血竭素、血竭素衍生物或其可用鹽在制備糖尿病藥物中的應用的制作方法

本發明涉及生物醫藥領域，具體涉及血竭素、血竭素衍生物或其可用鹽在制備糖尿病藥物中的應用。

背景技術：

糖尿病是一種常見、有遺傳傾向、以高血糖為特征的慢性代謝性和全身進行性疾病，具有普遍性、高發病率和高死亡率的特點，現已成為繼癌癥、心腦血管疾病之后，人類第三大殺手。糖尿病防治在相當長的時期內將是人類面臨的嚴峻挑戰。尋找和開發新型、高效、安全治療糖尿病的藥物刻不容緩，是糖尿病治療領域的首要任務。

糖尿病主要分為I型、II型，其中以II型糖尿病為主，占患糖尿病人數的90％以上。胰島β細胞功能缺陷是形成II型糖尿病的主要原因之一，II型糖尿病也被稱為是由于β細胞功能缺陷而導致的單基因或多基因遺傳病。胰島β細胞功能缺陷的原因主要有胰島β細胞塊的減損和胰島β細胞分泌功能的衰減。且研究表明，機體長期處于高糖環境中會誘發多種慢性炎癥，出現胰島β細胞數目減少，胰島素分泌不足。因此，保護胰島β細胞，調控胰島素合成和分泌是治療糖尿病的一種重要手段。

胰十二指腸同源盒1(pancreatic duodenal homeobox-1，Pdx-1)最早又被稱為生長抑素活化因子-1(STF-1)、胰島素啟動因子-1(IPF-1)或胰島素敏感因子(GSF)。其蛋白序列和結構域在不同物種間高度保守，且蛋白結構的氨基末端(N-terminus)是轉錄激活區，為胰島素基因轉錄所必須，無論是在β細胞還是在非β細胞，都能活化胰島素啟動子。同時，Pdx1還能夠調節β細胞的生長和增殖，抑制β細胞發生凋亡。Pdx1對β細胞生長和增殖的調控主要是通過Irs1/Irs2-PI3K-Akt信號通路實現的，其中Akt能直接調節其下游靶基因Pdx1的功能。最初，Pdx1與其它同源基因一起，在動物模型中被證實與凋亡之間有一定聯系，漸漸許多研究也證實Pdx1表達降低與β細胞凋亡或因此而導致的細胞死亡密切相關，尤其當細胞處于高糖環境時，胰島組織中Pdx1表達明顯減少。Pdx1因而作為促進胰腺發育，調控胰島素的合成和分泌、胰島細胞分化的關鍵轉錄因子，在治療糖尿病領域引起極大關注。

通過對Pdx1與II型糖尿病形成關系的研究，發現在II型糖尿病小鼠模型中，高血糖環境下，胰島β細胞內Pdx1的表達降低，直接影響了胰島素基因的表達和胰島素的合成，同時影響了β細胞的增殖，使β細胞數目減少。在人類中發現，Pdx1基因的無義突變與II型糖尿病的形成密切相關，Pdx1基因缺失突變的患者亦表現出嚴重的糖尿病癥狀。諸多證據顯示在患糖尿病的各個階段都會發生β細胞功能缺陷，且起主導作用。而Pdx1的活性缺失則是β細胞功能缺陷的根本原因，這使得有正常功能的β細胞數目減少，導致胰島素分泌不足，進而形成糖尿病。因此，Pdx1在維持β細胞的正常功能和調節糖代謝平衡方面起關鍵作用，是糖尿病治療的一個潛在基因靶標，全面了解其與糖尿病發生的關系，進行必要的體外逆轉實驗，篩選出高效、低毒、低劑量的Pdx1表達激活劑，是一種治療糖尿病的新方法。

血竭，又名騏驎竭、海蠟、麒麟血、木血竭，棕櫚科植物麒麟竭果實和藤莖中的樹脂。具有活血散瘀，定痛，止血生肌的功效，血竭素是其主要成分之一，屬黃酮類化合物中的花青素類。近來研究發現，血竭素高氯酸鹽可以誘導人宮頸癌Hela細胞、胃癌SGC-7901、人乳腺癌MCF-7等癌細胞產生凋亡，同時在防治小鼠糖尿病腎病的腎損傷方面發揮重要作用。目前，尚沒有血竭素其他結構修飾物生物活性研究的相關報道。

總之，以往對于血竭素及其結構修飾物的生物藥理作用研究還很局限。本發明發現了血竭素及其結構修飾物在保護胰島β細胞和治療糖尿病方面的機制，主要是通過經典胰島素信號通路促進Pdx1的表達，抗胰島β細胞凋亡，升高體內胰島素水平，發揮降血糖作用的。

技術實現要素：

本發明的目的之一是設計開發了血竭素或其可用鹽在制備糖尿病藥物中的應用。

本發明的目的之二是設計開發了血竭素衍生物或其可用鹽在制備糖尿病藥物中的應用。

本發明提供的技術方案為：

血竭素在制備糖尿病藥物中的應用。

優選的是，所述糖尿病為Ⅱ型糖尿病。

優選的是，所述血竭素用于激活轉錄因子Pdx1的表達進而保護胰島β細胞。

根據通式(Ⅰ)所示的血竭素藥學上可接受的鹽在制備糖尿病藥物中的應用：

其中，R₁，R₅為H，R₂為OH，R₃為CH₃，R₄為OCH₃，X為ClO₄^—、Cl^—或者C₆H₂N₃O₇^—。

優選的是，所述血竭素衍生物包括：5-甲氧基-6-甲基-2-苯基-7H-色烯-7-酮或者7-羥基-6甲基-2-苯基-鉻烯。

根據通式(Ⅰ)所示的血竭素衍生物藥學上可接受的鹽在制備糖尿病藥物中的應用：

優選的是，所述通式(Ⅰ)中R₁，R₄，R₅為H，R₂為OH或OCH₃，R₃為CH3，X為Cl^—；或者

R₁，R₅為H，R₂為OCH₃，R₃為CH₃，R₄為OH，X為Cl^—。

優選的是，所述通式(Ⅰ)中R₃，R₅為H，R₁為CH₃，R₂為OH或者OCH₃，R₄為OCH₃，X為Cl^—；或者

R₃，R₅為H，R₁為CH₃，R₂為OCH3，R₄為OH，X為ClO₄^—。

優選的是，所述通式(Ⅰ)中R₅為H，R₁，R₃為CH₃，R₂為OH，R₄為OCH₃；

R₃為H，R₁，R₅為CH₃，R₂為OH，R₄為OCH₃；或者

R₁為H，R₂為OCH₃，R₃，R₅為CH₃，R₄為OH；

X為Cl^—。

優選的是，所述糖尿病為Ⅱ型糖尿病。

本發明與現有技術相比較所具有的有益效果：Pdx1作為調控胰島素的合成和分泌、胰島細胞分化及胰腺發育的關鍵轉錄因子，在治療糖尿病領域引起極大關注。本發明首次以Pdx1作為糖尿病藥物作用靶標，建立糖尿病藥物篩選系統，對II型糖尿病治療針對性強，適用性廣。此外，本發明所篩選出來的糖尿病治療藥物血竭素為天然產物，能夠從動植物體內提取出來，具有多種天然產物的優點，如易被機體吸收利用，毒副作用相對較小，不易產生抗藥性等，從而使其成為糖尿病治療的優良候選藥物。而且，本發明還采用糖尿病小鼠模型對血竭素，血竭素鹽及其多種衍生物的糖尿病治療作用進行了探討，發現了血竭素，血竭素鹽及其多種衍生物對糖尿病小鼠顯著的降血糖及促進胰島素分泌的作用。通過以上分析說明，本發明以Pdx1為靶點篩選出的血竭素，血竭素鹽及其系列衍生物，能夠成為糖尿病治療的候選藥物。

附圖說明

圖1為血竭素及其衍生物對Pdx1啟動子活性的影響，數據表示為：^*：與control組相比，P<0.05，^**：與control組相比，P<0.01。

圖2為血竭素及其衍生物對經典胰島素信號通路及Pdx1表達的影響，數據表示：^**：與control組相比，P<0.01。

圖3為血竭素對高糖損傷胰島β細胞的保護作用，數據表示：^**：與33nM glucose單獨處理組相比，P<0.01。

圖4為血竭素對高脂損傷胰島β細胞的保護作用，數據表示：^*：與200μM PA單獨處理組相比，P<0.05，^**：與200μM PA單獨處理組相比，P<0.01。

圖5為血竭素對糖尿病小鼠血糖水平的影響，數據表示：^**：與糖尿病模型組相比，P<0.01。

圖6為血竭素對糖尿病小鼠血清中胰島素水平的影響，數據表示：^*：與糖尿病模型組相比，P<0.05。

圖7為血竭素對糖尿病小鼠胰島Pdx1表達的影響，數據表示：^**：與糖尿病模型組相比，P<0.01。

具體實施方式

下面結合附圖對本發明做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書文字能夠據以實施。

本發明所述保護胰島β細胞及治療糖尿病的藥物為血竭素及其衍生物。其通式如下：

其中，R₁，R₅為H，R₂為OH，R₃為CH₃，R₄為OCH₃(血竭素，TI90)

或R₁，R₅為H，R₂為OH，R₃為CH₃，R₄為OCH₃，X為ClO₄^—(血竭素高氯酸鹽，TI91)

或R₁，R₅為H，R₂為OH，R₃為CH₃，R₄為OCH₃，X為Cl^—(血竭素鹽酸鹽，TI92)

或R₁，R₅為H，R₂為OH，R₃為CH₃，R₄為OCH₃，X為C₆H₂N₃O₇^—(血竭素苦味酸鹽，TI94)

或R₁，R₅為H，R₂為O，R₃為CH₃，R₄為OCH₃(5-甲氧基-6-甲基-2-苯基-7H-色烯-7-酮，TI95)

或R₁，R₄，R₅為H，R₂為OH，R₃為CH₃(7-羥基-6-甲基-2-苯基-鉻烯，TI93)

或R₁，R₄，R₅為H，R₂為OH，R₃為CH₃，X為Cl^—(7-羥基-6-甲基-2-苯基-鉻烯，鹽酸鹽，TI96)

或R₁，R₄，R₅為H，R₂為OCH₃，R₃為CH₃，X為Cl^—(7-甲氧基-6-甲基-2-苯基-鉻烯，鹽酸鹽，TI97)

或R₁，R₅為H，R₂為OCH₃，R₃為CH₃，R₄為OH，X為Cl^—(5-羥基-7-甲氧基-6-甲基-2-苯基-鉻烯，鹽酸鹽，TI98)

或R₃，R₅為H，R₁為CH₃，R₂為OH，R₄為OCH₃，X為Cl^—(7-羥基-5-甲氧基-8-甲基-2苯基-鉻烯，鹽酸鹽，TI99)

或R₃，R₅為H，R₁為CH₃，R₂為OCH₃，R₄為OH，X為Cl^—(5-羥基-7-甲氧基-8-甲基-2-苯基-鉻烯，鹽酸鹽，TI100)

或R₃，R₅為H，R₁為CH₃，R₂為OCH₃，R₄為OH，X為ClO₄^—(5-羥基-7-甲氧基-8-甲基-2-苯基-鉻烯，高氯酸鹽，TI101)

或R₅為H，R₁，R₃為CH₃，R₂為OH，R₄為OCH₃，X為Cl^—(7-羥基-5-甲氧基-6，8-二甲基-2-苯基-鉻烯，鹽酸鹽，TI102)

或R₃為H，R₁，R₅為CH₃，R₂為OH，R₄為OCH₃，X為Cl^—(7-羥基-5-甲氧基-4，8-二甲基-2-苯基-鉻烯，鹽酸鹽，TI103)

或R₁為H，R₂為OCH₃，R₃，R₅為CH₃，R₄為OH，X為Cl^—(5-羥基-7-甲氧基-4，6二甲基-2苯基-鉻烯，鹽酸鹽，TI104)

本發明所述的血竭素及其衍生物包括血竭素、血竭素高氯酸鹽、血竭素鹽酸鹽、血竭素苦味酸鹽、5-甲氧基-6-甲基-2-苯基-7H-色烯-7-酮、7-羥基-6-甲基-2-苯基-鉻烯、7-羥基-6-甲基-2-苯基-鉻烯鹽酸鹽、7-甲氧基-6-甲基-2-苯基-鉻烯鹽酸鹽、5-羥基-7-甲氧基-6-甲基-2-苯基-鉻烯鹽酸鹽、7-羥基-5-甲氧基-8-甲基-2-苯基-鉻烯鹽酸鹽、5-羥基-7-甲氧基-8-甲基-2-苯基-鉻烯鹽酸鹽、5-羥基-7-甲氧基-8甲基-2-苯基-鉻烯高氯酸鹽、7-羥基-5-甲氧基-6，8-二甲基-2-苯基-鉻烯鹽酸鹽、7-羥基-5-甲氧基-4，8-二甲基-2-苯基-鉻烯鹽酸鹽、5-羥基-7-甲氧基-4，6-二甲基-2-苯基-鉻烯鹽酸鹽。

本發明所述血竭素及其衍生物對胰島β細胞的保護作用，降低高糖、高脂對胰島β細胞的毒性作用，抑制高糖、高脂誘導的胰島β細胞凋亡，本發明所述的糖尿病是指II型糖尿病；本發明所述血竭素及其衍生物主要是通過降低糖尿病血糖水平，或升高胰島素水平，或促進胰島β細胞中調控胰島素基因的轉錄因子Pdx1表達，或激活胰島β細胞中AKT和ERK信號通路來發揮其對糖尿病的治療作用。

本發明的血竭素及其衍生物對胰島β細胞的保護作用及對糖尿病的治療作用及相關機制研究是通過以下方法進行的：

1、血竭素及其衍生物的獲得

血竭素及其衍生物可通過商品購買獲得或通過以下方法制備：

血竭素、血竭素高氯酸鹽、血竭素鹽酸鹽的制備方法見專利201610059078.X。

血竭素苦味酸鹽的制備方法見Brockmann H,Junge H,Eckhardt I.Berichte der deutschen chemischen Gesellschaft(A and B Series),1944,77(5):347-353.

5-甲氧基-6-甲基-2-苯基-7H-色烯-7-酮的制備方法見Robertson A,Whalley W B.383.Journal of the Chemical Society(Resumed),1950:1882-1884.

7-羥基-6-甲基-2-苯基-鉻烯制備方法見Jurd L.Tetrahedron,1972,28(3):493-504.

7-羥基-6-甲基-2-苯基-鉻烯鹽酸鹽制備方法見Journal of the chemical Society,1950,P.1876,1880.

7-甲氧基-6-甲基-2-苯基-鉻烯鹽酸鹽制備方法見Journal of the chemical Society,1950,P.1876,1880.

5-羥基-7-甲氧基-6-甲基-2-苯基-鉻烯鹽酸鹽、5-羥基-7-甲氧基-8-甲基-2苯基-鉻烯鹽酸鹽制備方法見Brockmann H,Junge H.Berichte der deutschen chemischen Gesellschaft(A and B Series),1943,76(8):751-763.

7-羥基-5-甲氧基-8-甲基-2-苯基-鉻烯鹽酸鹽制備方法見Brockmann H,Junge H,Eckhardt I.Berichte der deutschen chemischen Gesellschaft(A and B Series),1944,77(5):347-353.

5-羥基-7-甲氧基-8-甲基-2-苯基-鉻烯高氯酸鹽(Brockmann H,Junge H,Eckhardt I.Berichte der deutschen chemischen Gesellschaft(A and B Series),1944,77(5):347-353.

7-羥基-5-甲氧基-6，8-二甲基-2-苯基-鉻烯鹽酸鹽Brockmann H,Junge H,Eckhardt I.Berichte der deutschen chemischen Gesellschaft(A and B Series),1944,77(5):347-353.

7-羥基-5-甲氧基-4，8-二甲基-2-苯基-鉻烯鹽酸鹽Chemische Berichte,1944,vol.77/79,p.44,46,Anm.9.

5-羥基-7-甲氧基-4，6-二甲基-2-苯基-鉻烯鹽酸鹽(Journal of the chemical Society,1950,P.1876,1880.

2、血竭素及其衍生物對Pdx1啟動子活性的影響

首先釣取Pdx1啟動子并克隆入pGL3中，從而構建出pGL3-Pdx1報告質粒。HEK293T細胞以5×10⁴的密度接種于24孔板中。按脂質體轉染方法將Pdx1啟動子報告質粒pGL3-Pdx1或空載pGL3與pCMV-β-gal質粒共轉染HEK293T細胞，在細胞培養箱中培養4～6h后棄去舊的培養基，換成新鮮的10％FBS DMEM培養基。24h后，改用加有10μg/mL化合物的含3％血清的DMEM培養基繼續培養12～24h，之后進行熒光素酶活性檢測；當所述篩選細胞內報告基因表達強度升高，所述待篩選化合物促進人Pdx1的表達；當所述篩選細胞內報告基因表達強度降低，所述待篩選化合物抑制人Pdx1的表達。

如圖1所示，鑒于血竭素，血竭素高氯酸鹽，血竭素鹽酸鹽，7-羥基-6甲基-2-苯基-鉻烯均具能夠較好地促進Pdx1啟動子活性，所以我們認為是它們結構中的共同部分在發揮此作用，而且據此我們可以推斷其它具有這個共同結構的血竭素衍生物，即具有以下通式的化合物也應該具有相同的活性，可以作為一種人Pdx1基因的表達激動劑。

3、血竭素及其衍生物通過經典胰島素信號通路對Pdx1表達的影響

胰島β細胞上存在著胰島素受體和胰島素受體底物，這些蛋白與Pdx1及下游相關蛋白一起，調控著胰島素的合成和分泌，維持著β細胞的生長、增殖和存活，而PI3K/Akt和ERK信號通路在這些生命活動中發揮著重要作用。許多Pdx1的刺激劑，如胰島素和葡萄糖，能夠激活Akt和ERK磷酸化位點，這反過來促進了Pdx1的磷酸化和其在細胞質和細胞核之間的穿梭位移。為了驗證血竭素及其衍生物激活的這兩條信號通路是否與Pdx1的表達有關，本發明首先檢測了應用這兩個通路的抑制劑是否影響Pdx1報告基因的表達，然后檢測這兩個通路的抑制劑是否解除血竭素及其衍生物對Pdx1表達的影響。

釣取Pdx1啟動子并克隆入pGL3中，從而構建出pGL3-Pdx1報告質粒。向INS-1細胞中轉染pGL3-Pdx1報告質粒，然后分別加入各種試劑如血竭素及其衍生物(10μg/mL)，ERK抑制劑U0126(10μM)，Akt抑制劑LY294002(10μM)等。比較加入10μg/mL的血竭素或其衍生物與加入抑制劑U0126或LY294002后，報告基因的活性。

4、血竭素及其衍生物對胰島β細胞的保護作用

(1)胰島β細胞高糖損傷模型的建立

主要采用INS-1細胞體外模擬高糖對β細胞的毒性作用，建立高糖損傷模型，即分別用含有不同濃度葡萄糖的培養基培養INS-1細胞一段時間后，通過MTT法考察不同濃度的葡萄糖對不同培養時間的INS-1細胞的毒性。

(2)胰島β細胞高脂損傷模型的建立

主要采用INS-1細胞體外模擬高脂對β細胞的毒性作用，建立高脂損傷模型，即分別用含有不同濃度棕櫚酸(Palmitic acid，PA)的培養基培養INS-1細胞24h后，通過MTT法考察不同濃度的棕櫚酸對INS-1細胞的毒性。

(3)血竭素及其衍生物對高糖損傷胰島β細胞的保護作用

將不同濃度的血竭素及其衍生物加入到33mM高糖培養基條件下的胰島β細胞高糖損傷模型內，72小時后采用MTT法考察不同濃度的血竭素及其衍生物對高糖損傷INS-1細胞生長的影響以反映血竭素及其衍生物對高糖損傷胰島β細胞的保護作用。

(4)血竭素及其衍生物對高脂損傷胰島β細胞的保護作用

將不同濃度的血竭素及其衍生物加入到200μM棕櫚酸培養條件下的胰島β細胞高脂損傷模型內，24小時后采用MTT法，考察不同濃度的血竭素及其衍生物對高脂損傷INS-1細胞生長的影響以反映血竭素及其衍生物對高脂損傷胰島β細胞的保護作用。

(5)血竭素及其衍生物的抗凋亡作用

為研究血竭素及其衍生物對高糖(高脂)誘導的INS-1細胞凋亡的保護作用，本發明主要采用了DAPI染色實驗，這是被廣泛運用的檢測細胞凋亡的技術。

將INS-1細胞種到96孔板中，培養24h后棄去舊培養基，同時加入新培養基，分四組處理：普通培養基組，普通培養基+10μg/mL血竭素組，33mM高糖培養基組(高脂模型為200μM棕櫚酸組)，33mM高糖培養基+10μg/mL血竭素組(高脂模型為200μM棕櫚酸+10μg/mL血竭素)。繼續孵育72h后，用PBS清洗細胞3遍，然后用4％的多聚甲醛(溶解在PBS中，PH7.4；Sigma)室溫下固定30min。將固定后的細胞用PBS清洗3次后，37℃避光條件下用DAPI染色20min，然后在Olympus BX50熒光顯微鏡(Olympus,Tokyo,Japan)下觀察細胞并拍照。觀察細胞形態并計數凋亡細胞數目，考察血竭素及其衍生物對高糖或高脂誘發的細胞凋亡的影響。

(6)血竭素及其衍生物的抗凋亡作用與pdx1表達的關系

為了確定血竭素及其衍生物的抗凋亡作用過程中是否有Pdx1的參與，本發明主要通過蛋白免疫印跡的方法考察了在高糖、高脂或普通培養條件下培養的INS-1細胞內Pdx1的表達情況。

將INS-1細胞種到96孔板中，培養24h后棄去舊培養基，同時加入新培養基，分四組處理：普通培養基組，普通培養基+10μg/mL血竭素及其衍生物組，33mM高糖培養基組(高脂模型為200μM棕櫚酸組)，33mM高糖培養基+10μg/mL血竭素組(高脂模型為200μM棕櫚酸+10μg/mL血竭素組)。繼續孵育72h后分別收集上述四組細胞，提取蛋白，然后在12％分離膠-5％濃縮膠的膠板中進行蛋白電泳，經轉膜、封閉、洗滌后，最后用化學發光儀進行顯影。分析比較Pdx1的蛋白表達情況以考察血竭素及其衍生物的抗凋亡作用與Pdx1表達的關系。

5、血竭素及其衍生物對糖尿病小鼠血糖的影響

(1)糖尿病小鼠模型的建立

為了驗證血竭素及其衍生物是否具有降血糖作用，本發明使用了雄性C57BL/6J糖尿病模型小鼠，來開展后續實驗。

糖尿病小鼠模型建立方法為：在7周大的雄性C57BL/6J小鼠腹腔內注射100mg/kg的STZ，同時高糖高脂飲食(59％基本飼料，20％蔗糖，18％豬油，3％的蛋黃)。2周后，取小鼠尾靜脈血液，測量空腹6h后小鼠體內血糖含量，連續3天測得的小鼠空腹血糖≥7.0mmol/L，代表本發明中患糖尿病的C57BL/6J小鼠造模成功。

(2)血竭素及其衍生物對糖尿病小鼠的降血糖作用

首先將C57BL/6J小鼠隨機分為以下幾組：正常對照組：血糖水平正常的C57BL/6J小鼠，用普通飼料喂養；糖尿病對照組：造模成功的C57BL/6J糖尿病小鼠，腹腔注射生理鹽水并高糖高脂飲食；實驗組：造模成功的C57BL/6J糖尿病小鼠，腹腔注射不同濃度的血竭素(5mg/kg、10mg/kg和20mg/kg)并高脂飲食。其中實驗組小鼠按加入血竭素及其衍生物的濃度分為3組，和正常對照組及糖尿病對照組一起共分為5組，每組6只小鼠。各組小鼠每隔一天向腹腔注射不同濃度的血竭素及其衍生物或等量的生理鹽水，持續4周，之后檢測小鼠體內血漿血糖水平。

(3)血竭素及其衍生物對糖尿病小鼠血清胰島素水平的影響

實驗小鼠分組同上，然后分別于小鼠眼部取血，5000rpm離心5min，取上清，即為血清。用Mercodia Rat Insulin ELISA試劑盒測血清的胰島素含量，實驗方法參照說明書。通過不同組糖尿病小鼠的血清胰島素水平差異值判斷血竭素及其衍生物對糖尿病小鼠血清胰島素水平的影響。

(4)血竭素及其衍生物對糖尿病小鼠胰島Pdx1表達的影響

為了驗證血竭素及其衍生物對體內高糖環境下β細胞的保護作用是否也是通過能促進Pdx1蛋白表達實現的。本發明采用了蛋白免疫印跡的方法考察了血竭素及其衍生物對糖尿病小鼠胰島Pdx1表達的影響。結果發現：糖尿病對照組小鼠Pdx1蛋白的表達量明顯少于正常對照組，當糖尿病小鼠經10mg/kg的血竭素及其衍生物處理后，Pdx1蛋白的表達得以恢復。表明不僅在體外血竭素及其衍生物能促進Pdx1的表達，在體內同樣能促進糖尿病小鼠胰島中Pdx1蛋白的表達。即血竭素及其衍生物通過促進Pdx1的表達，抑制II型糖尿病小鼠體內β細胞的凋亡，維持一定的β細胞數目，使得β細胞能分泌足夠的胰島素來發揮其降血糖作用。

藥物組合物和治療方法

藥物組合物以及治療人Pdx1基因相關疾病如糖尿病等的方法亦在本發明的范圍之內。所述藥物組合物包括有效量的本發明的血竭素及其衍生物以及可藥用載體。“可藥用載體”包括溶劑、分散劑、包衣、抗細菌和抗真菌劑以及等張劑和吸收延遲劑等。

本發明的藥物組合物可通過傳統方法制成各種適應于不同給藥途徑的藥物劑型。例如，它可制成口服膠囊或片劑。膠囊可包含任何標準的可藥用物質如明膠、纖維素等。片劑可按傳統方法即將藥物組合物與固相載體以及潤滑劑壓縮制得。固相載體包括淀粉和糖斑脫土。本發明的藥物組合物還可制成硬殼片劑或包含捆綁劑如乳糖或甘露醇、常規填充劑以及壓片劑的膠囊。本發明的藥物組合物還可通過非腸道途徑給藥。非腸道途徑給藥劑型包括本發明的藥物組合物的水劑、等張鹽溶液或5％的糖溶液以及與其他本領域公知的可藥用賦形劑形成的制劑。環式糊精或其他本領域技術人員所公知的促溶劑均可作為藥用賦形劑來遞呈本發明的藥物組合物。

概括地講，本發明的血竭素及其衍生物可懸溶于可藥用載體(如生理溶液)中，通過口服或靜脈輸液，或通過皮下、肌下、胸內、腹膜內、直腸內、陰道內、鼻內、胃內、氣道內、肺內注射或輸液等途徑給藥。劑型的選擇受到給藥途徑、制劑類型、患者(病種、病情、體形、體重、體表面積、年齡、性別)、藥物相互影響以及收治醫師的診斷等諸多因素的影響。適用的制劑用量范圍為0.01～100.00mg/kg。用量范圍可隨病人情況與給藥途徑的不同而做相應的調整。其將主要取決于收治醫師的診斷。例如，口服劑量一般要高于靜脈注射劑量。所述劑量可通過本領域公知的經驗優化方法進行調整。將本發明的藥物組合物包裹于適宜的藥物遞呈載體(如聚合微粒體或輸入設備)可提高給藥，特別是口服給藥的效率。

本發明的藥物組合物的活性可通過體外和體內實驗進行評價。簡而言之，本發明的藥物組合物的藥理活性反映在其調節人Pdx1基因表達活性的能力上。在體內實驗中，所述藥物組合物被注射入動物(如小鼠模型)體內以評價其藥理活性。在此基礎上，合適的劑量范圍和給藥途徑遂得以確定。

為了便于理解本發明，特列舉以下實施例。其作用應被理解為是對本發明的闡釋而非對本發明的任何形式的限制。

主要實驗材料和儀器

1、細胞

HepG2細胞、HEK293T細胞和INS-1細胞購自中科院上海細胞庫；pGL3載體購自BioVector質粒載體菌種細胞基因保藏中心-NTCC典型培養物保藏中心。

2、試劑、酶與藥品

蛋白酶K(20mg/mL)購自Sigma公司；λ-HindIII DNA Marker和DL2000DNA Marker購自TaKaRa公司；HIFI Taq DNA polymerase、10×Taq Buffer和dNTPs購自北京全式金公司；限制性內切酶XhoI、HindIII和T4DNA連接酶購自TaKaRa公司；Promega TA克隆試劑盒購自美國promega公司；LB培養液購自上海杰美基因醫藥科技有限公司；Amp抗生素(氨芐青霉素)購自百靈威科技有限公司；MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，噻唑藍)購自Sigma-Aldrich公司；ERK抑制劑U0126購自上海翊圣生物科技有限公司；Akt抑制劑LY294002購自購自上海翊圣生物科技有限公司；棕櫚酸(PA)購自國家標準物質信息中心；DAPI購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；STZ(鏈脲菌素)購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；Mercodia Rat Insulin ELISA試劑盒購自瑞典Mercodia公司。

其他生化試劑包括甲醇、乙醇、冰醋酸、氯仿、異丙醇及多聚甲醛、二甲基亞砜、氯化鈉、氯化鉀、氫氧化鈉等均購自北京化工廠，均為國產分析純；水為雙蒸水。

實施例

1、血竭素及其衍生物對Pdx1啟動子活性的影響

首先釣取Pdx1啟動子并克隆入pGL3中，從而構建出pGL3-Pdx1報告質粒。HEK293T細胞以5×10⁴的密度接種于24孔板中。按脂質體轉染方法將Pdx1啟動子報告質粒pGL3-Pdx1或空載pGL3與pCMV-β-gal質粒共轉染HEK293T細胞，在細胞培養箱中培養4～6h后棄去舊的培養基，換成新鮮的10％FBS DMEM培養基。24h后，改用加有10μg/mL化合物的含3％血清的DMEM培養基繼續培養12～24h，之后進行熒光素酶活性檢測。實驗組與對照組的熒光值比值的相對倍數值，即為所有化合物對Pdx1啟動子活性促進或抑制的效果。熒光素酶(firefly luciferase)的活性與β半乳糖苷酶(β-gal)的活性之比，剔除了樣本轉染效率的差異，可比較客觀地反映樣本間啟動子活性的差異。不同樣品的熒光素酶相對活性為每一樣品熒光素酶活性與每一樣品β半乳糖苷酶活性的比值。結果如圖1所示，本發明所提及的血竭素及其衍生物均可不同程度地促進Pdx1啟動子的活性；如表1所示，血竭素及其衍生物對Pdx1啟動子活性的影響。

表1血竭素及其結構類似物對Pdx1啟動子活性的影響

在本實施例中，Pdx1啟動子區的釣取包括如下步驟：

步驟一、引物設計

從NCBI Genbank中找出Pdx1的基因組序列，選取轉錄起始位點上游約2000bp的基因調控序列。用Primer5.0軟件設計引物，并利用BLAST軟件進行比對。Pdx1啟動子的引物序列如下：上游端引物為：5'-ATTACTCGAGCGTCGCCAAGTCAACCCTCGG-3'(SEQ ID NO.2)；下游端引物為：5'-TTAAGCTTGGGGATTTGGCACTGTGTGGCGTTC-3'(SEQ ID NO.3)。

步驟二、細胞全基因組提取

將6孔板中一孔密度約為90％的HEK293T細胞收集，并用PBS洗滌后，轉入1.5mL離心管中，4℃和4000rpm，離心5min；棄上清，在離心管中加入700μL DNA裂解液，混勻后，加入3.5μl蛋白酶K(20mg/mL)，使終濃度達到100μg/mL，50℃恒溫水浴2h；加入700μL等體積的飽和酚至樣品裂解液中，溫和、充分混勻3min，12000rpm離心5min；取上層水相至另一1.5mL離心管中，加等體積酚/氯仿/異戊醇(25/24/1)，顛倒混勻，12000rpm離心5min；將上層水相轉移至新的離心管中，加等體積氯仿/異戊醇(24/1)，顛倒混勻，12000rpm離心5min(如水相仍不清澈，可重復此步驟)；取上層水相至新的離心管，加入1/10體積的3M醋酸鈉、2.5倍體積無水乙醇，輕輕顛倒混勻；室溫靜置10min左右，待絮狀物出現后，12000rpm離心10min；棄上清，用1mL 75％乙醇洗滌沉淀，12000rpm離心5min；棄上清，室溫下揮發乙醇，待沉淀近透明后加入適量體積的無菌水，室溫溶解30min，-20℃保存備用。

步驟三、PCR擴增Pdx1啟動子

以上述細胞基因組DNA為模板，利用SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物序列通過PCR擴增得到SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的DNA片段，即為人Pdx1基因啟動；PCR反應條件為：95℃，5min；95℃，45sec；55℃，45sec；72℃，3min，30個循環；72℃，8min。

步驟四、PCR產物的電泳及回收

上述PCR產物用1％瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳后將切下的目的膠塊放入提前準備好的雙層離心管中(內部離心管底部扎孔)一起離心，8000rpm離心5min，棄去上面的離心管，在下面的離心管中加入等體積的平衡酚，充分混勻。-20℃冷凍30min，室溫溶解。12000rpm，離心5min，將上層水相轉移到新離心管中。加入等量的平衡酚/氯仿(1:1)，混勻，12000rpm離心5min。取上清至新離心管，加入1/10體積的3M醋酸鈉，2.5倍體積的無水乙醇或等體積的異丙醇，混勻，-20℃放置1h。12000rpm，離心10min，棄上清，75％乙醇洗滌沉淀。至沉淀完全晾干后，加10μl無菌水溶解沉淀，-20℃保存備用。

步驟五、PCR產物的TA克隆

將上述回收產物與TA克隆載體連接，方法按Promega TA克隆試劑盒說明進行，4℃過夜后，將10μL連接產物放入裝有100μLDH5α感受態菌液的EP管中用200μL移液器輕輕吹打幾次混勻，冰浴30min；42℃熱激90s后，立即轉移至冰中，冰浴3min；在超凈臺中加入無抗生素LB培養液800μL，37℃振蕩培養30min；5000rpm，離心1min，棄上清，留大約50μL上清重新懸浮菌體沉淀，涂布于含有氨芐抗生素的LB培養皿上，先于37℃正置培養1h,然后倒置培養12～16h。

步驟六、重組質粒的篩選

在細菌超凈臺中向無菌的15mL菌管中加入4mL含有Amp抗生素的液體培養基，挑取單克隆于菌管中，37℃，180rpm振蕩培養10h。堿裂解法提取質粒，用XhoI和HindIII酶切鑒定，將酶切鑒定陽性的質粒進行測序。

步驟七、Pdx1-pGL3重組質粒的構建

將上述TA克隆細菌進行大量擴增后提取質粒，用XhoI和HindIII酶切，回收2Kb片段；同時將pGL3用XhoI和HindIII酶切，回收酶切后的質粒，將回收后的片段和pGL3質粒用TAKARA的連接酶I進行連接，連接方法按TAKARA Ligation Kit說明書進行，16℃連接4小時后，將連接產物按上述連接產物轉化并擴大培養后，將細菌涂至具有氨芐青霉素的LB培養基上，37℃孵箱培養過夜。挑單個菌落接種到2ml的LB培養基中，37℃振蕩培養過夜，次日提取質粒，用XhoⅠ和HindⅢ酶切鑒定，將酶切鑒定陽性的質粒進行測序。

2、血竭素及其衍生物通過經典胰島素信號通路對Pdx1表達的影響

釣取Pdx1啟動子并克隆入pGL3中，從而構建出pGL3-Pdx1報告質粒。向INS-1細胞中轉染pGL3-Pdx1報告質粒，然后分別加入各種試劑如血竭素及其衍生物(10μg/mL)，ERK抑制劑U0126(10μM)，Akt抑制劑LY294002(10μM)等。結果如圖2所示，當加入10μg/mL的血竭素或其衍生物后，報告基因活性升高。當加入抑制劑U0126或LY294002后，報告基因活性明顯降低，說明血竭素及其衍生物通過激活ERK與Akt兩條信號通路參與Pdx1的表達調控。

3、血竭素及其衍生物對胰島β細胞的保護作用

(1)胰島β細胞高糖損傷模型的建立

INS-1細胞分別用含11.1mM葡萄糖的普通培養基、含25mM葡萄糖的高糖培養基和含33mM葡萄糖的高糖培養基培養24h、48h、72h及96h。然后于上述四個檢測時間點前4h每孔加入20μL的MTT，在細胞培養箱中繼續培養。之后棄去細胞培養基，每孔加入150μLDMSO，震蕩混勻15min，用酶標儀檢測波長為570nm處的吸光值，即代表該時間點的細胞活力。最終發現無論是25mM還是33mM葡萄糖都能在72h和96h使INS-1細胞大量死亡。INS-1細胞的高糖損傷模型建立成功。

(2)胰島β細胞高脂損傷模型的建立

INS-1細胞培養基中分別加入不同濃度的棕櫚酸(終濃度為150μM，180μM，200μM，220μM，240μM，260μM)培養20h后，每孔加入20μL的MTT，在細胞培養箱中繼續培養。4h后棄去細胞培養基，每孔加入100μL DMSO，震蕩混勻15min，用酶標儀檢測波長為570nm處的吸光值，即代表該時間點的細胞活力。最終發現200-260μM棕櫚酸均能在24h使INS-1細胞大量死亡。INS-1細胞的高脂損傷模型建立成功。

(3)血竭素及其衍生物對高糖損傷胰島β細胞的保護作用

將不同濃度的血竭素及其衍生物加入到33mM高糖培養基條件下的胰島β細胞高糖損傷模型內，72小時后采用MTT法考察不同濃度的血竭素及其衍生物對高糖損傷INS-1細胞生長的影響。結果如圖3所示，血竭素的濃度在5-20μg/mL能顯著減輕細胞的糖毒性，對高糖損傷胰島β細胞具有保護作用；如表2～16所示，血竭素及其衍生物的濃度5-20μg/mL能顯著減輕細胞的糖毒性，對高糖損傷胰島β細胞具有保護作用。

表2 TI90對高糖損傷胰島β細胞的保護作用

表3 TI91對高糖損傷胰島β細胞的保護作用

表4 TI92對高糖損傷胰島β細胞的保護作用

表5 TI93對高糖損傷胰島β細胞的保護作用

表6 TI94對高糖損傷胰島β細胞的保護作用

表7 TI95對高糖損傷胰島β細胞的保護作用

表8 TI96對高糖損傷胰島β細胞的保護作用

表9 TI97對高糖損傷胰島β細胞的保護作用

表10 TI98對高糖損傷胰島β細胞的保護作用

表11 TI99對高糖損傷胰島β細胞的保護作用

表12 TI100對高糖損傷胰島β細胞的保護作用

表13 TI101對高糖損傷胰島β細胞的保護作用

表14 TI102對高糖損傷胰島β細胞的保護作用

表15 TI103對高糖損傷胰島β細胞的保護作用

表16 TI104對高糖損傷胰島β細胞的保護作用

(4)血竭素及其衍生物對高脂損傷胰島β細胞的保護作用

將不同濃度的血竭素及其衍生物加入到200μM棕櫚酸培養條件下的胰島β細胞高脂損傷模型內，24小時后采用MTT法，考察不同濃度的血竭素及其衍生物對高脂損傷INS-1細胞生長的影響。結果如圖4所示，血竭素濃度在10-20μg/mL能顯著減輕細胞的高脂毒性，對高脂損傷胰島β細胞具有保護作用；如表17～31所示，血竭素及其衍生物的濃度10-20μg/mL能顯著減輕細胞的高脂毒性，對高脂損傷胰島β細胞具有保護作用。

表17 TI90對高脂損傷胰島β細胞的保護作用

表18 TI91對高脂損傷胰島β細胞的保護作用

表19 TI92對高脂損傷胰島β細胞的保護作用

表20 TI93對高脂損傷胰島β細胞的保護作用

表21 TI94對高脂損傷胰島β細胞的保護作用

表22 TI95對高脂損傷胰島β細胞的保護作用

表23 TI96對高脂損傷胰島β細胞的保護作用

表24 TI97對高脂損傷胰島β細胞的保護作用

表25 TI98對高脂損傷胰島β細胞的保護作用

表26 TI99對高脂損傷胰島β細胞的保護作用

表27 TI100對高脂損傷胰島β細胞的保護作用

表28 TI101對高脂損傷胰島β細胞的保護作用

表29 TI102對高脂損傷胰島β細胞的保護作用

表30 TI103對高脂損傷胰島β細胞的保護作用

表31 TI104對高脂損傷胰島β細胞的保護作用

(5)血竭素及其衍生物的抗凋亡作用

將INS-1細胞接種到96孔板后中，24h后棄去舊培養基，同時加入新培養基，分四組處理：普通培養基組，普通培養基+10μg/mL血竭素組，33mM高糖培養基組(高脂模型則為200μM棕櫚酸組)，33mM高糖培養基+10μg/mL血竭素組(高脂模型則為200μM棕櫚酸+10μg/mL血竭素組)。繼續孵育72h后，用PBS清洗細胞3遍，然后用4％的多聚甲醛(溶解在PBS中，PH7.4；Sigma)室溫下固定30min。將固定后的細胞用PBS清洗3次后，37℃避光條件下用DAPI染色20min，然后在Olympus BX50熒光顯微鏡(Olympus,Tokyo,Japan)下觀察細胞并拍照。結果表明在普通培養基培養條件下，INS-1細胞的細胞核呈圓形，核質較均勻，而高糖或高脂環境中培養的INS-1細胞的細胞核濃縮并破碎，可見凋亡小體，說明高糖或高脂培養條件確實能誘導INS-1細胞發生凋亡，而血竭素及其衍生物則在一定程度上抑制了高糖或高脂誘發的細胞凋亡，具有抗凋亡作用。

(6)血竭素及其衍生物的抗凋亡作用及與pdx1表達的關系

將INS-1細胞種到96孔板后中，24h后棄去舊培養基，同時加入新培養基，分四組處理：普通培養基組，普通培養基+10ug/mL血竭素組，33mM高糖培養基組(高脂模型為200μM棕櫚酸組)，33mM高糖培養基+10μg/mL組(高脂模型為200μM棕櫚酸+10μg/mL血竭素組)。繼續孵育72h后分別收集上述四組細胞，提取蛋白，然后在12％分離膠-5％濃縮膠的膠板中進行蛋白電泳，經轉膜、封閉、洗滌后，最后用化學發光儀進行顯影。分析結果發現：INS-1細胞暴露于高糖或高脂環境時Pdx1的表達急劇下降，而加入了10μg/mL的血竭素及其衍生物后Pdx1的表達又恢復到正常水平。由于前期實驗已經證明高糖或高脂條件能誘導INS-1細胞發生凋亡，而血竭素及其衍生物則在一定程度上抑制高糖或高脂誘發的細胞凋亡。且文獻報道Pdx1表達降低與β細胞凋亡或因此而導致的細胞死亡密切相關。因此血竭素及其衍生物對高糖或高脂條件下INS-1細胞的抗凋亡作用與Pdx1的表達密切相關。

4、血竭素及其衍生物對糖尿病小鼠血糖的影響

(1)糖尿病小鼠模型的建立

在7周大的雄性C57BL/6J小鼠腹腔內注射100mg/kg的STZ，同時高脂飲食(59％基本飼料，20％蔗糖，18％豬油，3％的蛋黃)。2周后，取小鼠尾靜脈血液，測量空腹6h后小鼠體內血糖含量，連續3天測得的小鼠空腹血糖≥7.0mmol/L，代表本發明中患糖尿病的C57BL/6J小鼠造模成功。

(2)血竭素及其衍生物對糖尿病小鼠的降血糖作用

首先將C57BL/6J小鼠隨機分為以下幾組：正常對照組：血糖水平正常的C57BL/6J小鼠，用普通飼料喂養；糖尿病對照組：造模成功的C57BL/6J糖尿病小鼠，腹腔注射生理鹽水并高脂飲食；實驗組：造模成功的C57BL/6J糖尿病小鼠，腹腔注射低、中、高不同濃度的血竭素(5mg/kg、10mg/kg和20mg/kg)并高脂飲食。其中實驗組小鼠按加入血竭素及其衍生物的濃度分為3組，和正常對照組及糖尿病對照組一起共分為5組，每組6只小鼠。各組小鼠每隔一天向腹腔注射不同濃度的血竭素及其衍生物或等量的生理鹽水，持續4周，之后檢測小鼠體內血漿血糖水平。結果如圖5所示，注射10mg/kg血竭素能顯著降低CB57BL/6J糖尿病小鼠體內的血漿血糖水平；如表32～35所示，注射5～20mg/kg血竭素及其衍生物對CB57BL/6J糖尿病小鼠體內的血漿血糖水平影響結果。

表32 TI90對糖尿病小鼠血糖水平的影響

表33 TI91對糖尿病小鼠血糖水平的影響

表34 TI92對糖尿病小鼠血糖水平的影響

表35 TI93對糖尿病小鼠血糖水平的影響

(3)血竭素及其衍生物對糖尿病小鼠血清胰島素水平的影響

實驗小鼠分組同上，然后分別于小鼠眼部取血，5000rpm離心5min，取上清，即為血清。用Mercodia Rat Insulin ELISA試劑盒測血清的胰島素含量，實驗方法參照說明書。結果表明：與正常對照組小鼠相比，糖尿病小鼠的血清胰島素水平顯著下降，但10mg/kg血竭素及其衍生物處理后，糖尿病小鼠的血清胰島素水平又能恢復到正常水平。結果如圖6所，10mg/kg的血竭素可以顯著升高糖尿病小鼠體內胰島素水平；如表36～40所示，10mg/kg的血竭素及其衍生物可以顯著升高糖尿病小鼠體內胰島素水平。

表36 TI90對糖尿病小鼠血清胰島素水平的影響

表37 TI91對糖尿病小鼠血清胰島素水平的影響

表38 TI92對糖尿病小鼠血清胰島素水平的影響

表39 TI93對糖尿病小鼠血清胰島素水平的影響

(4)血竭素及其衍生物對糖尿病小鼠胰島Pdx1表達的影響

收集不同組小鼠的胰島組織，稱重后，加入組織蛋白提取液，冰上裂解15分鐘后，5000rpm，離心5min，吸取上清于新的EP管中，加入4×蛋白上樣緩沖液30μL；沸水煮10min，室溫冷卻，-80℃保存備用。電泳時取出一管加入4×蛋白上樣緩沖液，煮沸10分鐘，冰上致冷，瞬時離心，上樣電泳。電泳完后關閉電源，將膠體從電泳槽中取出，根據目的蛋白大小切膠，浸入轉膜緩沖液中；依照膠塊的大小剪PVDF膜，將此膜放入甲醇中激活，之后轉移至轉膜緩沖液中；冰浴條件下將蛋白從SDS-PAGE凝膠上轉至PVDF膜上，恒壓100V轉移2h；用1×TBST洗滌標記目的蛋白的PVDF膜2-3次，之后將膜浸入5％脫脂奶粉(用1×TBST配制)封閉液中，室溫封閉1-2h；TBST洗滌PVDF膜3次，每次5-10min；取出PVDF膜，浸入用1×TBST稀釋過的一抗中，4℃標記過夜或室溫標記4h；1×TBST洗滌PVDF膜3次，每次5-10min，室溫標記二抗30min；1×TBST洗滌膜5次，每次5min；將PVDF膜用Micro Chemi化學發光儀進行顯影。

比較糖尿病對照組與正常對照組小鼠Pdx1蛋白表達量的差異，以及當糖尿病小鼠經血竭素及其衍生物處理后，Pdx1蛋白表達是否得以恢復，以判斷血竭素及其衍生物在體內是否同樣能促進糖尿病小鼠胰島中Pdx1蛋白的表達，如圖7所示，糖尿病對照組小鼠Pdx1蛋白的表達量明顯少于正常對照組，當糖尿病小鼠經10mg/kg的TI90處理后，Pdx1蛋白的表達得以恢復，如表40～43所示，血竭素及其衍生物對糖尿病小鼠胰島Pdx1表達的影響，Western Blot結果用Image J軟件進行量化分析，說明血竭素及其衍生物能夠顯著促進糖尿病小鼠胰島Pdx1的表達。

表40 TI90對糖尿病小鼠胰島Pdx1表達的影響

表41 TI91對糖尿病小鼠胰島Pdx1表達的影響

表42 TI92對糖尿病小鼠胰島Pdx1表達的影響

表43 TI93對糖尿病小鼠胰島Pdx1表達的影響

盡管本發明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列運用，它完全可以被適用于各種適合本發明的領域，對于熟悉本領域的人員而言，可容易地實現另外的修改，因此在不背離權利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發明并不限于特定的細節和這里示出與描述的圖例。

SEQUENCE LISTING

<110> 東北師范大學

<120> 血竭素、血竭素衍生物或其可用鹽在制備糖尿病藥物中的應用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1972

<212> DNA

<213> 人（Homo sapiens）HEK293T細胞

<400> 1

cgtcgccaag tcaaccctcg gcgactcggc agattatctc caagggtcaa cacgccgcgg 60

ccaggcaacc ccctccagcc tgccctcctg atcgatgtgg tcactcgcgg ccagggtgat 120

agggtagagt tctccgcggc cgcagacaat ggactcattg acgcgggcgc acagagatta 180

ggtgcccggg ccccacggcc tttcactctc tgcccccacc aaaactgcag gtggcacttt 240

tccctgaaga aatcaccgaa actctccccg cccgccgccg tgcttccctt ggcctgtctt 300

cggtgacagc aagggcatct acaagccagg gagccacaca tcagagccac acacatgagg 360

ccacaggcca ggaagccaca cacatgagtt ctcacacatc gaagcaaatg ctgagactat 420

accggcctcc cgcaagagaa ggaatctgca gagaagtcca cattcccgac tggctttttt 480

gtcttttaat aaaaataaag agtcctcaga atagagcact caatccgcac ttaaaacaca 540

aatatttcca gtaggaagaa agaaatacat taagattgac tctcaaaggt ctggatgttg 600

gtgcgttgtt taggaaaggc ggagcagtga tttttctctg gcttggttct ttgtggttca 660

agctctctct tgctgagacg tttctgcaaa gctgtctagt ttttctaaaa cccacggtgg 720

cgtttcgaga aacgtcctca tttcgggagt atccagtcag aggctggtca ggccgccagg 780

cctagcggat catgcccagg cagggggttg gacgtcaccg ccacccggag gtcatccatc 840

cgcgtcagtg ggtgcagaaa aagtggccct gtttaagtca ggaccccaga atgcccagaa 900

gttactgaat ggtttgaagc caagcacaga tgttatcatg gaaaatgcag cgtttttatt 960

tctttttcta aatatgtaac tcttcctcca cttccccctc tcctgcttgc cttatttcaa 1020

ttgcaagcag aagagagtga gtgttctctg ccggcaaact ccgccagggt cccggcccgt 1080

agagagtcgt caagggtctg gaacccccgt gccaacacct gcccctgctt cgcagcccca 1140

agaggaaggc cgcgtctttc cccctcgctg tattgggaag ctacgttccg ggctggccaa 1200

atgggcccca attttccaaa acccaaattt gtaataccct tcaatttttt aaaaaaaaga 1260

atttaaaaaa gtctctgtga atgcttcaga agttaccgtt tacaccccag aagtacttgc 1320

agcacatcca caagtaaaaa cacacaacga atgccagagt ttcgtgtgtt ttttaaccga 1380

catctttgtg gctgtgaaca aacttcataa ataaaataga atcaaatgct tctgacctag 1440

agagctgggt ctgcaaactt tttttttatc gtattccgca acagttaaat aaaaaattaa 1500

aaactcaaca tgtctccttg taaactacat caattaacaa acacactatg tccattatca 1560

aatataatag aaaaaatata ggaaaataga aaatagaaaa atataggaaa atagaaactt 1620

ttaagccacg gtgaaaatgt ttctataaat gagtggttct aatgttttcg tgagcgccca 1680

ttttggggag caccgccagc tgcccgttca ggagtgtgca gcaaactcag ctgagagaga 1740

aaattggaac aaaagcaggt gctcgcgggt acctgggcct agcctcttag tgcggccagc 1800

caggccaatc acggcccccg gctgaaccac gtggggcccc gcggagccta tggtgcggcg 1860

gccggcccgc cggtccgcgc tggctgtggg ttccctctga gatcagtgcg gagctgtcaa 1920

agcgagcagg ggtggcgccg ggagtgggaa cgccacacag tgccaaatcc cc 1972

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成，以用作得到人Pdx1啟動子的編碼序列的上游引物

<400> 2

attactcgag cgtcgccaag tcaaccctcg g 31

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成，以用作得到人Pdx1啟動子的編碼序列的下游引物

<400> 3

ttaagcttgg ggatttggca ctgtgtggcg ttc 33