本發明具體涉及新材料技術領域，具體涉及一種有機-無機雜化可控釋放抗菌藥物的聚合物多層膜的制備方法。
背景技術：
隨著材料科學、醫學、生物學的飛速發展，生物醫用材料的研究取得了很大的進步，但仍面臨各種挑戰，一些根本性的問題沒有解決，除了生物相容性問題，生物材料應用的主要障礙還有感染問題。世界上約64%的院內獲得性感染是由植入體或醫療器械上黏附病原菌引起的，如今這一比例還在進一步提高，因此抗菌材料和制品的開發受到越來越多的關注，所以對于如何有效防止細菌粘附生物材料表面已經成為人們研究的熱點課題。通過對各種醫用裝置的表面修飾，在保持原有性能的條件下，改善生物醫用裝置生物相容性成為現代醫療裝置應用中的重要問題。
細菌粘附感染是一個極其復雜的過程，材料表面粘附一直是生物醫學應用中的關鍵問題。由于細胞表面存在范德華力、靜電、氫鍵、離子和親疏水等多種多樣的相互作用，粘附不可避免。粘附感染發生的一般過程是：細菌的黏附；繁殖，形成菌落；分泌胞外基質，菌落通過胞外基質連接在一起，形成生物膜(biofilm)，生物膜釋放浮游菌體和毒素，引發感染，也容易使細菌產生抗藥性。生物膜由于其致密的物理結構，可以制止人體免疫系統中巨噬細胞的吞噬作用，實驗證實在生物膜內的細菌相比自由狀態的細菌抵抗能力增加了1000倍。通過對各種醫用裝置的表面修飾，在保持原有性能的條件下，改善生物醫用裝置生物相容性成為現代醫療裝置應用中的重要問題。臨床處理的方式往往是再次手術取出植入體，清洗或者更換新的植入體，這樣的處理方式不但增加病人的痛苦，而且增加病人經濟負擔，因此尋求一種簡單長效的細菌和酶響應抗菌涂層具有重要的意義。而層層自組裝技術具有簡單、易于操作的特點，并且使膜層具有其組分的復合功能，通過對基材的預處理解決了涂層溶脹帶來的穩定性問題，通過透明質酸酶和細菌響應的抗菌作用獲得可控釋放抗菌藥物的聚合物涂層的，并兼具抗細菌黏附和殺菌的性能。
技術實現要素：
為了解決現有技術的缺陷及不足。本發明提供了一種有機-無機雜化可控釋放抗菌藥物的聚合物多層膜的制備方法。
本發明采用的技術解決方案是：一種有機-無機雜化可控釋放抗菌藥物的聚合物多層膜的制備方法，包括以下步驟：
（1）基材的表面預處理：將洗凈的基材置于5mg/ml的聚乙烯亞胺（PEI）水溶液中，浸泡，獲得表面胺基化的基材；
（2）制備慶大霉素預負載的蒙脫土水溶液；
（3）將上述表面胺基化的基材放入慶大霉素預負載的蒙脫土水溶液中浸泡，然后用pH值相同洗液清洗，用氮氣吹干，放入含有透明質酸溶液浸泡6-8min，用相同pH值的洗液清洗2-3分鐘，氮氣吹干，完成一個雙層膜的制備，重復以上操作，直到完成整個多層膜涂層的制備；
（4）以透明質酸酶或大腸桿菌響應抗菌獲得所述的一種有機-無機雜化可控釋放抗菌藥物的聚合物多層膜涂層。
所述的基材為玻璃、石英、硅片、聚酯膜中的一種。
所述的步驟（2）制備慶大霉素預負載的蒙脫土水溶液包括以下步驟：在pH=4.0的水中，磁力攪拌，緩慢加入100mg蒙脫土，濃度為1mg/ml，磁力攪拌溶解并靜置一星期，超聲24h，緩慢加入100mg 慶大霉素，濃度為1mg/ml，繼續攪拌2h，即得蒙脫土與慶大霉素的負載液。
所述的步驟（1）中洗凈的基材置于5mg/ml的聚乙烯亞胺（PEI）水溶液中浸泡1-4h。
所述的步驟（3）中重復6、9、12或15次操作，制得6、9、12或15個雙層膜涂層的制備。
本發明的有益效果是：本發明提供了一種有機-無機雜化可控釋放抗菌藥物的聚合物多層膜的制備方法，本發明涂層溶液配制簡便，能實現無污染操作，可采用旋涂、浸涂、噴涂等可工業實現的方式，適用范圍廣，能夠對具有復雜體型結構的生物醫用裝置進行涂層修飾；涂層可改善醫用裝置表面的多種抗菌性能，潤滑性，生物相容性，在人體環境下以水凝膠的形式存在，這種性質使生物材料表面潤滑，減少材料表面和粘膜組織之間的摩接阻力；涂層材料化學結構穩定，耐疲勞、剪切，能適應人體的內環境；涂層能夠實現廣譜的多功能抗菌的能力。
具體實施方式
為了能夠更清楚地理解本發明的技術內容，特舉以下實施例詳細說明。
制備慶大霉素預負載的蒙脫土水溶液：
在250ml燒杯中溶于100mL水中(pH=4.0)，磁力攪拌，緩慢加入100mg蒙脫土，濃度為1mg/ml，磁力攪拌溶解并靜置一星期，超聲24h，緩慢加入100mg 慶大霉素，濃度為1mg/ml，繼續攪拌2h，即為蒙脫土與慶大霉素的負載液。
實施例1：
PET片經刀片裁剪成1.5×2.5cm2大小，作為基材使用，用水超聲清洗，N2吹干。用鑷子夾住清洗過的PET先在5mg/ml的PEI中處理30min，在5mg/ml的PEI中處理30min，然后浸入涂膜液中5s，取出，使表面的液體均勻覆蓋，然后放置于玻璃平板上，室溫干燥24h，然后用刀片剝離PET片，繼續真空烘箱室溫干燥12h，收集樣品。然后涂層在1mg/ml的透明質酸中浸泡4h，得到的復合材料，然后用乙醇和清水清洗數次，室溫干燥24h。斷面場發射掃描電鏡測試涂層的厚度為3.56±0.45μm。透射電鏡結果表明：膜層表面很低的粗糙度。
以175u單位的透明質酸酶加入磷酸緩釋液中，慶大霉素藥物的釋放效果比僅在磷酸緩釋液的緩釋效果好。在一定溫度下，以10^4的大腸桿菌加入磷酸緩釋液中，慶大霉素藥物的釋放效果比僅在磷酸緩釋液的緩釋效果好。透明質酸和大腸桿菌增加慶大霉素等抗菌藥物的釋放，具有透明質酸和大腸桿菌的向影響，獲得一種有機-無機雜化可控釋放抗菌藥物的聚合物多層膜涂層。搖瓶培養和稀釋涂平板法測試膜層的殺菌性能，結果顯示該膜層能在10min殺死100%的大腸桿菌和100%的金黃色葡萄球菌。采用MTT和FDA實驗結果發現對人臍靜脈內皮細胞細胞毒性較低，細胞活性超過TCPS的92%，因此具有良好的細胞相容性。
實施例2：
配制1mg/mL的負載慶大霉素的蒙脫土溶于100mL水中，磁力攪拌，測定pH值為2.5。取100ml超純水于燒杯中，調節到相同的pH值，標為洗液1。配制1mg/mL的透明質酸溶解于100mL水中，磁力攪拌，測定pH值為2.50。取100ml超純水于燒杯中，調節到相同的pH值，標為洗液2。將經過預處理以后的基材加入,負載慶大霉素的蒙脫土溶液中浸泡6~8min,取出，放入洗液1中清洗2-3min，取出，用N2吹干。再將其放入透明質酸溶液中浸泡6~8min，取出，放入洗液2中清洗2-3min，取出，用N2吹干。至此完成一個雙層膜的制備。分別制備6、9、12、15雙層。
斷面場發射掃描電鏡測試涂層的厚度為3.34±0.48μm。靜態接觸角研究發現涂膜后親水性顯著增加。原子力顯微鏡觀察形貌發現表面具有很低的粗糙度，RMS為3.27±0.32 nm。利用透射電鏡觀察涂層表面，結果顯示膜層表面較均勻，涂層對大腸桿菌的有抑菌效果，產生抑菌環，均能在30min內殺滅90%的濃度為104 CFU/mL的金黃色葡萄球菌。搖瓶培養和稀釋涂平板法測試膜層的殺菌性能，結果顯示該膜層能在24 h殺死92%的大腸桿菌和100%的金黃色葡萄球菌。涂層對成纖維細胞和人晶狀體上皮細胞毒性較低，細胞活性超過TCPS的89%，因此具有良好的細胞相容性。
實施例3：
配制1mg/mL的負載慶大霉素的蒙脫土溶于100mL水中，磁力攪拌，測定pH值為2.5。取100ml超純水于燒杯中，調節到相同的pH值，標為洗液1。配制1mg/mL的透明質酸溶解于100mL水中，磁力攪拌，測定pH值為2.50。取100ml超純水于燒杯中，調節到相同的pH值，標為洗液2。將經過預處理以后的基材加入,負載慶大霉素的蒙脫土溶液中浸泡6~8min,取出，放入洗液1中清洗2-3min，取出，用N2吹干。再將其放入透明質酸溶液中浸泡6~8min，取出，放入洗液2中清洗2-3min，取出，用N2吹干。至此完成一個雙層膜的制備。分別制備6、9、12、15雙層。
以80u單位透明質酸酶加入磷酸緩釋液中，慶大霉素藥物的釋放效果比僅在磷酸緩釋液的緩釋效果好。在一定溫度下，以10^4的大腸桿菌加入磷酸緩釋液中，慶大霉素藥物的釋放效果比僅在磷酸緩釋液的緩釋效果好。透明質酸和大腸桿菌增加慶大霉素等抗菌藥物的釋放，具有透明質酸和大腸桿菌的向影響，獲得一種有機-無機雜化可控釋放抗菌藥物的聚合物多層膜涂層。搖瓶培養和稀釋涂平板法測試膜層的殺菌性能，結果顯示該膜層能在10min殺死100%的大腸桿菌和100%的金黃色葡萄球菌。采用MTT和FDA實驗結果發現對人臍靜脈內皮細胞細胞毒性較低，細胞活性超過TCPS的92%，因此具有良好的細胞相容性。
實施例4：
PET片經刀片裁剪成1.5×2.5cm2大小，作為基材使用，用水超聲清洗，N2吹干。用鑷子夾住清洗過的PET先在5mg/ml的PEI中處理30min，在5mg/ml的PEI中處理30min，然后浸入蒙脫土中6-8分鐘，使表面的液體均勻覆蓋，至于pH相同的洗液中1-2分鐘，放入透明質酸溶液6-8分鐘，至于pH相同的洗液中1-2分鐘，得到的復合材料，用N2吹干。至此完成一個雙層膜的制備。分別制備6、9、12、15雙層。
透射電鏡結果表明：結果顯示膜層表面較均勻，膜層表面很低的粗糙度；靜態接觸角測試膜層顯示出一定的親水性；原子力顯微鏡觀察形貌發現表面具有很低的粗糙度。涂層對大腸桿菌的有抑菌效果，產生抑菌環，搖瓶培養和稀釋涂平板法測試膜層的殺菌性能，結果顯示該膜層能在10min殺死100%的大腸桿菌和100%的金黃色葡萄球菌。抗細菌黏附實驗發現和響應涂層相比，降低了100%的大腸桿菌黏附和98%的金黃色葡萄球菌的黏附。通過細菌死活染色觀察到在涂層表面，99.9%以上的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌被殺死（紅色），因此可以看出涂層具有高效的殺菌作用。用MTT和FDA實驗結果發現對人臍靜脈內皮細胞細胞毒性較低，細胞活性超過TCPS的82%，因此具有良好的細胞相容性。涂層對成纖維細胞和人晶狀體上皮細胞毒性較低，細胞活性超過TCPS的89%，因此具有良好的細胞相容性。
以上所述僅是本發明的優選實施方式，本發明的保護范圍并不僅局限于上述實施例，凡屬于本發明思路下的技術方案均屬于本發明的保護范圍。應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理前提下的若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。