特異性靶向的磁共振?光學雙模成像探針及其制備方法與流程

本發明屬于納米材料加工應用技術領域，更具體地涉及一種特異性靶向的磁共振-光學雙模成像探針及其制備方法。

背景技術：

目前臨床上常用的診斷肝癌的影像手段主要有多層螺旋CT(MDCT)、磁共振成像(MRI)、正電子發射計算機斷層顯像(PET-CT)成像和超聲(US)等，它們各有優劣勢。PET-CT成本高、普及面窄；US成像深度不足；CT成像較為快捷、相對便宜和無深度限制，但它的軟組織分辨率不高且有電離輻射的風險；MRI相對于CT的優勢在于它良好的軟組織分辨率和無電離輻射，對于微小腫瘤的辨別能力電優于CT。MRI是臨床上術前診斷肝癌的較為理想的影像手段，但是它無法術中實時導航手術。熒光成像是近年新興的成像手段，有可能給腫瘤外科帶來突破性進展，它的優點是成本低，方便快捷，敏感性高，能夠實時導航外科手術，缺點是組織穿透深度不夠。事實上，不論是MRI和CT，還是熒光和PET成像，單一模態都各有優劣，無法全面精準獲取腫瘤診斷信息。為了能夠同時獲取診治腫瘤的整體與局部影像信息，實現術前與術中診療一體化，兩種或兩種以上成像模態結合即多模成像因其能整合各成像模態的優勢正成為科學家們研究的熱點，也是未來的發展方向。據文獻報道，近年來在探索惡性腫瘤精準診療時發現，關鍵環節是成像靶點的選擇和高效特異性分子探針的合成。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種特異性靶向的磁共振-光學雙模成像探針及其制備方法，以期至少解決上述現有技術中存在的問題之一。

根據本發明的一方面，提供一種特異性靶向的磁共振-光學雙模成像納米探針，單位納米探針包括：

脂質體包覆納米四氧化三鐵形成的第一結構；

第一結構負載ICG后形成的第二結構；

第二結構由聚乙二醇修飾后與RGD靶點鏈接形成的終態結構。

根據本發明的另一方面，提供一種特異性靶向的磁共振-光學雙模成像納米探針的制備方法，包括：

步驟一：制備羧化的四氧化三鐵納米粒子；

步驟二：制備空白脂質體；

步驟三：將羧化的四氧化三鐵納米粒子加熱至脂質體的相變溫度，與空白脂質體混合，得到磁性脂質體溶液；

步驟四：利用聚乙二醇溶液修飾磁性脂質體溶液，加入靶點RGD，形成混合溶液；

步驟五：在步驟四的混合溶液中加入ICG溶液。

進一步的，步驟一中，制備羧化的四氧化三鐵納米粒子包括：在N₂保護環境下，利用FeSO₄·7H₂O和FeCL₃·6H₂O為原料，采用氧化沉淀法在溶液中合成油酸化的四氧化三鐵，采用DMSA取代油酸合成水溶性的羧化四氧化三鐵納米粒子。

進一步的，所述FeSO₄·7H₂O和FeCL₃·6H₂O的摩爾比為1∶2，氧化沉淀法的溫度為120～150℃。

進一步的，步驟二中，制備空白脂質體包括：利用膽固醇和卵磷脂為原料，采用真空旋轉蒸發的方法，得到布滿一容器底部的空白脂質體。

進一步的，所述真空旋轉蒸發的旋轉速度為40～60轉/分鐘、蒸發溫度40～60℃。

進一步的，步驟三和步驟四之間還具有中間步驟：將磁性脂質體溶液經脂質體擠壓器擠壓后，利用光譜分析法測量磁性脂質體內四氧化三鐵的濃度，離心濃縮后要求設定濃度以上。

進一步的，步驟四具體包括：利用聚乙二醇DSPE-PEG-NH₂溶液修飾磁性脂質體溶液中，加入靶點RGD，利用RGD與NH₂之間的共價耦合作用將其緊密連接。

進一步的，步驟五中，所述聚乙二醇溶液的用量為每mg磁性脂質體納米粒子加入1mL聚乙二醇溶液中。

進一步的，，步驟五具體包括：在步驟四的混合溶液中加入ICG溶液0.5-3mg/mL，被動吸附后，旋轉離心，除去游離的ICG分子。

通過上述技術方案，本發明的成像探針及其制備方法至少具有下述有益效果之一：

1、本發明所涉及的制備方法簡便容易操作，納米粒子具有粒徑小，穩定性好，生物相容性好，單分散性良好等優點；

2、本發明所制備的雙模成像納米粒子具有穩定的磁性和熒光特性、具有良好的主動靶向性；

3、本發明所用原材料ICG是經美國FDA(食品藥品監督管理局)官方認證可直接適用于人體的近紅外染料。SPIO經美國FDA官方認證已作為T2(加權成像)造影劑應用于臨床實踐。Liposome合成的原料主要為卵磷脂和膽固醇，生物相容性好。RGD是一種生物多肽，原料安全系數高；在探針合成過程中，無有毒、腐蝕性制劑的添加；綜上所述，新合成的特異性靶向的MRI-光學雙模探針SPIO@Liposome-ICG-RGD具有良好的生物相容性和廣闊的臨床轉化前景；

4.影像診斷是臨床上輔助腫瘤患者手術治療的最重要的手段，本發明特異性靶向的MRI-光學雙模成像探針具有雙重應用功能。。

附圖說明

圖1為根據本發明的具體實施方式的一種磁共振-光學雙模成像探針的制備方法流程圖；

圖2A-2C為實施例2靶向肝臟腫瘤的一種磁共振-光學雙模成像探針(SPIO@Liposome-ICG-RGD)在裸鼠體內的熒光信號檢測圖的患有皮下肝癌裸鼠圖、雙模成像納米探針的近紅外熒光信號峰與裸鼠本身的背景信號峰分離圖、以及以及探針注入后成像圖；

圖3A-3C分別為實施例2的無靶向功能的磁共振-光學雙模成像納米探針(SPIO@Liposome-ICG)制劑在裸鼠體內的熒光信號檢測圖中的患有皮下肝癌裸鼠圖、雙模成像納米探針的近紅外熒光信號峰與裸鼠本身的背景信號峰分離圖、以及探針注入后成像圖；

圖4A-4D分別為實施例3的靶向腫瘤的SPIO@Liposome-ICG-RGD納米探針結合1T的小動物核磁共振和近紅外熒光手術導航儀，術者在為皮下肝癌裸鼠完成熒光導航手術的探針注入前的MRI成像圖、探針注入后的MRI成像圖、探針熒光導航發現微小病灶殘留圖、和熒光導航下根治手術圖。

具體實施方式

本發明實施例的一方面提供一種特異性靶向的磁共振-光學雙模成像納米探針，其中單位納米探針包括：

脂質體包覆納米四氧化三鐵形成的第一結構(參見圖1中A所示)；

第一結構負載ICG(吲哚菁綠，Indocyanine Green)后形成的第二結構。(參見圖1中B所示)；

第二結構由聚乙二醇修飾后與RGD靶點鏈接形成的終態結構(參見圖1中C所示)。

第一結構中包含有脂質體和納米四氧化三鐵，其中，超順磁性的納米氧化鐵(SPIO)因其高靈敏性核磁信號，無毒性及良好的生物相容性在MRI的T2成像中得到了良好的應用。脂質體Liposome合成的原料主要為卵磷脂和膽固醇，生物相容性好。

第一結構負載ICG后形成的第二結構。ICG是經美國FDA認證的可直接用于人體的近紅外熒光染料，激發波長805nm，發射835nm，能夠很好的排除自身熒光的干擾，常被用來熒光成像，且ICG與脂質體(liposome)結合后熒光量子產率增加。

第二結構由聚乙二醇修飾后與RGD靶點鏈接形成的終態結構。由于整合素αvβ3受體在正常肝細胞中陰性表達，在Hep-G2肝癌細胞中是高表達。環狀RGD多肽是一種含有精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸序列的小肽，可以特異性識別整合素αvβ3受體。

所以，該實施例提供的特異性靶向的磁共振-光學雙模探針SPIO@Liposome-ICG-RGD具有良好的生物相容性和顯影性。

本發明實施例的另一方面還提供一種特異性靶向的磁共振-光學雙模成像納米探針的制備方法，包括：

步驟一：制備羧化的四氧化三鐵納米粒子；

步驟二：制備空白脂質體；

步驟三：將羧化的四氧化三鐵納米粒子加熱至脂質體的相變溫度，與空白脂質體混合，得到磁性脂質體溶液；

步驟四：利用聚乙二醇溶液修飾磁性脂質體溶液，加入靶點RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽，Arg-Gly-Asp(RGD)sequence)，形成混合溶液；

步驟五：最后在步驟四的混合溶液中加入ICG溶液，。

優選的，制備羧化的四氧化三鐵納米粒子包括：在N₂保護環境下，利用FeSO4·7H₂O和FeCL3·6H₂O為原料，采用氧化沉淀法在溶液中合成油酸化的四氧化三鐵，采用DMSA(二巰丁二酸，dimercaptosuccinic acid)取代油酸合成水溶性的羧化四氧化三鐵納米粒子。

進一步優選的，所述FeSO₄·7H₂O和FeCL₃·6H₂O的摩爾比為1∶2，氧化沉淀法的溫度為120～150℃。

優選的，步驟二中，制備空白脂質體包括：利用膽固醇和卵磷脂為原料，采用真空旋轉蒸發的方法，得到布滿一容器底部的空白脂質體。

進一步優選的，所述真空旋轉蒸發的旋轉速度為40-60轉/分鐘、蒸發溫度40-60℃。

優選的，步驟三和步驟四之間還具有中間步驟：

將磁性脂質體溶液經脂質體擠壓器擠壓后，利用光譜分析法測量磁性脂質體內四氧化三鐵的濃度，離心濃縮后要求設定濃度(例如1mg/mL)以上。

優選的，步驟四具體包括：利用聚乙二醇DSPE-PEG-NH₂(WM3500)溶液修飾磁性脂質體溶液中，加入靶點RGD，利用RGD與NH₂之間的共價耦合作用將其緊密連接。

優選的，步驟五中，所述聚乙二醇溶液的用量為每mg磁性脂質體納米粒子加入1mL聚乙二醇溶液中。

優選的，在步驟四的混合溶液中加入ICG溶液0.5-3mg/mL，被動吸附后，旋轉離心，除去游離的ICG分子。

為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚明白，以下結合具體實施例，并參照附圖，對本發明作進一步的詳細說明。

實施例1

請參考圖1，為本發明靶向腫瘤的一種特異性靶向的MRI-光學雙模成像探針的制備方法流程圖，具體地，其步驟如下：

步驟1：在N₂保護環境下，利用FeSO₄·7H₂O和FeCL₃為原料，采用氧化沉淀法在135℃溶液中合成油酸化的四氧化三鐵，采用DMSA取代油酸合成水溶性的羧化四氧化三鐵納米粒子；配制濃度為2mg/mL，備用；

步驟2：利用膽固醇和卵磷脂為原料，采用真空旋轉蒸發的方法(轉速：40轉/分鐘、溫度：40℃)，得到布滿圓底燒瓶底部的空白脂質體；

步驟3：將羧化的四氧化三鐵納米粒子加熱至脂質體的相變溫度(約60℃)，加入空白脂質體的圓底燒瓶內，水化脂質體，得到磁性脂質體溶液；

步驟4：將磁性脂質體溶液經1ml容量的脂質體擠壓器擠壓后，利用光譜分析法測量磁性脂質體內四氧化三鐵的濃度，離心濃縮后要求達到1mg/mL；

步驟5：利用聚乙二醇DSPE-PEG5000-NH₂溶液修飾磁性脂質體溶液中，加入靶點RGD，利用RGD與NH2之間的共價耦合作用將其緊密連接；

步驟6：最后在步驟5的混合溶液中加入ICG溶液，被動吸附后，旋轉離心(轉速)，除去游離的ICG分子。

實施例2

將實施例1制備得到的特異性靶向的MRI-光學雙模成像納米探針，用10Kd的超濾管將上述溶液進行超濾，然后用超純水洗滌3次，然后用PBS液稀釋得到濃度為1mg/mL近紅外主動靶向探針制劑。此納米制劑中的納米顆粒的平均粒徑為150納米。

將濃度為1mg/mL的上述近紅外雙模成像探針熒光納米探針制劑注射入患有皮下肝癌裸鼠體內(參見圖2A所示)進行核磁和熒光檢測，檢測結果如圖2B和圖2C所示。從圖2B中可以看出，該雙模成像納米探針的近紅外熒光信號峰與裸鼠本身的背景信號峰分離的很好，腫瘤區域和腫瘤周圍正常組織的對比度達到近3倍，這樣背景干擾就小，可以給術者提供清晰的腫瘤位置和精確的腫瘤邊界，調腫瘤的檢測率、切除率。從右圖中可以看出，該探針注入后，腫瘤區域明顯變暗，說明核磁T2相成像效果好，有助于術前診斷

將濃度為1mg/mL的上述不帶靶點的近紅外雙模成像探針熒光納米探針制劑注射入患有皮下肝癌裸鼠體(參見圖3A所示)內進行核磁和熒光檢測，檢測結果如圖3所示。從圖3B中可以看出，該雙模成像納米探針的近紅外熒光信號峰與裸鼠本身的的背景信號峰依舊有區別，但不及帶靶點RGD的探針組，腫瘤區域和腫瘤周圍正常組織的對比度達到才1倍，這樣背景干擾大，導航手術效果差。從圖3C中可以看出，該探針注入后，腫瘤區域明顯變暗不明顯。

實施例3

將上述實施例2中得到的濃度為1mg/mL的雙模成像納米探針制劑注射入患有原位肝癌裸鼠體內進行診療一體化研究，并在MRI和近紅外熒光手術導航儀輔助下，術者完成實時術前診斷和術中熒光導航手術切除腫瘤，在術前診斷評估，通過術前MRI掃描獲取腫瘤的宏觀信息，主要包括腫瘤的部位、大小、數目，腫瘤與肝臟內血管、膽管的關系，明確腫瘤的分期，制定適合該患者的個體化治療方案；在術中實時導航，通過術中熒光成像，能夠探查出肉眼不能確定和不能識別的微小殘余病灶，血管浸潤病灶，增加手術的徹底性，減少復發概率，改善患者的預后。該探針的研發有望整合術前成像和術中導航，實現肝癌患者的診療一體化。手術實施過程如圖4A-4D所示(其中，圖4A為MRI成像前，圖4B為MRI成像后，圖4C為探針熒光導航發現微小病灶殘留；圖4D為熒光導航下根治手術)，在主動靶向雙模成像探針、MRI和熒光手術導航儀的輔助下，術者術前可以精準明確腫瘤的大小和位置，術中熒光可以輔助精確的定位腫瘤邊界，并參考客觀的熒光腫瘤邊界進行腫瘤的完全切除，即使是對于亞毫米的殘余病灶，術者依靠近紅外熒光信號，同樣的能夠進行精準的手術切除，減少手術殘癌率和手術切緣陽性率，整體上實現了診療一體化的效果。

以上所述的具體實施例，對本發明的目的、技術方案和有益效果進行了進一步詳細說明，應理解的是，以上所述僅為本發明的具體實施例而已，并不用于限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所做的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。