本發明屬于藥物篩選技術領域，具體涉及一種抗真菌增效藥物體內篩選方法。
背景技術：
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近年隨著高效廣譜抗生素、免疫抑制劑和細胞毒藥物的廣泛應用，致使侵襲性念珠菌感染的發病率和死亡率不斷上升。念珠菌治療特別是耐藥白色念珠菌感染治療已成為困擾臨床的棘手問題。組合藥物治療以其可以同時針對多個靶點、提高藥效、降低藥量、減少不良反應發生、延遲抗藥性形成的優點，成為未來藥物研發的熱點和趨勢。因此，建立白色念珠菌互動增效藥物體內篩選系統，對加速抗真菌藥物研發，解決臨床治療的棘手問題具有重要意義。
隨著不同組學技術的進步，生物信息學與計算生物學的發展，整合多種數據資源，建立計算機模型，成為篩選藥物-靶標關系和有效藥物組合的重要手段。但是這些被篩選出的有效藥物組合真正運用到臨床，需要進一步的驗證。不但需要體外試驗的驗證，同樣需要體內有效性的檢驗。到目前為止的大部分報道中，聯合藥敏方法是最常用的體外檢測藥物聯合作用的實驗方法，而將此方法體系直接運用到體內試驗，需要進行大量的實驗，耗費時間和成本。關于體內增效藥物篩選體系還未見報導。
技術實現要素：
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本發明的目的在于提供一種抗真菌增效藥物體內篩選方法，利用已有的數據庫和文獻中的信息、毒性評價、藥代動力學及體內藥效學研究去篩選有效藥物組合。
一種抗真菌增效藥物體內篩選方法，其特征在于，包括以下步驟：1)收集已知的抗真菌增效藥物組合及生物實驗信息；2)查詢組合藥物的藥代動力學資料，獲得藥物組合中單藥的藥代動力學特征，剔除臨床使用存在安全隱患的藥物組合；3)進行聯合給藥毒性評價，確定聯合給藥毒性特征，剔除聯合給藥毒性增強或有協同作用的藥物組合；4)進行聯合給藥藥代動力學評價，藥代動力學測試結果顯示單藥AUC值增加的藥物組合進入藥效評價；5)利用真菌系統性感染實驗動物模型，測定單藥起效劑量，選擇其中一個藥物起效劑量以下第一個無效劑量作為藥物組合的基礎值，選擇FIC<0.5時對應的A藥的MICA值和B藥的MICB值，根據MICA:MICB比值進行體內聯合給藥組合配對，采用腎組織載菌量作為藥效評價指標，判斷該藥物組合是否具有增效作用。
所述的真菌的臨床感染特征優選為系統性真菌感染。
所述的系統性真菌感染病原菌優選為白色念珠菌。
所述的實驗動物模型優選為小鼠模型。
所述的確定聯合給藥毒性特征，是基于聯合給藥后毒性反應是否增強或有協同作用進行判斷，為臨床應用提供安全性數據。
所述的進行聯合給藥藥代動力學評價，是選擇藥代動力學測試結果顯示單藥AUC值增加的藥物組合進入藥效評價。
所述的聯合給藥藥效評價，是利用真菌系統性感染實驗動物模型，測定單藥起效劑量，選擇其中一個藥物起效劑量以下第一個無效劑量作為藥物組合的基礎值，選擇FIC<0.5時對應的A藥的MICA值和B藥的MICB值，根據MICA:MICB比值進行體內聯合給藥組合配對。
本發明的抗真菌增效藥物體內篩選方法，篩選得到一組新的抗真菌藥物組合，可以降低藥量提高藥效。本發明建立的抗真菌增效藥物體內篩選方法，通過逐級剔除的策略，大量減少實驗的數目、時間和成本，有效的引導藥物學實驗。
具體實施方式：
以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。除非特別說明，本發明采用的試劑、設備為本技術領域常規試劑和設備。
實施例1：
本發明提出的抗真菌增效藥物體內篩選方法，包括以下步驟：
1)收集已知的抗真菌增效藥物組合以及它們的體外生物實驗信息(來自中國發明專利：專利號ZL201110210508)。
收集以下三組藥物組合信息，針對白色念珠菌(Candida albicans)SC5314，以RPMI1640液體培養基作為培養基，以下三組藥物均具有互動抗真菌活性。
第一組：伊曲康唑(Itraconazole)和洛伐他汀(Lovastatin)。棋盤法測得在培養16h、24h、48h，和72h，FIC(分級抑菌濃度指數)<0.5，兩個藥物聯用具有互動抗真菌活性(見表1)。
表1伊曲康唑和洛伐他汀組合使用對白色念珠菌抗菌活性影響
注：MICLovas為洛伐他汀的MIC值
第二組：伏立康唑(Voriconazole)和卡泊芬凈(Caspofungin)。棋盤法測得在培養24h，FIC(分級抑菌濃度指數)<0.5，兩個藥物聯用具有互動抗真菌活性(見表2)。
表2伏立康唑和卡泊芬凈組合使用對白色念珠菌抗菌活性影響
注：MICCaspo為卡泊芬凈的MIC值
第三組：泊沙康唑(Posaconazole)和特比萘芬(Terbinafine)。棋盤法測得在培養24h，FIC(分級抑菌濃度指數)<0.5，兩個藥物聯用具有互動抗真菌活性(見表3)。
表3泊沙康唑和特比萘芬組合使用對白色念珠菌抗菌活性影響
注：MICTerb為特比萘芬的MIC值
2)首先，通過查詢組合藥物的藥代動力學資料，獲得藥物組合中單藥的藥代動力學特征，通過分析兩個藥物在藥代動力學方面的相互影響，剔除臨床使用存在安全隱患的藥物組合。
第一組：通過查閱文獻，洛伐他汀(Lovastatin)是一種對體內細胞色素CYP3A4酶敏感的底物，伊曲康唑(Itraconazole)是CYP3A4的強抑制劑，兩藥聯合使用時伊曲康唑(Itraconazole)可使洛伐他汀(Lovastatin)的暴露量升高達20倍，這種藥物相互作用可導致橫紋肌溶解。因此，伊曲康唑(Itraconazole)被例為禁止與洛伐他汀(Lovastatin)聯用的藥物，該組藥物在該階段被剔除，無需進入以下篩選。
第二組：伏立康唑(Voriconazole)主要被肝細胞色素P450同工酶CYP2C19、CYP2C9和CYP3A4代謝。卡泊芬凈(Caspofungin)為棘白菌素類抗真菌藥物，對于細胞色素P450系統中任何一種酶都不抑制。因此，兩個藥物聯用不會影響彼此的藥物動力學，可進入下一步分析。
第三組：泊沙康唑(Posaconazole)主要通過UDP葡糖苷酸化(2相酶)進行代謝，且是P糖蛋白泵出作用的底物，因此，該清除途徑的抑制劑或誘導劑均可對Posaconazole的藥動學產生影響。同時，Posaconazole也是CYP3A4的強效抑制劑，故Posaconazole也可增加通過CYP3A4酶代謝藥物的血藥濃度。Terbinafine幾乎不影響經由細胞色素P450酶系代謝的藥物的清除，故Terbinafine對其它藥物的代謝沒有影響。因此，兩個藥物聯用不會影響彼此的藥物動力學，可進入下一步分析。
3)其次，進行聯合給藥毒性評價，確定聯合給藥毒性特征，剔除聯合給藥毒性增強的藥物組合。
第二組：伏立康唑(Voriconazole)和卡泊芬凈(Caspofungin)。經試驗，卡泊芬凈單次尾靜脈給藥對ICR小鼠的LD50為82.39mg/kg，伏立康唑單次灌胃給藥對ICR小鼠的LD50為261.5mg/kg。卡泊芬凈和伏立康唑聯合給藥，聯合作用系數K＝0.65，介于0.57到1.75之間，根據Keplinger法進行評價，卡泊芬凈和伏立康唑聯合給藥對ICR小鼠所產生的毒效應為相加作用。該組合可進入下一步分析。
第三組：泊沙康唑(Posaconazole)和特比萘芬(Terbinafine)。經試驗，泊沙康唑(A)單次灌胃給藥對ICR小鼠的LD50為463.5mg/kg，特比萘酚(B)單次灌胃給藥對ICR小鼠的LD50為>4000mg/kg。采用A藥物的給藥劑量梯度不變，按臨床有效劑量聯用比例以A：B＝1:1.2加入B藥，采用上下法進行急性毒性試驗，觀察增加B藥后ICR小鼠的毒性反應情況。實驗結果顯示聯合給予特比萘酚后，泊沙康唑對ICR小鼠的LD50不變，毒性作用無增加。該組合可進入下一步分析。
4)再次，進行聯合給藥藥代動力學評價，藥代動力學測試結果顯示單藥AUC值增加的藥物組合進入藥效評價，否則剔除。
第二組：伏立康唑(Voriconazole)和卡泊芬凈(Caspofungin)。聯合給藥藥代動力學結果見表4和表5所示，聯合給藥后Voriconazole和Caspofungin的AUC均有所增加，該組合可進入下一步分析。
表4伏立康唑的藥代動力學參數
表5卡泊芬凈的藥代動力學參數
第三組：泊沙康唑(Posaconazole)和特比萘芬(Terbinafine)。聯合給藥藥代動力學結果見表6和表7所示，聯合給藥后Posaconazole和Terbinafine的AUC均有所增加，該組合可進入下一步分析。
表6泊沙康唑的藥代動力學參數
表7特比萘芬的藥代動力學參數
5)最后，利用白色念珠菌(Candida albicans)SC5314系統性感染小鼠模型，測定單藥起效劑量，選擇其中任何一個藥物起效劑量以下第一個無效劑量作為藥物組合的基礎值，選擇FIC<0.5時對應的A藥的MICA值和B藥的MICB值，根據MICA:MICB比值進行體內聯合給藥組合配對，采用腎組織載菌量作為藥效評價指標，判斷該藥物組合是否具有互動增效作用。
第二組：Voriconazole(A)和Caspofungin(B)。FIC<0.5時A藥對應的MICA值和B藥對應的MICB值分別為0.004μg/mL和0.09375μg/mL，MICA:MICB＝1:23。經動物試驗，Caspofungin的起效劑量為2.5mg/kg，Voriconazole的起效劑量為40mg/kg，選擇Caspofungin(1.25mg/kg)作為組合配對的初始值，設計實驗組合Caspofungin(1.25mg/kg)+Voriconazole(0.05mg/kg)，Caspofungin(2.5mg/kg)+Voriconazole(1mg/kg)進行動物試驗。試驗結果表明兩個試驗組合均未表現出明顯的互動增效作用。
第三組：Posaconazole(A)和Terbinafine(B)。FIC<0.5時A藥對應的MICA值和B藥對應的MICB值分別為0.0005μg/mL和0.015625μg/mL，MICA:MICB＝1:31.25。經動物試驗，Posaconazole的起效劑量為5mg/kg，Terbinafine的起效劑量為200mg/kg。選擇Posaconazole(2.5mg/kg)作為組合配對的初始值，設計實驗組合Posaconazole(2.5mg/kg)+Terbinafine(75mg/kg)，Posaconazole(5mg/kg)+Terbinafine(150mg/kg)進行動物試驗。試驗結果顯示Posaconazole(5mg/kg)+Terbinafine(150mg/kg)聯合給藥組表現出明顯的增效作用(見表8)。
表8各組腎組織載菌量比較
注：T表示Terbinafine，P表示Posaconazole，*表示與模型對照組比較P<0.05，**表示與模型對照組比較P<0.01，##表示與Terbinafine(150mg/kg)單獨給藥組比較P<0.01，△表示與Posaconazole(5mg/kg)單獨給藥組比較P<0.05。