本發明屬于藥物控釋技術領域，更具體說涉及一種可以提高細胞內吞和細胞核靶向的聚合物納米載體,還涉及運用該載體材料制備的聚合物載藥納米顆粒的制備方法。
背景技術：
癌癥是在世界范圍內具有很高的發病率和致死率，化學療法是目前治療癌癥的最主要手段。抗癌藥物的毒副作用嚴重限制了其臨床應用。為了克服這個障礙，很多研究人員常常采用納米顆粒如脂質體，聚合物膠束等作為藥物載體。這一應用的主要根據是，聚合物膠束通過細胞內吞作用攜載抗癌藥物進入細胞，避免大量藥物分子分散在體循環中，被正常組織吸收，產生系統毒性。載藥納米顆粒可以選擇性進入腫瘤組織，進入腫瘤細胞后釋放藥物，大大提高了治療作用，并明顯減小了毒副作用。
然而，聚合物膠束在腫瘤治療的應用上還存在很多的挑戰，期望能到達腫瘤部位后能大量被腫瘤細胞吞噬。并且由于多種抗癌藥物如阿霉素、羥基喜樹堿、順鉑，其機理均在破壞DNA、拓撲異構酶等遺傳生物大分子，將藥物輸送至細胞核也是殺滅腫瘤細胞的關鍵。因此，制備出能在腫瘤弱酸性環境下提高細胞內吞作用和靶向于細胞核的聚合物納米顆粒，是目前癌癥治療研究的熱點。
與正常體細胞相比，腫瘤細胞表面會高表達一些特定受體，如過表達葉酸受體或整合素受體。然而，隨著腫瘤細胞的種類不同，所過表達的受體也不相同。一種配體修飾的藥物載體只能針對治療某一類腫瘤，而無法攻克多種癌癥，大大限制了其臨床應用。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種可提高細胞內吞和細胞核靶向的聚合物納米載體。使獲得的納米載體既能保證在體循環中的穩定性，又能響應腫瘤組織弱酸性環境，從而大大提高腫瘤細胞對載藥納米顆粒的攝取和納米顆粒的核靶向功能。
本發明的另一個目的是提供一種聚合物納米載體的制備方法。
本發明的該載體疏水鏈段是聚酯類，親水鏈段是以酰胺鍵連接了靶向多肽的聚乙二醇，靶向多肽與小分子基團以具有腫瘤弱酸性環境下響應的特殊酰胺鍵連接，形成功能化的共聚物，在水中通過自組裝形成攜載藥物的納米顆粒。
本發明的提高細胞內吞和細胞核靶向的聚合物納米載體的制備方法：主要包含以下步驟：
1)將N,N'-羰基二咪唑和聚乙二醇分別溶于干燥的二氯甲烷，把N,N'-羰基二咪唑的二氯甲烷溶液逐滴加入聚乙二醇的二氯甲烷溶液中，在氮氣保護下于室溫反應6小時,經蒸發、濃縮、沉淀，抽濾、真空干燥得到N,N'-羰基二咪唑活化的聚乙二醇；
2)將步驟1)的N,N'-羰基二咪唑活化的聚乙二醇和疏水端單體放在干燥圓底燒瓶內，以辛酸亞錫為催化劑，抽真空6小時后，在140℃下反應6小時，經處理后，得到兩親性聚合物；
3)將步驟2)的兩親性聚合物溶于無水二氯甲烷中，逐滴加入適量1,2-乙二胺溶液，在25℃下進行過夜反應后，經蒸發、濃縮、沉淀，抽濾、真空干燥得到形成親水鏈段末端引入氨基的兩親性聚合物；
4)將核靶向多肽溶于二甲基亞砜，加入一定量的羥基琥珀亞酰胺和碳二亞胺，在室溫下進行半小時活化反應,隨后將步驟3)的產物溶于二甲基亞砜并加入上述溶液中，于25℃反應24小時,二甲基亞砜和未反應的反應物以透析法除去，透析液冷凍干燥得靶向兩親性嵌段共聚物；
5)將步驟4)制備的核靶向兩親性嵌段共聚物與屏蔽電荷的小分子化合物反應，室溫反應48小時，溶劑為二甲基亞砜。用去離子水透析三天，透析結束后冷凍干燥即靶向材料；
6)載藥納米顆粒的制備：將步驟5)中合成的靶向材料和抗癌藥物溶于四氫呋喃，在攪拌下逐滴加入適量的去離子水中，室溫攪拌待四氫呋喃揮發完全，即得載藥納米顆粒分散液。
本發明的聚合物納米載體的制備方法，其中所述的聚乙二醇分子量為2000，N,N'-羰基二咪唑與聚乙二醇的投料重量比為9:100。
本發明的聚合物納米載體的制備方法，其中所述的疏水端單體為己內酯或D,L-丙交酯，N,N'-羰基二咪唑活化的聚乙二醇與己內酯的投料重量比為69:100，與D,L-丙交酯的投料重量比為21:100。
本發明的聚合物納米載體的制備方法，其中所述的核靶向多肽為HIV-1反式轉錄激活因子。
本發明的聚合物納米載體的制備方法，其中屏蔽電荷的小分子化合物為二甲基馬來酸酐或琥珀酰氯。
本發明的聚合物納米載體的制備方法，其中步驟6)所述抗癌藥物為阿霉素、羥基喜樹堿或順鉑。
本發明的納米載體的制備方法制備的聚合物載藥納米顆粒粒徑在100～130納米。
本發明的聚合物納米載體：靶向材料的細胞膜穿透肽的引入使納米顆粒表面帶上正電荷，通過與細胞膜靜電吸引，使細胞大量攝取納米顆粒，更多的抗癌藥物分子能隨載體進入細胞。核靶向功能使載體靶向到細胞核。同時，為了避免正常組織非選擇性的內吞該納米顆粒，二甲基馬來酸酐或丁二酰氯修飾后的納米載體在生理條件下帶負電，到達腫瘤微環境下酸敏感小分子脫落，納米載體帶上正電，實現促進細胞內吞和細胞核靶向的功能。這樣，既保證了載藥納米顆粒在體循環中的安全性與穩定性，又能選擇性的富集在腫瘤組織，并被大量內吞發揮療效。此外，親疏水端材料均可生物降解，在提高腫瘤治療效果的同時，又減小藥物的毒副作用。
具體實施方式
以下通過實施例對本發明進行進一步的具體描述。有必要在此指出的是以下實施例只用于對本發明做進一步的說明，不能理解為對本發明保護范圍的限制，該領域技術熟練人員根據上述本發明內容對本發明做出一些非本質的改進和調整，仍屬于本發明的保護范圍。
實例1
1)、N,N'-羰基二咪唑活化的聚乙二醇的制備：稱取分子量為2000的聚乙二醇10克溶于100mL干燥二氯甲烷中，N,N'-羰基二咪唑(CDI)0.9克溶于3mL干燥二氯甲烷中，并用分液漏斗逐滴加入聚乙二醇的二氯甲烷溶液中，在氮氣保護下于25℃反應6小時。反應結束后，旋蒸除去二氯甲烷，剩余的濃縮液用250mL冰乙醚沉淀，抽濾、真空干燥即得N,N'-羰基二咪唑活化的聚乙二醇。
2)、兩親性共聚物的形成：取N,N'-羰基二咪唑活化的聚乙二醇9.5克己內酯單體13.7克以及0.137克辛酸亞錫置于150mL圓底燒瓶中，抽真空6小時候在150℃條件下反應6小時。待產物冷卻，則溶解于10mL二氯甲烷中，再用250mL冰乙醇沉淀，抽濾收集產物，真空干燥即得CDI活化的兩親性聚合物。
對于以上制備過程，疏水端單體可以是己內酯或D,L-丙交酯，所設計的兩親性聚合物分子量可以是9000到13000。
3)、兩親性共聚物的親水鏈段末端引入氨基：取兩親性聚合物粉末17克溶于50mL二氯甲烷中，由分液漏斗逐滴加入15mL乙二胺，氮氣保護下，25℃反應12小時。反應結束后，旋蒸除去未反應的乙二胺及二氯甲烷，所得濃縮液由250mL冰乙醇沉淀，抽濾、真空干燥即得末端引入氨基的兩親性聚合物。
4)、靶向材料：取HIV-1反式轉錄激活因子(Tat)50毫克、19毫克碳二亞胺(EDC)和3.6毫克羥基琥珀亞酰胺(NHS)溶于5mL二甲基亞砜中，在室溫下磁力攪拌30分鐘以活化Tat末端羧基。將0.2克末端有氨基修飾的兩親性聚合物溶于10mL二甲基亞砜中，以分液漏斗將Tat的二甲基亞砜溶液逐滴加入聚合物的二甲基亞砜溶液中，室溫下磁力攪拌24小時。反應結束后，以去離子水透析3天除去未反應的Tat、EDC和NHS。隨后冷凍干燥即得產物。
5)、稱取32毫克二甲基馬來酸酐和0.1克Tat修飾的聚合物溶于10mL二甲基亞砜中，在氮氣保護下，于25℃磁力攪拌48小時。反應結束后，以分去離子水透析3天除去二甲基亞砜和未反應的二甲基馬來酸酐，隨后冷凍干燥即得可響應腫瘤微環境，提高細胞內吞和細胞核靶向的納米載體材料。
6)、載藥納米顆粒的制備：取上述制備的靶向納米載體材料10毫克和阿霉素1毫克溶于5mL四氫呋喃中，并在磁力攪拌下逐滴加入15mL去離子水中，室溫繼續攪拌待四氫呋喃揮發完全即的載阿霉素納米顆粒，納米顆粒的粒徑為105.3納米。
實例2
本實例是將實例1中的二甲基馬來酸酐換為琥珀酰氯，取40毫克Tat修飾的聚合物分散在40mL pH 8.5的磷酸緩沖鹽溶液中，冷卻到0℃后攪拌一個小時，并向其中滴入20滴琥珀酰氯，繼續攪拌24小時。反應完成后以pH 7.4的磷酸緩沖鹽溶液透析三天，后冷凍干燥即得產物，其他方法同實例1。
實例3
本實例是將實例1中的抗癌藥物阿霉素換為羥基喜樹堿，其他方法同實例1，可以得到載羥基喜樹堿納米顆粒，粒徑112.4納米。
實例4
本實例是將實例1中的抗癌藥物阿霉素換為順鉑，其他方法同實例1，可以得到載紫杉醇納米顆粒，粒徑119.7納米。
實例5
本實例是將實例1中的己內酯換做D,L-丙交酯，投入的CDI活化的聚乙二醇與D,L-丙交酯的比例為21：100，其他實施方法同實例1，則可得到載阿霉素納米顆粒，粒徑為110.6納米。
實例6
本實例是將實例1中的己內酯換為D,L-丙交酯，投入的CDI活化的聚乙二醇與D,L-丙交酯的比例為21：100，抗癌藥物阿霉素換為羥基喜樹堿，其他方法同實例1，可以得到載羥基喜樹堿納米顆粒，粒徑為118.4納米。
實例7
本實例是將實例1中的己內酯換為D,L-丙交酯，投入的CDI活化的聚乙二醇與D,L-丙交酯的比例為21：100，抗癌藥物阿霉素換為順鉑，其他方法同實例1，可以得到載順鉑納米顆粒，粒徑為128.5納米。