇金淋巴瘤中皮下注射低劑量維妥珠單抗是方便的、耐受良好的并且能夠達到持續的血清水平、b細胞耗盡以及持久的目標反應。

實施例9.在免疫性血小板減少性紫癜(itp)中低劑量維妥珠單抗的皮下注射

血小板計數低于30×10⁹并且經歷了至少一種標準治療失敗的的十一位成人慢性itp患者兩周分開地接受靜脈內(n=7)或皮下(n=4)施用的80mg或120mg維妥珠單抗的2次給藥。9位可評價的患者之中，總目標反應率是67%，其中33%的患者具有完全反應。對于在研究之前沒有經歷手術脾臟去除的6位患者小組而言，反應率是100%，不管施用路徑和跨越所測試的兩次給藥。更重要的是，小組的50%對維妥珠單抗完全反應，并且在治療后的6周、6個月以及9個月內繼續維持它們的血小板水平。對于已經經歷脾臟切除的3位患者而言，對治療都沒有反應。皮下和靜脈內注射維妥珠單抗均導致b細胞耗盡。一位患者對靜脈內注射的維妥珠單抗具有輸注反應并且中斷治療。兩位其它的患者對靜脈內注射維妥珠單抗具有微小的免疫原性反應。沒有觀察到其它的安全問題，并且接受皮下注射維妥珠單抗的患者都沒有展現出免疫原性反應。

本研究證明了，維妥珠單抗用于itp治療的方便性、安全性及功效以及皮下注射維妥珠單抗用于減少對抗體施用的免疫原性反應的優越性。

實施例10.在慢性淋巴細胞性白血病(cll)中低劑量依帕珠單抗的皮下注射

具有先前未治療的或復發的cll的患者每周或每兩周接受皮下注射的80mg、160mg或320mg依帕珠單抗的4次給藥。還可以每周兩次施用分開的劑量。采用皮下注射僅看到偶然的、輕微至中等的短暫注射反應，并且沒有觀察到其它安全問題。皮下注射的依帕珠單抗在幾天的時間里展現出緩慢的釋放模式。在所有依帕珠單抗的劑量水平下觀察到短暫的b細胞耗盡，但在兩個最高劑量下給予至少4周時更顯著。在皮下注射的依帕珠單抗的所有劑量水平下觀察到目標反應，但在最高劑量下具有特別為30%的高反應(大多數是部分反應)。對于人抗依帕珠單抗抗體(haha)而言評價的所有血清樣品是陰性。

結論是，在cll中皮下注射低劑量依帕珠單抗是方便的、耐受良好的并且能夠達到持續的血清水平、b細胞耗盡以及持久的目標反應。

實施例11.在系統性紅斑狼瘡(sle)中低劑量依帕珠單抗的皮下注射

如以上實施例1和實施例5或6中所描述，制備依帕珠單抗用于皮下施用。如以上實施例1和實施例5或6中所描述，制備依帕珠單抗用于皮下施用。對具有中等活性sle(總的大不列顛群島狼瘡評估組(bilag)得分6至12)的14位患者進行了開放標簽的、單中心研究。患者每周皮下接受400mg依帕珠單抗，持續6周。評價包括安全性、sle活性(bilag)、b細胞和t細胞的血液水平以及人抗依帕珠單抗抗體(haha)滴度。在所有14位患者中，總bilag得分減少至少50%，其中92%的減少連續至少18周。在6周、10周以及18周時，幾乎所有患者(93%)經歷了至少一個bilagb級或c級疾病活動性的改善。另外，在基線具有多個bilagb受累的3位患者到18周為止已經完全解決了所有的b級疾病活動性。依帕珠單抗是耐受良好的，不具有免疫原性證據或t細胞、免疫球蛋白或自身抗體水平的明顯變化。在18周時，b細胞水平平均減少了35%并且治療后保持降低6個月。這些結果證明了皮下依帕珠單抗用于治療sle的安全性和功效。

實施例12.在多發性骨髓瘤中米拉珠單抗的皮下注射

如以上實施例1和實施例6中所描述，制備米拉珠單抗用于皮下施用。經歷了至少兩種標準治療失敗的具有復發的多發性骨髓瘤的患者每周一次接受皮下注射的300mg作為裸抗體的米拉珠單抗的10次給藥。通過ebmt標準對反應進行分類，其中pk和免疫原性分別通過血清米拉珠單抗水平和人抗米拉珠單抗抗體(haha)滴度來評價。采用皮下注射僅看到偶然的、輕微至中等的短暫注射部位反應，并且沒有觀察到其它安全問題。皮下注射的米拉珠單抗在幾天的時間里展現出緩慢的釋放模式。如通過血清輕鏈、igm、循環的和骨髓的骨髓瘤細胞減少所測量，在皮下注射的米拉珠單抗的此劑量水平下觀察到目標反應，并且由于骨髓功能改善，患者的血小板、血紅蛋白以及wbc水平得到改善。對于人抗米拉珠單抗抗體(haha)而言評價的所有血清樣品是陰性。

皮下注射裸米拉珠單抗與硼替佐米、阿霉素或地塞米松的聯合治療被觀察到改善了多發性骨髓瘤患者的反應，如在臨床前模型中所示(stein等,2009,clincancerres15:2808-17)。米拉珠單抗與硼替佐米、阿霉素或地塞米松的聯合治療產生了大于單獨地米拉珠單抗、單獨地藥物所觀察到或單獨施用的抗體或藥物的組合作用的治療作用。組合導致要求藥物的最佳劑量明顯減少。

結論是，在多發性骨髓瘤中皮下注射米拉珠單抗是方便的、耐受良好的并且能夠達到持續的血清水平和持久的目標反應。

實施例13.從g1m1至ng1m1的同種異型轉化降低了igg1治療性抗體的免疫原性

由具有g1m17,1同種異型的完全人單克隆抗體構建阿達木單抗(抗tnfα抗體)。阿達木單抗被批準用于治療各種自身免疫性疾病，如類風濕性關節炎、牛皮癬關節炎、強直性脊柱炎、克羅恩氏病、牛皮癬以及幼年特發性關節炎。已知阿達木單抗在一些經過阿達木單抗治療的患者中誘導抗球蛋白反應，并且對抗阿達木單抗的抗體與對治療無反應相關(bartelds等,2010,arthritisresther12:r221)。

通過制作重鏈置換k214r、d356e以及l358m，利用位點定向誘變將阿達木單抗從g1m17,1同種異型轉變成g1m3同種異型，從而產生g1m3-阿達木單抗。

向患者施用原生阿達木單抗和g1m3-阿達木單抗，所述患者對于g1m17,1而言是純合的、對于g1m17,1和g1m3而言是雜合的或對于g1m3而言是純合的。觀察到在接受者中同種異型工程化的g1m3-阿達木單抗誘導了更低的免疫反應率，其中要求終止施用的免疫反應更少。出人意料地，改變成g1m3-阿達木單抗導致了g1m17,1純合子中的免疫反應比g1m3純合子中的免疫反應減少更大。

這些結果證明，抗體同種異型從g1m1變化至ng1m1可以導致治療性抗體的免疫原性降低。

實施例14.治療性抗體的經皮膚施用

3m空心微結構經皮膚系統(hmts)被用于通過經皮膚施用來遞送濃縮的抗體組合物(burton等,2011,pharmres28:31-40)。在高達0.25ml/min的速率下施用濃度在100mg/ml至300mg/ml之間的高達1.5ml的抗體制劑。在貼劑去除之后立即觀察到紅色斑(hmts陣列的大小)，但貼劑去除后10min所述紅色斑褪去為幾乎不可辨別。除了此短暫的局部反應之外，沒有觀察到其它的輸注相關不良反應。施用全抗體或抗體片段。通過經皮膚遞送而施用的抗體包括維妥珠單抗、米拉珠單抗、依帕珠單抗、阿達木單抗以及西妥木單抗(clivatuzumab)。治療功效和pk分布曲線類似于使用皮下施用相同的抗體所觀察到的那些。

如以上實施例5和實施例6中所描述，制備維妥珠單抗用于皮下施用。具有先前未治療的或復發的nhl的患者每兩周使用3mhmts裝置接受經皮膚注射的80mg、160mg或320mg維妥珠單抗的4次給藥(negrea等,2011,haematologica96:567-573；burton等,2011,pharmres28:31-40)。通過ct掃描評估反應，而其它評價包括不良事件、b細胞血液水平、血清維妥珠單抗水平以及人抗維妥珠單抗(haha)滴度。

采用經皮膚注射僅看到偶然的、輕微至中等的短暫注射反應，并且沒有觀察到其它安全問題。經皮膚的維妥珠單抗在幾天的時間里展現出緩慢的釋放模式。在維妥珠單抗的所有劑量水平下觀察到短暫的b細胞耗盡。目標反應率(部分反應加上完全反應加上未證實的完全反應)是45%，其中完全反應/未證實的完全反應率是25%。一半的目標反應持續了60周或更久。在經皮膚的維妥珠單抗的所有劑量水平下觀察到目標反應。對于人抗維妥珠單抗抗體(haha)而言評價的所有血清樣品是陰性。

結論是，在惰性非霍奇金淋巴瘤中經皮膚施用低劑量維妥珠單抗是方便的、耐受良好的并且能夠達到持續的血清水平、b細胞耗盡以及持久的目標反應。

實施例15.用于預靶向的雙特異性抗體的皮下注射

抗trop2雙特異性抗體

trop2(又稱為上皮糖蛋白-1或egp-1)是在幾乎所有前列腺癌(pc)上、在高水平下表達的泛癌標記物。通過如在以上0077至0081段中所描述的對接和鎖定技術，使用hrs7和679抗體來制作雙特異性抗體tf12(抗trop2x抗hsg)。tf12有效地靶向pc，并且提供良好的腫瘤攝取。在具有皮下注射的pc3腫瘤的小鼠中研究了使用tf12和¹⁷⁷lu-標記的dihsg-肽(imp288)的預靶向的放射免疫治療(prit)的功效。

用皮下注射的人pc3腫瘤對五組無胸腺小鼠(n=10)進行異種移植。用2.5nmol的tf12對小鼠進行皮下注射，接著在16h之后靜脈內注射0.1nmol放射性標記的imp288。將用tf12/¹⁷⁷lu-imp288(41mbq)的一個或兩個周期(分開48h)prit的治療功效與在mtd(11mbq¹⁷⁷lu-hrs7)下用¹⁷⁷lu-標記的抗trop2mab的常規rit的治療功效進行比較。對照組接受pbs或不具有用tf12預靶向的¹⁷⁷lu-imp288(41mbq)。

經過一個周期prit治療的小鼠顯示出中位存活率改進(121天對82天)。與僅有一個周期相比，兩個周期的prit顯著增強中位存活率(>160對121天，p<0.0001)。兩個周期的prit的治療功效與用¹⁷⁷lu-hrs7的rit沒有顯著不同(p=0.067)，但經過prit治療的小鼠顯示出更低的血液學毒性。使用rit的白細胞減少量比使用prit所觀察的白細胞減少量顯著更高(67%對38%，p=0.028)。在150天之后，與對照組中沒有小鼠是活的相比，經過兩個周期的prit治療的70%的小鼠和經過常規rit治療的所有小鼠仍然是活的。

tf12結合¹⁷⁷lu-imp288的預靶向是用于前列腺癌的特異性放射免疫治療的優良系統。通過添加額外周期的prit來明顯增強功效。鑒于有限的毒性，存在額外治療周期或更高劑量¹⁷⁷lu-imp288的空間。

抗cd20雙特異性抗體

cd20是腫瘤相關的抗體(taa)，所述抗體是在各種各樣的血液學癌癥和自身免疫性疾病中用于基于抗體的治療的重要靶標。根據sharkey等(2008,cancerres68:5282-90)制作包含ha20(抗cd20)xh679(抗hsg)的tf4雙特異性抗體。

通過皮下注射向具有拉莫斯b細胞淋巴瘤的裸鼠施用tf4雙特異性抗體。在抗體施用前2至4周，將拉莫斯細胞(1×10⁷)皮下植入6至8周齡雌性balb/c裸鼠中。施用0.125nmol至1.0nmol范圍內的量的tf4抗體，接著在29h后施用⁹⁰y-標記的imp288(sharkey等,2008,cancerres68:5282-90)。使用20倍的tf4與可靶向構建體肽的比率來獲得最佳結果。

通過在肝臟、脾臟以及腎臟中處理，tf4雙特異性抗體快速地從血液中清除。在24小時時，tf4將標記的肽的腫瘤攝取提高2.6倍并且與抗cd20fabx抗hsgfab化學綴合物相比使腫瘤與血液的比率增加45倍，并且與放射性標記的抗cd20igg相比分別增加1.6倍和1,600倍。在⁹⁰y-標記的抗cd20igg的最大劑量下觀測到wbc的重度(>90%)和持久的減少，而預靶向導致<60%減少。tf4預靶向導致存活率高度顯著的改進，甚至在相對低的劑量下治愈了33%至90%的動物，而當用⁹⁰y-標記的抗cd20igg治療時大多數腫瘤快速地進展。

實施例16.用于癌癥治療的雙特異性抗體的施用

抗cd20x抗cd22雙特異性抗體

cd20和cd22抗原廣泛地表達在造血系統來源的癌癥中。已經證明了利用抗cd20和抗cd22抗體的聯合治療比單獨地任一藥劑更有功效并且對治療耐單一藥劑治療的癌癥有用(例如，leonard等,2005,jclinoncol23:5044-51；qu等,2008,blood111:2211-19；gupta等,2010,blood116:3258-67)。使用本文中公開的技術，利用不同抗體的治療可以作為單獨抗體的組合或作為雙特異性抗體構建體而施用。

通過如先前所描述的對接和鎖定(dnl)技術(美國專利號7,521,056；7,527,787；7,534,866；每一個所述專利的實施例部分以引用的方式并入本文)制備包含抗cd20抗體維妥珠單抗和抗cd22抗體依帕珠單抗的雙特異性構建體。如以上實施例6和實施例7中所描述，制備在100mg/ml與300mg/ml之間的雙特異性dnl構建體的濃縮溶液。通過每周一次持續四周、在每次注射200mg至600mg范圍內的劑量下的皮下注射而向具有復發的b細胞淋巴瘤患者施用濃縮的雙特異性dnl構建體。針對惰性組織學(包括濾泡性淋巴瘤)、侵襲性nhl和dlbcl選擇患者。

治療是耐受良好的，具有最小的輸注相關的短暫反應。超過60%的具有濾泡性nhl的患者達到目標反應(or)，其中超過50%是完全反應(cr)。超過60%的具有dlbcl的患者達到具有50%cr的or。所有惰性nhl患者的中位疾病進展期是17.8個月。

結論是，用抗cd22x抗cd20雙特異性抗體的治療對治療造血系統腫瘤是有功效的，具有與單一抗體治療相比改進的功效和減少的毒性。

抗cd20x抗cd74雙特異性抗體

如先前所描述(gupta等,2012,blood119:3767-78)制備了包含維妥珠單抗(抗cd20)和米拉珠單抗(抗cd74)的雙特異性dnl抗體構建體。如在以上實施例6和實施例7中所描述，制備雙特異性的抗cd20x抗cd74dnl構建體的濃縮制劑，并且通過皮下注射而向具有套細胞淋巴瘤(mcl)和其它淋巴瘤或白血病的受試者施用。

通過雙特異性抗體而在mcl細胞上的cd20和cd74的并置導致同型粘附并且觸發細胞內變化，所述細胞內變化包括線粒體跨膜電位損失、活性氧物質產生、erk和jnk快速持續的磷酸化、pakt和bcl-xl下調以及溶酶體膜通透化，從而導致細胞死亡。雙特異性抗體以劑量依賴的方式顯著延長了帶有mcl異種移植物的裸鼠的存活率。通過暴露于雙特異性抗體還耗盡了其它的淋巴瘤和白血病細胞系。結果證明了抗cd20x抗cd74雙特異性抗體構建體用于治療造血系統腫瘤的體外和體內功效。

在本說明書中引用的所有專利和其它引用文獻指示本發明所屬領域的技術人員的技術水平，并且以引用的方式并入本文，包括任何表和圖，其并入程度如同每個引用文獻單獨地以引用的方式并入一樣。

本領域技術人員將容易地理解，本發明充分適合于獲得所提及的以及其中固有的目標和優點。作為目前代表性優選實施方案的本文中描述的方法、變量以及組合物是示例性的并且不旨在限制本發明的范圍。對于本領域技術人員而言，將出現其中的變化和其它用途，所述變化和用途涵蓋在本發明內。

序列表

<110>immunomedics,inc.

<120>用于小體積施用的同種異型選擇的抗體的超濾濃縮

<130>imm332wo1

<140>

<141>

<150>61/509,850

<151>2011-07-20

<150>61/481,489

<151>2011-05-02

<160>44

<170>patentin版本3.5

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的說明：合成寡核苷酸

<400>1

aatgcggcggtggtgacagta21

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的說明：合成寡核苷酸

<400>2

aagctcagcacacagaaagac21

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的說明：合成寡核苷酸

<220>

<223>組合dna/rna分子的說明：合成寡核苷酸

<220>

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<222>(20)..(21)

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uaaaaucuuccugcccacctt21

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<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的說明：合成寡核苷酸

<220>

<223>組合dna/rna分子的說明：合成寡核苷酸

<220>

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<222>(20)..(21)

<223>dt

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ggaagcuguuggcugaaaatt21

<210>5

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<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的說明：合成寡核苷酸

<400>5

aagaccagccucuuugcccag21

<210>6

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的說明：合成寡核苷酸

<400>6

ggaccaggcagaaaacgag19

<210>7

<211>17

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的說明：合成寡核苷酸

<400>7

cuaucaggaugacgcgg17

<210>8

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的說明：合成寡核苷酸

<400>8

ugacacaggcaggcuugacuu21

<210>9

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的說明：合成寡核苷酸

<400>9

ggtgaagaagggcgtccaa19

<210>10

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的說明：合成寡核苷酸

<400>10

gatccgttggagctgttggcgtagttcaagagactcgccaacagctccaacttttggaaa60

<210>11

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的說明：合成寡核苷酸

<400>11

aggtggtgttaacagcagag20

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<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的說明：合成寡核苷酸

<400>12

aaggtggagcaagcggtggag21

<210>13

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的說明：合成寡核苷酸

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aaggagttgaaggccgacaaa21

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<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的說明：合成寡核苷酸

<220>

<223>組合dna/rna分子的說明：合成寡核苷酸

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<222>(20)..(21)

<223>dt

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uauggagcugcagaggaugtt21

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<223>人工序列的說明：合成寡核苷酸

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<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的說明：合成寡核苷酸

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aatgagaaaagcaaaaggtgccctgtctc29

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<212>rna

<213>人工序列

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<223>人工序列的說明：合成寡核苷酸

<400>17

aaucaucaucaagaaagggca21

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<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的說明：合成寡核苷酸

<220>

<223>組合dna/rna分子的說明：合成寡核苷酸

<220>

<221>modified_base

<222>(20)..(21)

<223>dt

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augacugucaggauguugctt21

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<212>rna

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gaacgaauccugaagacaucu21

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<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的說明：合成寡核苷酸

<400>20

aagcctggctacagcaatatgcctgtctc29

<210>21

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的說明：合成寡核苷酸

<220>

<223>組合dna/rna分子的說明：合成寡核苷酸

<220>

<221>modified_base

<222>(20)..(21)

<223>dt

<400>21

ugaccaucaccgaguuuautt21

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<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的說明：合成寡核苷酸

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aagtcggacgcaacagagaaa21

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<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的說明：合成寡核苷酸

<220>

<223>組合dna/rna分子的說明：合成寡核苷酸

<220>

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<222>(20)..(21)

<223>dt

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cuaccuuucuacggacgugtt21

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<213>人工序列

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ctgcctaaggcggatttgaat21

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<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的說明：合成寡核苷酸

<220>

<223>組合dna/rna分子的說明：合成寡核苷酸

<400>25

ttauuccuucuucgggaaguc21

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<213>人工序列

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<223>人工序列的說明：合成寡核苷酸

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aaccttctggaacccgcccac21

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<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的說明：合成寡核苷酸

<400>27

gagcatcttcgagcaagaa19

<210>28

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的說明：合成寡核苷酸

<400>28

catgtggcaccgtttgcct19

<210>29

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的說明：合成寡核苷酸

<400>29

aactaccagaaaggtatacct21

<210>30

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的說明：合成寡核苷酸

<220>

<223>組合dna/rna分子的說明：合成寡核苷酸

<220>

<221>modified_base

<222>(20)..(21)

<223>dt

<400>30

ucacaguguccuuuauguatt21

<210>31

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的說明：合成寡核苷酸

<220>

<223>組合dna/rna分子的說明：合成寡核苷酸

<400>31

gcaugaaccggaggcccautt21

<210>32

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的說明：合成寡核苷酸

<400>32

ccggacagttccatgtata19

<210>33

<211>330

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的說明：合成多肽

<400>33

alaserthrlysglyproservalpheproleualaproserserlys

151015

serthrserglyglythralaalaleuglycysleuvallysasptyr

202530

pheprogluprovalthrvalsertrpasnserglyalaleuthrser

354045

glyvalhisthrpheproalavalleuglnserserglyleutyrser

505560

leuserservalvalthrvalproserserserleuglythrglnthr

65707580

tyrilecysasnvalasnhislysproserasnthrlysvalasplys

859095

argvalgluprolyssercysasplysthrhisthrcysproprocys

100105110

proalaprogluleuleuglyglyproservalpheleuphepropro

115120125

lysprolysaspthrleumetileserargthrprogluvalthrcys

130135140

valvalvalaspvalserhisgluaspprogluvallyspheasntrp

145150155160

tyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproargglu

165170175

gluglntyrasnserthrtyrargvalvalservalleuthrvalleu

180185190

hisglnasptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasn

195200205

lysalaleuproalaproileglulysthrileserlysalalysgly

210215220

glnproarggluproglnvaltyrthrleuproproserarggluglu

225230235240

metthrlysasnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyr

245250255

proseraspilealavalglutrpgluserasnglyglnprogluasn

260265270

asntyrlysthrthrproprovalleuaspseraspglyserphephe

275280285

leutyrserlysleuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasn

290295300

valphesercysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthr

305310315320

glnlysserleuserleuserproglylys

325330

<210>34

<211>330

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的說明：合成多肽

<400>34

alaserthrlysglyproservalpheproleualaproserserlys

151015

serthrserglyglythralaalaleuglycysleuvallysasptyr

202530

pheprogluprovalthrvalsertrpasnserglyalaleuthrser

354045

glyvalhisthrpheproalavalleuglnserserglyleutyrser

505560

leuserservalvalthrvalproserserserleuglythrglnthr

65707580

tyrilecysasnvalasnhislysproserasnthrlysvalasplys

859095

lysalagluprolyssercysasplysthrhisthrcysproprocys

100105110

proalaprogluleuleuglyglyproservalpheleuphepropro

115120125

lysprolysaspthrleumetileserargthrprogluvalthrcys

130135140

valvalvalaspvalserhisgluaspprogluvallyspheasntrp

145150155160

tyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproargglu

165170175

gluglntyrasnserthrtyrargvalvalservalleuthrvalleu

180185190

hisglnasptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasn

195200205

lysalaleuproalaproileglulysthrileserlysalalysgly

210215220

glnproarggluproglnvaltyrthrleuproproserargaspglu

225230235240

leuthrlysasnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyr

245250255

proseraspilealavalglutrpgluserasnglyglnprogluasn

260265270

asntyrlysthrthrproprovalleuaspseraspglyserphephe

275280285

leutyrserlysleuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasn

290295300

valphesercysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthr

305310315320

glnlysserleuserleuserproglylys

325330

<210>35

<211>47

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的說明：合成引物

<400>35

ccgcggtcacatggcaccacctctcttgcagcttccaccaagggccc47

<210>36

<211>33

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的說明：合成引物

<400>36

ccggccgtcgcactcatttacccagagacaggg33

<210>37

<211>448

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的說明：合成多肽

<400>37

glnvalglnleuglnglnserglysergluleulyslysproglyala

151015

servallysvalsercyslysalaserglyphethrphethrasntyr

202530

glymetasntrpvallysglnalaproglyglnglyleulystrpmet

354045

glytrpileasnthrtyrthrarggluprothrtyralaaspaspphe

505560

lysglyargphealapheserleuaspthrservalserthralatyr

65707580

leuglnileserserleulysalaaspaspthralavaltyrphecys

859095

alaargaspilethralavalvalprothrglypheasptyrtrpgly

100105110

glnglyserleuvalthrvalserseralaserthrlysglyproser

115120125

valpheproleualaprocysserargserthrsergluserthrala

130135140

alaleuglycysleuvallysasptyrpheprogluprovalthrval

145150155160

sertrpasnserglyalaleuthrserglyvalhisthrpheproala

165170175

valleuglnserserglyleutyrserleuserservalvalthrval

180185190

proserserserleuglythrlysthrtyrthrcysasnvalasphis

195200205

lysproserasnthrlysvalasplysargvalgluserlystyrgly

210215220

proprocysproprocysproalaproglupheleuglyglyproser

225230235240

valpheleupheproprolysprolysaspthrleumetileserarg

245250255

thrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserglngluasppro

260265270

gluvalglnpheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasnala

275280285

lysthrlysproargglugluglnpheasnserthrtyrargvalval

290295300

servalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglutyr

305310315320

lyscyslysvalserasnlysglyleuproserserileglulysthr

325330335

ileserlysalalysglyglnproarggluproglnvaltyrthrleu

340345350

proproserglngluglumetthrlysasnglnvalserleuthrcys

355360365

leuvallysglyphetyrproseraspilealavalglutrpgluser

370375380

asnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrproprovalleuasp

385390395400

seraspglyserphepheleutyrserargleuthrvalasplysser

405410415

argtrpglngluglyasnvalphesercysservalmethisgluala

420425430

leuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleuserleuglylys

435440445

<210>38

<211>327

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的說明：合成多肽

<400>38

alaserthrlysglyproservalpheproleualaprocysserarg

151015

serthrsergluserthralaalaleuglycysleuvallysasptyr

202530

pheprogluprovalthrvalsertrpasnserglyalaleuthrser

354045

glyvalhisthrpheproalavalleuglnserserglyleutyrser

505560

leuserservalvalthrvalproserserserleuglythrlysthr

65707580

tyrthrcysasnvalasphislysproserasnthrlysvalasplys

859095

argvalgluserlystyrglyproprocysproprocysproalapro

100105110

glupheleuglyglyproservalpheleupheproprolysprolys

115120125

aspthrleumetileserargthrprogluvalthrcysvalvalval

130135140

aspvalserglngluaspprogluvalglnpheasntrptyrvalasp

145150155160

glyvalgluvalhisasnalalysthrlysproargglugluglnphe

165170175

asnserthrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhisglnasp

180185190

trpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlysglyleu

195200205

proserserileglulysthrileserlysalalysglyglnproarg

210215220

gluproglnvaltyrthrleuproproserglngluglumetthrlys

225230235240

asnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyrproserasp

245250255

ilealavalglutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyrlys

260265270

thrthrproprovalleuaspseraspglyserphepheleutyrser

275280285

argleuthrvalasplysserargtrpglngluglyasnvalpheser

290295300

cysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthrglnlysser

305310315320

leuserleuserleuglylys

325

<210>39

<211>214

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的說明：合成多肽

<400>39

aspileglnleuthrglnserproserserleuseralaservalgly

151015

aspargvalthrilethrcysargalasergluasniletyrserasn

202530

leualatrptyrargglnlysproglylysalaprolysleuleuval

354045

phealaalaserasnleualaaspglyvalproserargphesergly

505560

serglyserglythrasptyrthrphethrileserserleuglnpro

65707580

gluaspilealathrtyrtyrcysglnhisphetrpthrthrprotrp

859095

alapheglyglyglythrlysleuglnilelysargthrvalalaala

100105110

proservalpheilepheproproseraspgluglnleulyssergly

115120125

thralaservalvalcysleuleuasnasnphetyrproarggluala

130135140

lysvalglntrplysvalaspasnalaleuglnserglyasnsergln

145150155160

gluservalthrgluglnaspserlysaspserthrtyrserleuser

165170175

serthrleuthrleuserlysalaasptyrglulyshislysvaltyr

180185190

alacysgluvalthrhisglnglyleuserserprovalthrlysser

195200205

pheasnargglyglucys

210

<210>40

<211>106

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的說明：合成多肽

<400>40

thrvalalaalaproservalpheilepheproproseraspglugln

151015

leulysserglythralaservalvalcysleuleuasnasnphetyr

202530

proargglualalysvalglntrplysvalaspasnalaleuglnser

354045

glyasnserglngluservalthrgluglnaspserlysaspserthr

505560

tyrserleuserserthrleuthrleuserlysalaasptyrglulys

65707580

hislysvaltyralacysgluvalthrhisglnglyleuserserpro

859095

valthrlysserpheasnargglyglucys

100105

<210>41

<211>4

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的說明：合成肽

<220>

<223>n-末端dota

<220>

<221>mod_res

<222>(2)..(2)

<223>lys(hsg)

<220>

<221>mod_res

<222>(4)..(4)

<223>lys(hsg)

<220>

<223>c-末端nh2

<400>41

phelystyrlys

1

<210>42

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的說明：合成肽

<400>42

alacysserserserproserlyshiscysgly

1510

<210>43

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的說明：合成肽

<400>43

phecysileglyargleucysgly

15

<210>44

<211>12

<212>prt

<213>人免疫缺陷病毒

<400>44

glyarglyslysargargasnargargargcysgly

1510