靶向下調(diào)TRPM7基因表達在提高肺鱗癌化療敏感性方面的應用的制作方法

本發(fā)明屬于醫(yī)藥領域，涉及肺癌化療敏感性相關基因的發(fā)現(xiàn)，具體涉及靶向下調(diào)TRPM7基因表達在提高肺鱗癌化療敏感性方面的應用。

背景技術：

肺癌是全球最常見的惡性腫瘤，死亡率居惡性腫瘤之首。我國肺癌發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢，年平均增長近2％。肺癌根據(jù)病理學特點的不同分為多種組織類型，肺癌組織類型不同，其治療措施也不同。根據(jù)2004版WHO分類，常見肺癌組織病理學分型分為非小細胞癌(NSCLC)和小細胞癌(SCLC)。非小細胞癌又分為鱗狀細胞癌(SCC)、腺癌(AC)和大細胞癌(LCC)。不同肺癌臨床治療方案不同，預后效果也不同。因此，為了提高治療效果，肺癌的治療策略已經(jīng)從傳統(tǒng)的以分期為基礎的治療模式轉(zhuǎn)變?yōu)橐越M織學類型和基因突變?yōu)橹笇У膫€體化、精準的多學科治療模式。個體化治療提高了肺癌的治療和預后效果。

腺癌(AC)作為最常見的肺癌組織學類型，在全球及我國發(fā)病率均呈上升趨勢。流行病學研究結(jié)果顯示，非小細胞肺癌的發(fā)病有明顯的性別差異，尤其是腺癌。腺癌占原發(fā)肺癌的50％，是非吸煙患者的主要組織學類型。鱗狀細胞癌(SCC)又稱肺鱗癌，占原發(fā)肺癌的30％，是非吸煙患者的另一種主要組織學類型。小細胞肺癌是肺癌常見的類型之一，約占肺癌總數(shù)的14％，與吸煙明顯相關。作為一種高侵襲性腫瘤，SCLC疾病進展快，易早期發(fā)生轉(zhuǎn)移，由于易復發(fā)和產(chǎn)生耐藥，中位總生存期僅8個月-11個月，5年生存率不足5％。

臨床上，不同組織學類型肺癌的給藥和治療方案也不同。但是，順鉑為基礎的化療方案仍為肺腺癌、肺鱗癌及小細胞肺癌的一線治療方案，順鉑為基礎的化療方案比非順鉑為基礎的化療方案具有更好的生存期。

但是，順鉑抵抗出現(xiàn)以及順鉑的毒副反應嚴重降低了患者的生存質(zhì)量，一定程度上限制著順鉑的臨床應用。針對此種情況，眾多醫(yī)藥工作者試圖逆轉(zhuǎn)不同肺癌細胞對順鉑抵抗的出現(xiàn)，以及通過提高肺癌對順鉑的化療敏感性降低順鉑的臨床劑量從而降低對患者的毒副作用。

STAT3(信號傳導蛋白和轉(zhuǎn)錄激活物)可通過介導炎癥介質(zhì)的細胞外信號調(diào)控腫瘤細胞、免疫細胞等的生物學行為，是慢性炎癥促進腫瘤發(fā)生及腫瘤相關性炎癥形成過程中不可或缺的關鍵性分子。一般情況下，細胞因子、生長因子等可結(jié)合至細胞表面的相應受體，從而啟動細胞內(nèi)酪氨酸激酶磷酸化級聯(lián)反應。在JAK2、MAPK或mTOR等激酶的作用下，胞漿中的STAT3可因自身Y705及S727位點磷酸化而發(fā)生二聚化、活化，此外STAT3亦可通過可逆性乙?；罨?。活化的STAT3可轉(zhuǎn)位至細胞核內(nèi)并結(jié)合于基因組DNA，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。STAT3的這一信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活作用維持和調(diào)控著正常機體的一系列生物學行為，包括胚胎發(fā)育、程序性細胞死亡、器官發(fā)生、先天性免疫、適應性免疫、細胞生長等，而STAT3的異?；罨蓪е露喾N疾病的發(fā)生。臨床研究發(fā)現(xiàn)，肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、前列腺癌等腫瘤中的STAT3活性均發(fā)生高頻率的異常活化，且其活化程度與腫瘤患者的預后呈顯著反相關，與腫瘤關系密切。

TRPM7是TRPM(瞬時受體電位)亞族的一員是具有離子通道和激酶活性雙功能的膜蛋白它對陽離子有通透性，使細胞去極化，可使自身和底物磷酸化。TRPM7可以介導感覺信號的傳遞，調(diào)節(jié)細胞鈣鎂平衡和影響發(fā)育，其表達及活性異常與多種疾病特別是腫瘤的發(fā)生具有相關性。TRPM7通道激酶在細胞的增殖、存活、分化、生長和遷移等一系列細胞活動中起重要作用。TRPM7在卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、鼻咽癌等患者中異常高表達，并且與腫瘤的轉(zhuǎn)移、臨床分期等相關，是腫瘤預后的獨立預測因子。

LIN28是一種高度保守的RNA結(jié)合蛋白，在let-7的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)過程中起重要的負性調(diào)控作用，可以抑制let-7的加工合成。LIN28促進胚胎干細胞的快速增長，參與干細胞的增殖，在腫瘤干細胞的形成中發(fā)揮重要作用。LIN28在多種腫瘤組織或腫瘤細胞系中高表達，可以促進腫瘤細胞的增殖和腫瘤的進展，與患者預后不良有關。另外LIN28能夠促進組織修復。有研究顯示LIN28屬于一種致癌基因，它在腫瘤細胞中過表達，促進腫瘤細胞的增殖和腫瘤的進展。LIN28在多種腫瘤組織或細胞系中高表達，而且多出現(xiàn)在低分化以及預后差的腫瘤中。同時LIN28的表達與惡性腫瘤患者的生存密切相關，它的高表達可能預示患者預后不良。另外，作為一種參與誘導多能干細胞的多能因子，LIN28可能成為腫瘤的潛在治療靶點。

RNA干擾是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA誘發(fā)的靶mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象，是研究基因功能的重要技術手段。RNA干擾中常用的病毒載體有逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體、慢病毒載體等。與其他載體相比，慢病毒載體具有以下優(yōu)點：(1)既可以感染分裂期細胞又能感染非分裂期細胞。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體不能感染非分裂期細胞，而慢病毒載體已被證實能有效感染大腦，眼睛，肝臟，造血系統(tǒng)等器官的非分裂期細胞。腺病毒和腺相關病毒載體雖然具有感染非分裂期細胞的能力，但容易引起炎癥和毒性反應。另外，慢病毒基因組可以與宿主基因組整合，因此更適合長期誘導轉(zhuǎn)移基因的表達。(2)病毒突變和產(chǎn)生有復制能力的病毒機率小。(3)可以兼容多個轉(zhuǎn)錄啟動子，轉(zhuǎn)錄多個目的序列片段。(4)能夠容納相對大的轉(zhuǎn)移基因序列。慢病毒經(jīng)過改建后可以容納10Kb左右的外源基因片段，因此應用范圍更加廣泛。

申請人在研究過程中發(fā)現(xiàn)，上述三個基因的表達與不同類型肺癌對順鉑的化療敏感性存在相關性，然后以該基因為靶標篩選得到了可以增強順鉑化療敏感性的化合物，化療時配合該化合物可以降低化療所需的順鉑劑量，降低順鉑對機體帶來的不良反應。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提高順鉑對肺腺癌、肺鱗癌和小細胞肺癌的化療敏感性，從而可以降低順鉑的給藥劑量，降低順鉑對機體帶來的不良反應。

上述目的是通過如下技術方案實現(xiàn)的：

肺腺癌化療敏感性技術方案：

基因STAT3作為靶標在制備促進肺腺癌對化療藥物敏感性的藥物中的應用。

具體實施例中，所述化療藥物為順鉑。

抑制基因STAT3表達的抑制劑在制備促進肺腺癌對化療藥物敏感性的藥物中的應用。

其中，所述抑制劑可以為干擾基因STAT3表達的RNA片段，如靶向干擾基因STAT3表達的siRNA或shRNA，或為下調(diào)基因STAT3表達的小分子化合物。

進一步地，所述小分子化合物具有如下結(jié)構(gòu)的通式：

R3選自-H,-OCH₃,-OH,-CH₃。

優(yōu)選地，所述小分子化合物為(Z)-3-苯基-2-(4-甲基苯甲?；?丙烯酸。

優(yōu)選地，小分子化合物為(Z)-3-(4-甲氧基苯基)-2-(4-甲基苯甲?；?丙烯酸。

優(yōu)選地，所述小分子化合物為(Z)-3-(4-羥基苯基)-2-(4-甲基苯甲酰基)丙烯酸。

優(yōu)選地，所述小分子化合物為(Z)-3-(4-甲基苯基)-2-(4-甲基苯甲?；?丙烯酸。

肺鱗癌化療敏感性技術方案：

基因TRPM7作為靶標在制備促進肺鱗癌對化療藥物敏感性的藥物中的應用。

具體實施例中，所述化療藥物為順鉑。

抑制基因TRPM7表達的抑制劑在制備促進肺鱗癌對化療藥物敏感性的藥物中的應用。

其中，所述抑制劑可以為干擾基因TRPM7表達的RNA片段，如靶向干擾基因TRPM7表達的siRNA或shRNA，或為下調(diào)基因TRPM7表達的小分子化合物。

進一步地，所述小分子化合物具有如下結(jié)構(gòu)的通式：

R1選自-CH₃或-OCH₃，R3選自-H或-OH。

優(yōu)選地，所述小分子化合物為(Z)-3-(3-羥基苯基)-2-(4-甲基苯甲?；?丙烯酸。

優(yōu)選地，小分子化合物為(Z)-3-(3,4-二羥基苯基)-2-(4-甲基苯甲?；?丙烯酸。

優(yōu)選地，小分子化合物為(Z)-3-(3,4-二羥基苯基)-2-(4-甲氧基苯甲酰基)丙烯酸。

小細胞肺癌化療敏感性技術方案：

基因LIN28作為靶標在制備促進小細胞肺癌對化療藥物敏感性的藥物中的應用。

具體實施例中，所述化療藥物為順鉑。

抑制基因LIN28表達的抑制劑在制備促進小細胞肺癌對化療藥物敏感性的藥物中的應用。

其中，所述抑制劑可以為干擾基因LIN28表達的RNA片段，如靶向干擾基因LIN28表達的siRNA或shRNA，或為下調(diào)基因LIN28表達的小分子化合物。

進一步地，所述小分子化合物具有如下結(jié)構(gòu)的通式：

R2和R3為-OH或-H，或R2和R3為-O-CH₂-O-。

進一步地，小分子化合物為(Z)-3-(3,4-二羥基苯基)-2-(4-甲氧基苯甲?；?丙烯酸。

進一步地，小分子化合物為(Z)-3-(3-羥基苯基)-2-(4-甲氧基苯甲?；?丙烯酸。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明提供的技術方案通過下調(diào)肺腺癌中基因STAT3的表達可以顯著提高肺腺癌對順鉑的化療敏感性，通過下調(diào)肺鱗癌中基因TRPM7的表達可以顯著提高肺鱗癌對順鉑的化療敏感性，通過下調(diào)小細胞肺癌中基因LIN28的表達可以顯著提高小細胞肺癌對順鉑的化療敏感性；本發(fā)明技術方案提供的上述基因的表達抑制劑可以有效提高順鉑的化療敏感性，從而可以降低順鉑的給藥劑量，降低順鉑對機體帶來的不良反應。

附圖說明

圖1為轉(zhuǎn)染含STAT3-shRNA序列的慢病毒重組載體的293FT細胞在倒置熒光顯微鏡下的100×顯微放大圖，圖中灰色板塊代表綠色熒光；

圖2A為shRNA干擾后SPCA-1細胞中STAT3 mRNA的表達變化；圖2B為shRNA干擾后SK-MES-1細胞中TRPM7 mRNA的表達變化；圖2C為shRNA干擾后NCI-H1688細胞中LIN28 mRNA的表達變化；

圖3為shRNA干擾后細胞中靶基因蛋白的表達變化；其中，A為shRNA干擾后SPCA-1細胞中STAT3蛋白的表達變化；B為shRNA干擾后SK-MES-1細胞中TRPM7蛋白的表達變化；C為shRNA干擾后NCI-H1688細胞中LIN28蛋白的表達變化。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例和附圖詳細介紹本發(fā)明的技術方案和技術效果。

實施例1：基因表達與肺癌化療敏感性的相關性

一、實驗材料

1、實驗細胞

包括肺腺癌細胞株SPCA-1、A549；肺鱗癌細胞株SK-MES-1、NCI-H520；小細胞肺癌細胞株NCI-H1688、NCI-H446。各細胞株均為本公司凍存，復蘇后按如下方法培養(yǎng)：

SPCA-1：37℃、5％CO₂條件下常規(guī)培養(yǎng)于含10％胎牛血清(GIBICO公司)的RPMI-1640培養(yǎng)液(GIBICO公司)中，當細胞密度達75％～85％時進行傳代培養(yǎng)。

A549：37℃、5％CO₂條件下常規(guī)培養(yǎng)于含10％胎牛血清(GIBICO公司)的RPMI-1640培養(yǎng)液(GIBICO公司)中，當細胞密度達75％～85％時進行傳代培養(yǎng)。

SK-MES-1：37℃、5％CO₂條件下常規(guī)培養(yǎng)于含10％胎牛血清(GIBICO公司)的RPMI-1640培養(yǎng)液(GIBICO公司)中，當細胞密度達75％～85％時進行傳代培養(yǎng)。

NCI-H520：37℃、5％CO₂條件下常規(guī)培養(yǎng)于含10％胎牛血清(GIBICO公司)的RPMI-1640培養(yǎng)液(GIBICO公司)中，當細胞密度達75％～85％時進行傳代培養(yǎng)。

NCI-H1688：37℃、5％CO₂條件下常規(guī)培養(yǎng)于含10％胎牛血清(GIBICO公司)的RPMI-1640培養(yǎng)液(GIBICO公司)中，當細胞密度達75％～85％時進行傳代培養(yǎng)。

NCI-H446：37℃、5％CO₂條件下常規(guī)培養(yǎng)于含10％胎牛血清(GIBICO公司)的RPMI-1640培養(yǎng)液(GIBICO公司)中，當細胞密度達75％～85％時進行傳代培養(yǎng)。

2、實驗動物

SPF級BALB/c裸鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司，7周齡，體重19.5～22.5g。所有小鼠置于溫度(22±2)℃、濕度(60±5)℃、12h明暗交替環(huán)境中飼養(yǎng)。

其他材料包括常規(guī)試劑、常規(guī)儀器等均為本領域技術人員熟知并易于獲取的材料。

二、實驗方法

1、慢病毒載體的構(gòu)建及慢病毒的包裝

shRNA設計：根據(jù)GenBank中基因cDNA序列，利用Invitrogen公司軟件BLOCK-iT^TMRNAi Designer設計出目的基因的shRNA片段，每個基因選出1條最優(yōu)的片段，同時設置陰性對照(negative control,NC)。

shRNA片段序列如下表所示：

慢病毒載體的構(gòu)建：按照慢病毒包裝試劑盒(Invitrogen)說明書中操作步驟構(gòu)建pcDNA^TM6.2-GW/EMGFP-miR表達載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞TOP10，提取質(zhì)粒，通過BP/LR反應構(gòu)建目的基因表達重組載體pLenti6/V5-DEST，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞Stb13，提取質(zhì)粒用于病毒包轉(zhuǎn)。

慢病毒的包裝：將提取好的高純度的pLenti6/V5-DEST、包轉(zhuǎn)試劑Virapower^TMpackaging mix(Invitrogen)和Lipofectamime^TM 2000(Invitrogen)共轉(zhuǎn)染293FT細胞，第2天用新的完全培養(yǎng)基替代舊的培養(yǎng)基，48～72h后收集細胞液，3000r/min 4℃離心5min，吸出上清分裝后置于-80℃保存。

2、細胞分組及轉(zhuǎn)染

取對數(shù)生長期的肺腺癌細胞株SPCA-1、肺鱗癌細胞株SK-MES-1、小細胞肺癌細胞株NCI-H1688，分別分為空白對照組、RNA干擾組和陰性對照組?？瞻讓φ战M不進行轉(zhuǎn)染處理，RNA干擾組轉(zhuǎn)染含shRNA序列的慢病毒重組載體，陰性對照組轉(zhuǎn)染含shRNA-NC序列的慢病毒重組載體。具體如下：

SPCA-1 RNA干擾組：轉(zhuǎn)染含STAT3-shRNA的慢病毒重組載體；

SPCA-1陰性對照組：轉(zhuǎn)染含STAT3-shRNA-NC的慢病毒重組載體；

SK-MES-1 RNA干擾組：轉(zhuǎn)染含TRPM7-shRNA的慢病毒重組載體；

SK-MES-1陰性對照組：轉(zhuǎn)染含TRPM7-shRNA-NC的慢病毒重組載體；

NCI-H1688 RNA干擾組：轉(zhuǎn)染含LIN28-shRNA的慢病毒重組載體；

NCI-H1688陰性對照組：轉(zhuǎn)染含LIN28-shRNA-NC的慢病毒重組載體。

靶細胞轉(zhuǎn)染方法：

取對數(shù)生長期的細胞，以1×10⁵/孔的密度接種于24孔板，每孔加0.5mL含10％胎牛血清和抗生素的培養(yǎng)基，37℃、5％CO₂培養(yǎng)24h后換液。取100μL病毒原液加入到400μL含10％胎牛血清的培養(yǎng)基中稀釋，同時加入聚凝胺至終濃度為8μg/mL，37℃、5％CO₂培養(yǎng)24h。換用0.5mL不含聚凝胺的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48-72h，于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染細胞中的綠色熒光蛋白(GFP)的表達情況，GFP陽性細胞率＞80％，則進行后續(xù)實驗。

3、Real-time RT-PCR方法測定細胞中靶基因的mRNA表達水平

將空白對照及轉(zhuǎn)染處理的肺腺癌細胞株SPCA-1、肺鱗癌細胞株SK-MES-1、小細胞肺癌細胞株NCI-H1688在37℃、5％CO₂條件下常規(guī)培養(yǎng)，至細胞生長達到85％左右，用0.25％胰酶消化、收集細胞，按RNeasy Mini Kit說明書提取總RNA，凝膠電泳鑒定其完整性，分光光度法測定其純度和量。根據(jù)Real time PCR試劑盒說明書中的方法配置好各個樣品的反應體系，在PCR儀上設置好反應程序進行PCR反應。以GAPDH為內(nèi)參基因，用實時定量PCR相對定量法對SPCA-1細胞中的STAT3 mRNA、SK-MES-1細胞中的TRPM7 mRNA、NCI-H1688細胞中的LIN28 mRNA結(jié)果進行分析。

各基因的RT-PCR引物序列設計如下：

4、Western blot法測定細胞中靶基因?qū)鞍椎谋磉_水平

將空白對照及轉(zhuǎn)染處理的肺腺癌細胞株SPCA-1、肺鱗癌細胞株SK-MES-1、小細胞肺癌細胞株NCI-H1688在37℃、5％CO₂條件下常規(guī)培養(yǎng)，至細胞生長達到85％左右，用細胞裂解試劑盒對細胞進行裂解，裂解細胞時加入2×loading蛋白上樣緩沖液，95℃加熱5min，用10％SDS-PAGE蛋白電泳分離樣品，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至PVDF膜。5％脫脂奶粉室溫封閉2h，加入一抗4℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗室溫孵育1h，ECL化學發(fā)光檢測顯影，在凝膠成像系統(tǒng)上拍照并分析。以β-actin為內(nèi)參，用Quantity One 4.6.2軟件分析條帶灰度值，用相對灰度值對SPCA-1細胞中的STAT3蛋白、SK-MES-1細胞中的TRPM7蛋白、NCI-H1688細胞中的LIN28蛋白結(jié)果進行分析。

5、MTT法檢測不同細胞對順鉑的化療敏感性

取對數(shù)生長期的細胞(SPCA-1的空白對照組、RNA干擾組和陰性對照組；SK-MES-1的空白對照組、RNA干擾組和陰性對照組；NCI-H1688的空白對照組、RNA干擾組和陰性對照組)，用2.5g/L的胰蛋白酶消化，用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基制成單細胞懸液，按1×10⁵/mL接種于96孔板中，置37℃、體積分數(shù)5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后加入終濃度為0、0.5、1、2、4、8μM的順鉑(SPCA-1細胞)或終濃度為0、5、10、20、40、80μM的順鉑(SK-MES-1和NCI-H1688細胞)，每濃度設3個復孔，藥物作用48h后每孔加入5g/L MTT 20μL，37℃繼續(xù)孵育4h后小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入DMSO 150μL，置搖床上低速振蕩10min，酶標儀測量490nm波長處的吸光度值(A)。抑制率＝(對照組A值-各濃度組A值)/對照組A值×100％，并繪制藥物-劑量反應曲線，Bliss法計算IC50。

三、實驗結(jié)果

1、慢病毒重組載體的包裝

將包裝質(zhì)粒和包裝試劑一起通過Lipofectamime^TM 2000轉(zhuǎn)入293FT細胞后，其包裝成功的確認和效率可通過綠色熒光蛋白基因(GFP)的表達判斷，轉(zhuǎn)染48h后倒置熒光顯微鏡下可見綠色熒光，證明轉(zhuǎn)染成功。圖1為轉(zhuǎn)染含STAT3-shRNA序列的慢病毒重組載體的293FT細胞在倒置熒光顯微鏡下的100×顯微放大圖，未轉(zhuǎn)染的293FT細胞未見綠色熒光。轉(zhuǎn)染其他序列的293FT細胞的綠色熒光蛋白基因的表達情況與STAT3-shRNA基本一致。

2、病毒轉(zhuǎn)導靶細胞

在熒光顯微鏡下可觀察到經(jīng)過轉(zhuǎn)染處理的靶細胞內(nèi)有綠色熒光蛋白的表達，說明質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染靶細胞。各轉(zhuǎn)染處理的靶細胞中綠色熒光蛋白陽性細胞率均大于80％。

上述結(jié)果證明重組載體已成功轉(zhuǎn)染至靶細胞，并在靶細胞中穩(wěn)定表達。

3、shRNA干擾后各細胞中靶基因的mRNA水平的變化

慢病毒轉(zhuǎn)染肺腺癌細胞株SPCA-1后，Real-time PCR檢測STAT3 mRNA結(jié)果顯示，與空白對照組及陰性對照組比較，SPCA-1 RNA干擾組STAT3 mRNA水平顯著降低(P<0.01)；慢病毒轉(zhuǎn)染肺鱗癌細胞株SK-MES-1后，Real-time PCR檢測TRPM7 mRNA結(jié)果顯示，與空白對照組及陰性對照組比較，SK-MES-1 RNA干擾組TRPM7 mRNA水平顯著降低(P<0.01)；慢病毒轉(zhuǎn)染小細胞肺癌細胞株NCI-H1688后，Real-time PCR檢測LIN28 mRNA結(jié)果顯示，與空白對照組及陰性對照組比較，NCI-H1688 RNA干擾組LIN28 mRNA水平顯著降低(P<0.01)。結(jié)果見下表和圖2A-2C。

4、shRNA干擾后各細胞中靶基因的蛋白質(zhì)水平的變化

慢病毒轉(zhuǎn)染肺腺癌細胞株SPCA-1后，Western blot檢測STAT3蛋白結(jié)果顯示，與空白對照組及陰性對照組比較，SPCA-1 RNA干擾組STAT3蛋白水平顯著降低(P<0.01)；慢病毒轉(zhuǎn)染肺鱗癌細胞株SK-MES-1后，Western blot檢測TRPM7蛋白結(jié)果顯示，與空白對照組及陰性對照組比較，SK-MES-1 RNA干擾組TRPM7蛋白水平顯著降低(P<0.01)；慢病毒轉(zhuǎn)染小細胞肺癌細胞株NCI-H1688后，Western blot檢測LIN28蛋白結(jié)果顯示，與空白對照組及陰性對照組比較，NCI-H1688RNA干擾組LIN28蛋白水平顯著降低(P<0.01)。

結(jié)果見圖3。

上述結(jié)果證明，含有上述shRNA片段的慢病毒重組載體可以有效下調(diào)靶基因的表達。

5、不同細胞對順鉑的化療敏感性

慢病毒轉(zhuǎn)染肺腺癌細胞株SPCA-1后，MTT實驗結(jié)果顯示，與空白對照組及陰性對照組比較，SPCA-1 RNA干擾組對順鉑的化療敏感性明顯增加，IC50值顯著降低(P<0.01)；慢病毒轉(zhuǎn)染肺腺癌細胞株SK-MES-1后，MTT實驗結(jié)果顯示，與空白對照組及陰性對照組比較，SK-MES-1 RNA干擾組對順鉑的化療敏感性明顯增加，IC50值顯著降低(P<0.01)；慢病毒轉(zhuǎn)染小細胞肺癌細胞株NCI-H1688后，MTT實驗結(jié)果顯示，與空白對照組及陰性對照組比較，NCI-H1688RNA干擾組對順鉑的化療敏感性明顯增加，IC50值顯著降低(P<0.01)。

不同細胞對順鉑的藥物敏感性見下表：

上述結(jié)果表明，STAT3低表達，肺腺癌SPCA-1細胞對順鉑的敏感性顯著增加；TRPM7低表達后，肺鱗癌SK-MES-1細胞對順鉑的敏感性顯著增加；LIN28低表達后，小細胞肺癌NCI-H1688對順鉑的敏感性顯著增加。

實施例2：以靶基因為靶標篩選提高肺癌化療敏感性的化合物

一、實驗材料

1、實驗細胞

包括肺腺癌細胞株SPCA-1、A549；肺鱗癌細胞株SK-MES-1、NCI-H520；小細胞肺癌細胞株NCI-H1688、NCI-H446。各細胞株均為本公司凍存，復蘇后按如下方法培養(yǎng)：

SPCA-1：37℃、5％CO₂條件下常規(guī)培養(yǎng)于含10％胎牛血清(GIBICO公司)的RPMI-1640培養(yǎng)液(GIBICO公司)中，當細胞密度達75％～85％時進行傳代培養(yǎng)。

A549：37℃、5％CO₂條件下常規(guī)培養(yǎng)于含10％胎牛血清(GIBICO公司)的RPMI-1640培養(yǎng)液(GIBICO公司)中，當細胞密度達75％～85％時進行傳代培養(yǎng)。

SK-MES-1：37℃、5％CO₂條件下常規(guī)培養(yǎng)于含10％胎牛血清(GIBICO公司)的RPMI-1640培養(yǎng)液(GIBICO公司)中，當細胞密度達75％～85％時進行傳代培養(yǎng)。

NCI-H520：37℃、5％CO₂條件下常規(guī)培養(yǎng)于含10％胎牛血清(GIBICO公司)的RPMI-1640培養(yǎng)液(GIBICO公司)中，當細胞密度達75％～85％時進行傳代培養(yǎng)。

NCI-H1688：37℃、5％CO₂條件下常規(guī)培養(yǎng)于含10％胎牛血清(GIBICO公司)的RPMI-1640培養(yǎng)液(GIBICO公司)中，當細胞密度達75％～85％時進行傳代培養(yǎng)。

NCI-H446：37℃、5％CO₂條件下常規(guī)培養(yǎng)于含10％胎牛血清(GIBICO公司)的RPMI-1640培養(yǎng)液(GIBICO公司)中，當細胞密度達75％～85％時進行傳代培養(yǎng)。

2、實驗動物

SPF級BALB/c裸鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司，7周齡，體重19.5～22.5g。所有小鼠置于溫度(22±2)℃、濕度(60±5)℃、12h明暗交替環(huán)境中飼養(yǎng)。

其他材料包括常規(guī)試劑、常規(guī)儀器等均為本領域技術人員熟知并易于獲取的材料。

二、實驗方法

1、化合物干擾處理肺癌細胞

取對數(shù)生長期的細胞，以1×10⁵/孔的密度接種于孔板中，每孔加含10％胎牛血清和抗生素的培養(yǎng)基，37℃、5％CO₂培養(yǎng)24h后換含有待測試化合物的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h。

各化合物名稱、結(jié)構(gòu)、編號及給藥濃度如下：

2、Real-time RT-PCR方法測定細胞中靶基因的mRNA表達水平

將空白對照及化合物干擾處理的肺腺癌細胞株SPCA-1、肺鱗癌細胞株SK-MES-1、小細胞肺癌細胞株NCI-H1688在37℃、5％CO₂條件下常規(guī)培養(yǎng)，至細胞生長達到85％左右，用0.25％胰酶消化、收集細胞，按RNeasy Mini Kit說明書提取總RNA，凝膠電泳鑒定其完整性，分光光度法測定其純度和量。根據(jù)Real time PCR試劑盒說明書中的方法配置好各個樣品的反應體系，在PCR儀上設置好反應程序進行PCR反應。以GAPDH為內(nèi)參基因，用實時定量PCR相對定量法對SPCA-1細胞中的STAT3 mRNA、SK-MES-1細胞中的TRPM7 mRNA、NCI-H1688細胞中的LIN28 mRNA結(jié)果進行分析。

各基因的RT-PCR引物序列設計如下：

3、Western blot法測定細胞中靶基因?qū)鞍椎谋磉_水平

將空白對照及化合物干擾處理的肺腺癌細胞株SPCA-1、肺鱗癌細胞株SK-MES-1、小細胞肺癌細胞株NCI-H1688在37℃、5％CO₂條件下常規(guī)培養(yǎng)，至細胞生長達到85％左右，用細胞裂解試劑盒對細胞進行裂解，裂解細胞時加入2×loading蛋白上樣緩沖液，95℃加熱5min，用10％SDS-PAGE蛋白電泳分離樣品，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至PVDF膜。5％脫脂奶粉室溫封閉2h，加入一抗4℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗室溫孵育1h，ECL化學發(fā)光檢測顯影，在凝膠成像系統(tǒng)上拍照并分析。以β-actin為內(nèi)參，用Quantity One 4.6.2軟件分析條帶灰度值，用相對灰度值對SPCA-1細胞中的STAT3蛋白、SK-MES-1細胞中的TRPM7蛋白、NCI-H1688細胞中的LIN28蛋白結(jié)果進行分析。

4、MTT法檢測不同細胞對順鉑的化療敏感性

取對數(shù)生長期的細胞(SPCA-1的空白對照組、化合物干擾組；SK-MES-1的空白對照組、化合物干擾組；NCI-H1688的空白對照組、化合物干擾組)，用2.5g/L的胰蛋白酶消化，用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基制成單細胞懸液，按1×10⁵/mL接種于96孔板中，置37℃、體積分數(shù)5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后加入終濃度為0、0.5、1、2、4、8μM的順鉑(SPCA-1細胞)或終濃度為0、5、10、20、40、80μM的順鉑(SK-MES-1和NCI-H1688細胞)，每濃度設3個復孔，藥物作用48h后每孔加入5g/L MTT 20μL，37℃繼續(xù)孵育4h后小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入DMSO 150μL，置搖床上低速振蕩10min，酶標儀測量490nm波長處的吸光度值(A)。抑制率＝(對照組A值-各濃度組A值)/對照組A值×100％，并繪制藥物-劑量反應曲線，Bliss法計算IC50。

三、實驗結(jié)果

1、化合物干擾后各細胞中靶基因的mRNA水平的變化

化合物處理肺腺癌細胞株SPCA-1后，Real-time PCR檢測STAT3 mRNA結(jié)果顯示，與空白對照組比較，化合物干擾組STAT3 mRNA水平顯著降低(P<0.01)；化合物處理肺鱗癌細胞株SK-MES-1后，Real-time PCR檢測TRPM7 mRNA結(jié)果顯示，與空白對照組比較，化合物干擾組TRPM7 mRNA水平顯著降低(P<0.01)；化合物處理小細胞肺癌細胞株NCI-H1688后，Real-time PCR檢測LIN28 mRNA結(jié)果顯示，與空白對照組比較，化合物干擾組LIN28mRNA水平顯著降低(P<0.01)。

結(jié)果見下表。

2、化合物干擾后各細胞中靶基因的蛋白水平的變化

化合物處理肺腺癌細胞株SPCA-1后，Western blot檢測STAT3蛋白結(jié)果顯示，與空白對照組比較，化合物干擾組STAT3蛋白水平顯著降低(P<0.01)；化合物處理肺鱗癌細胞株SK-MES-1后，Western blot檢測TRPM7蛋白結(jié)果顯示，與空白對照組比較，化合物干擾組TRPM7蛋白水平顯著降低(P<0.01)；化合物處理小細胞肺癌細胞株NCI-H1688后，Western blot檢測LIN28蛋白結(jié)果顯示，與空白對照組比較，化合物干擾組LIN28蛋白水平顯著降低(P<0.01)。結(jié)果見下表。

3、化合物處理后各細胞對順鉑的化療敏感性

化合物處理肺腺癌細胞株SPCA-1后，MTT實驗結(jié)果顯示，與空白對照組比較，化合物處理組對順鉑的化療敏感性明顯增加，IC50值顯著降低(P<0.01)；化合物處理肺腺癌細胞株SK-MES-1后，MTT實驗結(jié)果顯示，與空白對照組比較，化合物處理組對順鉑的化療敏感性明顯增加，IC50值顯著降低(P<0.01)；化合物處理小細胞肺癌細胞株NCI-H1688后，MTT實驗結(jié)果顯示，與空白對照組比較，化合物處理組對順鉑的化療敏感性明顯增加，IC50值顯著降低(P<0.01)。不同細胞對順鉑的藥物敏感性見下表：

化合物1-4對鱗癌SK-MES-1和小細胞癌NCI-H1688無明顯增敏作用(80μM干擾48h后順鉑IC50值無明顯降低，下同)；化合物5、6對腺癌SPCA-1和小細胞癌NCI-H1688無明顯增敏作用；化合物8、9對腺癌SPCA-1和鱗癌SK-MES-1無明顯增敏作用；化合物7對鱗癌SK-MES-1和小細胞癌NCI-H1688都具有明顯的增敏作用。

化合物1-4具有如下共同的結(jié)構(gòu)：

其中，R3為-H,-OCH₃,-OH,-CH₃。

化合物5-7具有如下共同的結(jié)構(gòu)：

其中，R1為-CH₃或-OCH₃，R3為-H或-OH。

化合物7-9具有如下共同的結(jié)構(gòu)：

其中，R2和R3為-OH或-H，或R2和R3為-O-CH₂-O-。

化合物1-9對人正常胚肺MRC-5細胞的毒性：

取對數(shù)生長期的MRC-5細胞，用DMEM高糖培養(yǎng)液調(diào)整至5×10⁴/ml，以90μl/孔加入96孔培養(yǎng)板中。實驗分空白對照組、給藥組(10、20、40、80、160μM)，置37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24h后分別以10μl/孔加入藥物或溶媒，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。于實驗終止前4h加入MTT(10μl/孔)，實驗終止時加入10％SDS(100μl/孔)，置培養(yǎng)箱中過夜，次日于波長570nm處測定吸光值。按下式計算抑制率。抑制率＝(空白對照組A值-給藥組A值)/空白對照組A值×100％。結(jié)果證明，化合物1-9對正常胚肺細胞均無明顯的細胞毒性，最大給藥濃度160μM時對人正常胚肺MRC-5細胞的抑制率最大不超過15％。

實施例3：從動物水平對篩選出的化合物進行活性確證

一、實驗材料

1、實驗細胞

包括肺腺癌細胞株SPCA-1、A549；肺鱗癌細胞株SK-MES-1、NCI-H520；小細胞肺癌細胞株NCI-H1688、NCI-H446。各細胞株均為本公司凍存，復蘇后按如下方法培養(yǎng)：

SPCA-1：37℃、5％CO₂條件下常規(guī)培養(yǎng)于含10％胎牛血清(GIBICO公司)的RPMI-1640培養(yǎng)液(GIBICO公司)中，當細胞密度達75％～85％時進行傳代培養(yǎng)。

A549：37℃、5％CO₂條件下常規(guī)培養(yǎng)于含10％胎牛血清(GIBICO公司)的RPMI-1640培養(yǎng)液(GIBICO公司)中，當細胞密度達75％～85％時進行傳代培養(yǎng)。

SK-MES-1：37℃、5％CO₂條件下常規(guī)培養(yǎng)于含10％胎牛血清(GIBICO公司)的RPMI-1640培養(yǎng)液(GIBICO公司)中，當細胞密度達75％～85％時進行傳代培養(yǎng)。

NCI-H520：37℃、5％CO₂條件下常規(guī)培養(yǎng)于含10％胎牛血清(GIBICO公司)的RPMI-1640培養(yǎng)液(GIBICO公司)中，當細胞密度達75％～85％時進行傳代培養(yǎng)。

NCI-H1688：37℃、5％CO₂條件下常規(guī)培養(yǎng)于含10％胎牛血清(GIBICO公司)的RPMI-1640培養(yǎng)液(GIBICO公司)中，當細胞密度達75％～85％時進行傳代培養(yǎng)。

NCI-H446：37℃、5％CO₂條件下常規(guī)培養(yǎng)于含10％胎牛血清(GIBICO公司)的RPMI-1640培養(yǎng)液(GIBICO公司)中，當細胞密度達75％～85％時進行傳代培養(yǎng)。

2、實驗動物

SPF級BALB/c裸鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司，7周齡，體重19.5～22.5g。所有小鼠置于溫度(22±2)℃、濕度(60±5)℃、12h明暗交替環(huán)境中飼養(yǎng)。

其他材料包括常規(guī)試劑、常規(guī)儀器等均為本領域技術人員熟知并易于獲取的材料。

二、實驗方法

1、動物模型的建立及分組

肺腺癌裸鼠：取對數(shù)生長期肺腺癌A549細胞用0.25％胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，臺盼藍拒染法記數(shù)活細胞數(shù)占95％以上，將細胞密度調(diào)至1×10⁷/ml，每只裸鼠取0.2ml細胞懸液接種于右大腿背側(cè)皮下，術前測量體重。接種后每日觀察，待出現(xiàn)肉眼可見移植瘤后，用游標卡尺測量移植瘤，待移植瘤體積達100mm³左右將裸鼠按瘤體積和荷瘤鼠體重均衡原則隨機分為空白對照組、低劑量組、高劑量組、單順鉑組，空白對照組給予等體積生理鹽水，經(jīng)皮下注射給藥，隔天一次，連續(xù)十次。藥物處理結(jié)束后一天，頸椎脫臼法處死裸鼠，照相，觀察記錄各組裸鼠包塊形態(tài)大小，將腫塊剝出、稱重，冷藏于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

肺鱗癌裸鼠：取對數(shù)生長期肺鱗癌NCI-H520細胞用0.25％胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，臺盼藍拒染法記數(shù)活細胞數(shù)占95％以上，將細胞密度調(diào)至1×10⁷/ml，每只裸鼠取0.2ml細胞懸液接種于右大腿背側(cè)皮下，術前測量體重。接種后每日觀察，待出現(xiàn)肉眼可見移植瘤后，用游標卡尺測量移植瘤，待移植瘤體積達100mm³左右將裸鼠按瘤體積和荷瘤鼠體重均衡原則隨機分為空白對照組、低劑量組、高劑量組、單順鉑組，空白對照組給予等體積生理鹽水，經(jīng)皮下注射給藥，隔天一次，連續(xù)十次。藥物處理結(jié)束后一天，頸椎脫臼法處死裸鼠，照相，觀察記錄裸鼠包塊形態(tài)大小，將腫塊剝出、稱重，立即冷藏于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

小細胞肺癌裸鼠：取處于對數(shù)生長期體外培養(yǎng)的小細胞肺癌NCI-H446細胞用0.25％胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，臺盼藍拒染法記數(shù)活細胞數(shù)占95％以上，將細胞密度調(diào)至1×10⁷/ml，每只裸鼠取0.2ml細胞懸液接種于右大腿背側(cè)皮下，術前測量體重。接種后每日觀察，待出現(xiàn)肉眼可見移植瘤后，用游標卡尺測量移植瘤，待移植瘤體積達100mm³左右將裸鼠按瘤體積和荷瘤鼠體重均衡原則隨機分為空白對照組、低劑量組、高劑量組、單順鉑組，空白對照組給予等體積生理鹽水，經(jīng)皮下注射給藥，隔天一次，連續(xù)十次。藥物處理結(jié)束后一天，頸椎脫臼法處死裸鼠，照相，觀察記錄各組裸鼠包塊形態(tài)大小，將每個腫塊剝出、稱重，立即冷藏于-80℃冰箱備用。

2、給藥方案及化療敏感性評價

各組給藥方案如下表：

通過腫瘤抑制率比較不同組別裸鼠對順鉑的化療敏感性，抑瘤率＝(1-給藥組瘤重/空白對照組瘤重)×100％。

3、腫瘤組織中靶基因的mRNA表達水平

液氮磨組織提取RNA，取100mg組織加入1mL Trizol，提取總RNA。紫外分光光度計測定A260及A280，分析RNA純度并調(diào)整濃度。根據(jù)Real time PCR試劑盒說明書中的方法配置好各個樣品的反應體系，在PCR儀上設置好反應程序進行PCR反應。以GAPDH為內(nèi)參基因，用實時定量PCR相對定量法對A549肺腺癌組織中的STAT3 mRNA、NCI-H520肺鱗癌組織中的TRPM7 mRNA、NCI-H446小細胞肺癌組織中的LIN28 mRNA結(jié)果進行分析。

各基因的RT-PCR引物序列設計如下：

4、腫瘤組織中靶基因蛋白的表達水平

液氮磨組織提取蛋白質(zhì)，取100mg組織加入0.75mL細胞裂解液，提取總蛋白。運用BCA法測定蛋白量。每例取50μg，與4×上樣緩沖液混合后煮沸5min，在15％SDS-PAGE電泳，然后電轉(zhuǎn)移至0.22μm PVDF膜上，5％脫脂奶粉室溫封閉2h，加入一抗4℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗室溫孵育1h，ECL化學發(fā)光檢測顯影，在凝膠成像系統(tǒng)上拍照并分析。以β-actin為內(nèi)參，用Quantity One 4.6.2軟件分析條帶灰度值，用相對灰度值對A549肺腺癌組織中的STAT3蛋白、NCI-H520肺鱗癌組織中的TRPM7蛋白、NCI-H446小細胞肺癌組織中的LIN28蛋白結(jié)果進行分析。

三、實驗結(jié)果

1、不同裸鼠對順鉑的化療敏感性

化合物1-4與順鉑聯(lián)合給藥可以顯著提高肺腺癌裸鼠對順鉑的化療敏感性；化合物5-7與順鉑聯(lián)合給藥可以顯著提高肺鱗癌裸鼠對順鉑的化療敏感性；化合物7-9與順鉑聯(lián)合給藥可以顯著提高小細胞肺癌裸鼠對順鉑的化療敏感性。

不同組別裸鼠對順鉑的化療敏感性結(jié)果見下表：

2、肺癌組織中靶基因的mRNA表達水平的變化

化合物1-4可以顯著降低裸鼠肺腺癌組織中STAT3 mRNA水平，且呈一定的濃度相關性；化合物5-7可以顯著降低裸鼠肺鱗癌組織中TRPM7 mRNA水平，且呈一定的濃度相關性；化合物7-9可以顯著降低裸鼠小細胞肺癌組織中LIN28 mRNA水平，且呈一定的濃度相關性。

mRNA表達水平見下表。

3、肺癌組織中靶基因的蛋白表達水平的變化

化合物1-4可以顯著降低裸鼠肺腺癌組織中STAT3蛋白水平，且呈一定的濃度相關性；化合物5-7可以顯著降低裸鼠肺鱗癌組織中TRPM7蛋白水平，且呈一定的濃度相關性；化合物7-9可以顯著降低裸鼠小細胞肺癌組織中LIN28蛋白水平，且呈一定的濃度相關性。

蛋白表達水平見下表。

使用順鉑化療時，輔以化合物1-7可以顯著提高順鉑對裸鼠移植瘤的抑制率，裸鼠移植瘤組織學分析發(fā)現(xiàn)，相關靶基因的表達顯著下調(diào)。

上述實施例證明：本發(fā)明提供的技術方案通過下調(diào)肺腺癌中基因STAT3的表達可以顯著提高肺腺癌對順鉑的化療敏感性，通過下調(diào)肺鱗癌中基因TRPM7的表達可以顯著提高肺鱗癌對順鉑的化療敏感性，通過下調(diào)小細胞肺癌中基因LIN28的表達可以顯著提高小細胞肺癌對順鉑的化療敏感性；本發(fā)明技術方案提供的上述基因的表達抑制劑可以有效提高順鉑的化療敏感性，從而可以降低順鉑的給藥劑量，降低順鉑對機體帶來的不良反應。