本專利申請以于2015年1月30日提交到韓國專利廳的韓國專利申請第10-2015-0015524號為基礎主張優先權，上述專利申請的公開事項作為參照插入于本說明書中。
本發明涉及穩定性、用藥依從性及治療效果得到顯著改善的育發、養發或生發促進用組合物。
背景技術：
人的脫發周期大體上分為毛發生長初期(anagen)、毛發生長中期(catagen)及毛發生長靜止期(telogen)。毛發生長初期為隨著毛乳頭的活躍，細胞分裂旺盛，從而使毛發快速生長的時期。毛發生長初期的時間因毛的種類而異，但在頭發的情況下，毛發生長初期為3-6年左右。在毛發生長初期生長的毛發占全部毛發的80-90％，對于正處于脫發階段的人而言，其具有毛發生長初期縮短，且毛發生長靜止期長的毛發周期，因而在全部毛發中，在毛發生長初期生長的毛發的比重減少。毛發生長中期為生長初期結束之后毛發的生成逐漸變慢，最終停止細胞分裂及生長的時期，毛發生長中期為1-1.5個月左右，全部毛發的1％左右屬于這個階段。毛發生長靜止期為生長的最后階段，在此階段，毛囊和毛乳頭完全分離，并且毛囊萎縮、毛根進一步靠近上側，并發生脫發的階段。毛發生長靜止期持續3-4個月，全部毛發的4-14％屬于此階段。若在毛發生長靜止期結束之后毛乳頭的活動重新活躍，則產生新的毛發的毛乳頭，并擠出處于毛發生長靜止期的毛發，使其完全脫離到頭皮外。
眾所周知，脫發癥的主要原因與雄激素和類固醇激素有關，也有壓力嚴重干涉的有關報道，最近提出脫發的直接原因在于腎功能障礙的主張，但到目前為止，對于脫發癥的準確原因或發病機制，還存在很多的未知部分。
當前，用于治療脫發的制劑大體上分為藥品、準藥品及化妝品。需要有醫生的處方才能購買的處方藥有由美國默克(merck)公司開發并銷售的“保法止”，作為其主要成分的非那雄胺(finasteride)于1997年12月作為脫發治療劑得到美國食品藥品管理局(fda)的核準。非那雄胺作為抑制轉換為雙氫睪酮(dihydrotestosterone，dht)的5α-還原酶的藥劑，起到使軟毛生長為粗且長的毛發的作用。其在短期內對改善脫發具有效果，但據報道，存在陽痿、性功能減退、男性乳房腫大等副作用。米諾地爾(minoxidil)作為安全性和有效性得到認可，從而無需醫生處方也可購買的藥品，其于1997年12月作為最初的涂抹用脫發治療劑，得到美國食品藥品管理局的核準。上述藥品改善血液循環，并開放鉀通道，從而具有促進毛發生長的效果，但可能引起瘙癢、皮疹等局部反應，并可出現脈頻等。
褪黑激素為由大腦的松果腺生成、分泌的激素，由色氨酸(tryptophan)和血清素(serotonin)制成。褪黑激素作為內分泌調節劑，具有使毛發生長、調節著色或脫皮的功能，并且可調節毛發的周期，其作為脫氧核糖核酸(dna)恢復衍生物，促進毛發的生長。因此褪黑激素可成為可使以往脫發治療劑的多種副作用最小化的代替技術方案，但由于光穩定性顯著下降，并且溶解度相對低，因而在以外用劑形態實現產品化方面存在諸多困難。因此，要求開發出作為藥理成分來包含褪黑激素，改善保管穩定性，并且既具有優秀的服用便利性，又使藥物傳遞效率及藥物持續性得到優化的藥劑學組合物。
在本發明的整個說明書中，參照了多個論文及專利文獻，并示出對其的引用。被引用的論文及專利文獻的全部公開內容作為參照插入于本說明書中，從而對本發明所屬技術領域的水平及本發明的內容進行進一步明確說明。
技術實現要素：
技術問題
本發明人為了開發出副作用比以往的脫發治療劑少，并具有優秀的保管穩定性及給藥便利性的育發、養發或生發促進用組合物而進行了深入研究及努力。最終發現，在以規定含量包含褪黑激素、d-泛醇、生物素及煙酰胺的情況下，可使作為藥理成分的褪黑激素的光穩定性得到改善，提高制劑性狀的透明度，并且不僅使藥物吸收，尤其使硬皮滲透吸收極大化，而且在長期保管時，使因紫外線而發生的化學、物理變化最小化，從而可顯著改善制劑的穩定性，由此完成了本發明。
因此，本發明的目的在于提供育發、養發或生發促進用藥劑學組合物。
本發明的另一目的在于提供促進育發、養發或生發的方法。
本發明的其他目的及優點可通過以下具體實施方式、發明要求保護范圍及附圖來得以明確。
解決問題的方案
根據本發明的一實施方式，本發明提供包含褪黑激素、d-泛醇、生物素及煙酰胺作為有效成分的育發、養發或生發促進用組合物。
本發明人為了開發出副作用比以往的脫發治療劑少，并具有優秀的保管穩定性及給藥便利性的育發、養發或生發促進用組合物而進行了深入研究及努力。最終發現，在以規定含量包含褪黑激素、d-泛醇、生物素及煙酰胺的情況下，可使作為藥理成分的褪黑激素的光穩定性得到改善，提高制劑性狀的透明度，不僅使藥物吸收，尤其使硬皮滲透吸收極大化，而且在長期保管時，使因紫外線而發生的化學、物理變化最小化。并且，在以規定含量包含褪黑激素、d-泛醇、生物素及煙酰胺的情況下，使抗氧化效果極大化，從而可預防發炎，并可呈現出抗炎效果。
在本說明書中，術語“促進育發”、“促進養發”及“促進生發”表示通過促進毛發的生成及生長，從而最終在全部毛發中增加毛發生長初期毛發的比重。因此，上述術語表示在毛發生長初期抑制因毛發的比重減少而引發的脫發，因而與“改善脫發”、“預防脫發”及“治療脫發”具有相同的含義。
根據本發明的具體實例，相對于本發明的組合物總量，包含0.001-1.0重量百分比的本發明用褪黑激素(melatonin)。更加具體地，包含0.005-0.5重量百分比，進一步具體地，包含0.01-0.3重量百分比，最為具體地，包含0.05-0.2重量百分比。
根據本發明的具體實例，相對于本發明的組合物總量，包含0.01-0.5重量百分比的本發明用d-泛醇(dexpanthenol)。更加具體地，包含0.02-0.4重量百分比，進一步具體地，包含0.05-0.3重量百分比，最為具體地，包含0.1-0.2重量百分比。
根據本發明的具體實例，相對于本發明的組合物總量，包含0.001-0.05重量百分比的本發明用生物素(biotin)。更加具體地，包含0.002-0.04重量百分比，進一步具體地，包含0.005-0.03重量百分比，最為具體地，包含0.01-0.02重量百分比。
根據本發明的具體實例，相對于本發明的組合物總量，包含0.006-0.3重量百分比的本發明用煙酰胺(nicotinamide)。更加具體地，包含0.012-0.24重量百分比，進一步具體地，包含0.03-0.18重量百分比，最為具體地，包含0.06-0.12重量百分比。
根據本發明的具體實例，本發明的組合物還包含光穩定劑。
在本說明書中，術語“光穩定劑(lightstabilizer)”表示阻斷制劑在加工、保管及流通過程中因暴露于太陽光下而造成有效成分被劣化、分解、氧化或變色，從而在原來的功效和性狀發生變化的現象。本發明的光穩定化將通過自由基的捕獲、氫過氧化物的分解、重金屬的捕獲、單線態氧淬滅來實現的穩定化均包括在內，但并不局限于此，包括用于阻斷或緩解因暴露于可見光及紫外線而可能發生的物理、化學變化的全部機制。
作為用于本發明的光穩定劑，例如，可舉出三唑類、二苯甲酮類、受阻胺光穩定劑(hinderedaminelightstabilizer，hals)、受阻酚光穩定劑(hinderedphenollightstabilizer)、al-mg(鋁-鎂)類穩定劑，但并不局限于此。
根據本發明的具體實例，用于本發明的光穩定劑為二苯甲酮。更加具體地，相對于本發明的組合物總量，包含0.008-0.5重量百分比的上述二苯甲酮，進一步具體地，包含0.04-0.3重量百分比，最為具體地，包含0.08-0.2重量百分比。
根據本發明的具體實例，本發明的組合物還包含制劑用穩定劑。作為制劑用穩定劑，例如，可舉出對羥基苯甲酸酯(parahydroxybenzoicacidester)衍生物、吡咯烷酮(pyrrolidinone)衍生物、乙醇、苯酚衍生物、硫柳汞(thimerosal)、乙酸酐、羧酸鈉、月桂基硫酸鈉(laurylsulfate)、硫化物、亞硫酸鹽(sulfite)、抗壞血酸、視黃醇(retinol)、生育酚(tocopherol)、丁基羥基茴香醚(butylhydroxylanisole)，但并不局限于此。
根據本發明的具體實例，用于本發明的制劑用穩定劑為甲基-2-吡咯烷酮(methyl-2-pyrrolidinone)。更加具體地，相對于本發明的組合物總量，包含0.05-2.0重量百分比的上述甲基-2-吡咯烷酮，進一步具體地，包含0.1-1.5重量百分比，最為具體地，包含0.5-1.0重量百分比。
在本發明的組合物由藥劑學組合物制備的情況下，本發明的藥劑學組合物除了上述有效成分之外，還可包含藥劑學上允許的載體。
包含于本發明的藥劑學組合物的藥劑學上允許的載體通常利用于制劑的情況，包含乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、藻酸鹽、明膠、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、糖漿、甲基纖維素、羥基苯甲酸甲酯、丙基羥苯酸酯、滑石、硬脂酸鎂及礦物油等，但并不局限于此。本發明的藥劑學組合物除上述多種成分之外，還可包含潤滑劑、潤濕劑、甜味劑、香味劑、乳化劑、懸浮劑、保鮮劑等。適當的藥劑學上允許的載體及制劑詳細記載于雷明頓藥物科學(remington’spharmaceuticalsciences)(19thed.，1995)。
本發明的藥劑學組合物的適當給藥量可根據制劑化方法、給藥方式、患者的年齡、體重、性別、病態、食物、給藥時間、給藥途徑、排泄速度及反應靈敏性等多種因素以多種方式開處方。本發明的藥劑學組合物的優選給藥量范圍以成人基準，在0.001-100mg/kg范圍之內。
本發明的藥劑學組合物能夠以口服或非口服的方式給藥，在以非口服的方式給藥的情況下，能夠以涂敷于皮膚的局部、皮下注射、硬皮給藥等方式進行給藥。考慮到適用本發明的藥劑學組合物的目的在于促進育發、養發或生發，優選地，通過涂敷于頭皮的局部或硬皮給藥的方式進行給藥。
根據可使本發明所屬技術領域的普通技術人員容易實施的方法，本發明的藥劑學組合物通過利用藥劑學上允許的載體和/或賦形劑來進行制劑化，從而以單位容量形態制備或以內入于多容量容器內的形態制備。在此情況下，劑型還可具有油或水性介質中的溶液、懸浮液、糖漿劑、乳化液或爽膚水、乳液、面霜及洗發水等形態或浸膏劑、散劑、粉劑、顆粒劑、片劑或膠囊劑形態，并且還可包含分散劑或穩定劑。
根據本發明的一具體例，本發明的藥劑學組合物為皮膚外用組合物。上述皮膚外用組合物的劑型不受特殊限制，但優選為粉、凝膠、軟膏、面霜、液體或氣溶膠劑型。
在本發明中所記載的作為皮膚外用劑型的凝膠，可使用選自卡波姆(carbomer)、聚乙二醇(polyethyleneglycol)、聚丙二醇(polypropyleneglycol)、聚丙烯酸(polyacrylicacid)、羧甲基纖維素(carboxymethylcellulose)、羥甲基纖維素(hydroxymethylcellulose)、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)、明膠(gelatine)、海藻酸鹽(alginatesalt)、甲殼素(chitin)或殼聚糖(chitosan)衍生物、透明質酸(hyaluronicacid)、膠原蛋白(collagen)中的一種或兩種以上，但并不局限于此。
如上所述，本發明的組合物可用作具有局部涂敷于頭皮的形態的皮膚外用組合物。
本發明的藥劑學組合物可用于包括人類在內的所有動物的育發、養發或促進生發，其對象(subject)并不局限于人類。
根據本發明的一實例，本發明為化妝品組合物。
本發明的抗氧化用組合物能夠以育發、養發或生發促進用化妝品組合物的形態制備。本發明的化妝品組合物可制備成在本發明所屬技術領域中通常制備的任何劑型，例如，可制備成溶液、懸浮液、乳濁液、糊劑、凝膠、面霜、乳液、粉、肥皂、含表面活性劑的潔面劑、油、粉底、乳濁液粉底、粉底蠟及噴劑等劑型，但并不局限于此。更加詳細地，可制備成柔膚化妝水、營養化妝水、乳液、營養面霜、按摩面霜、精華素、潔面霜、潔面泡沫、潔面水、面膜、噴劑或粉劑型。
在本發明的劑型為糊劑、面霜、乳液或凝膠的情況下，作為載體成分，可利用動物油、植物油、蠟、石蠟、淀粉、黃蓍膠、纖維素衍生物、聚乙二醇、硅、膨潤土、二氧化硅、滑石或氧化鋅等。
在本發明的劑型為粉或噴劑的情況下，作為載體成分，可利用乳糖、滑石、二氧化硅、氫氧化鋁、硅酸鈣或聚酰胺粉末，尤其，在噴劑的情況下，還可包含氯氟烴、丙烷/丁烷或二甲醚等推進劑。
在本發明的劑型為溶液或乳濁液的情況下，作為載體成分，可利用溶劑、增溶劑或乳化劑，例如，可舉出水、乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、芐醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、1，3-丁基乙二醇油、甘油脂肪酯、聚乙二醇或山梨糖醇酐脂肪酸酯。
在本發明的劑型為懸浮液的情況下，作為載體成分，可利用水、乙醇或丙二醇等液相稀釋劑、乙氧基化異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇酯及聚氧乙烯山梨糖醇酐酯等懸浮劑、微晶纖維素、甲基氫氧化鋁、膨潤土、瓊脂或黃蓍膠等。
在本發明的劑型為含表面活性劑的潔面劑的情況下，作為載體成分，可利用脂肪醇硫酸鹽、脂肪醇醚硫酸鹽、磺基琥珀酸單酯、羥乙基磺酸鹽、咪唑啉衍生物、甲基牛磺酸鹽、肌氨酸鹽、脂肪酸酰胺醚硫酸鹽、烷基酰胺甜菜堿、脂肪醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、羊毛脂衍生物或乙氧基化甘油脂肪酸酯等。
本發明的化妝品組合物除了包含有效成分和載體成分之外，還包含通常利用于化妝品組合物的多種成分，例如，可包含抗氧化劑、穩定劑、增溶劑、維生素、顏料及香料等通常的助劑。
在本發明的一實例中，本發明為功能性食品組合物。本發明的功能性食品組合物包含在制造食品時通常添加的成分，例如，包含蛋白質、碳水化合物、脂肪、營養素及調味劑。例如，在制備成清涼劑的情況下，除了有效成分之外，還可包含香味劑或天然碳水化合物。例如，天然碳水化合物包含單糖(例如，葡萄糖、左旋糖等)；二糖(例如，麥芽糖、蔗糖等)；寡糖；多糖(例如，糊精、環糊精等)；及糖醇(例如，木糖醇、山梨糖醇、赤蘚醇等)。
作為香味劑，可利用天然香味劑(例如，索馬甜、甜菊提取物等)及合成香味劑(例如，糖精、阿斯巴甜等)。
根據本發明的再一實施方式，本發明提供包含0.001-1.0重量百分比的褪黑激素、0.01-0.5重量百分比的d-泛醇、0.001-0.05重量百分比的生物素及0.006-0.3重量百分比的煙酰胺作為有效成分的育發、養發或生發促進用藥劑學組合物。
對于與育發、養發或生發促進用組合物有關的本實施方式，在上述已經說明的與育發、養發或生發促進用組合物有關的另一實施方式中明確限定了有效成分的含量，因而引用在上述發明的詳細說明中就針對上述另一實施方式記載的所有內容，為了避免本說明書的記載過于復雜，將省略重復的內容。
根據本發明的另一實施方式，本發明提供包含褪黑激素、d-泛醇、生物素及煙酰胺作為有效成分的脫發的預防或治療用組合物。在本說明書中，術語“預防脫發”表示通過增加毛發生長初期的毛發比重，從而預防因毛發生長初期毛發的比重減少而引發的脫發，在本說明書中，術語“治療脫發”表示隨著上述毛發生長初期毛發的比重增加，延緩脫發的進行或抑制脫發癥狀，最終減少處于毛發脫落狀態的頭皮的面積。
本發明的一實施方式引入上述就針對作為本發明另一實施方式的育發、養發或生發促進用組合物說明的內容，為了避免本說明書的記載過于復雜，將省略重復的內容。
本發明的還有一實施方式提供包含0.001-1.0重量百分比的褪黑激素、0.01-0.5重量百分比的d-泛醇、0.001-0.05重量百分比的生物素及0.006-0.3重量百分比的煙酰胺作為有效成分的脫發的預防或治療用藥劑學組合物。
對于與脫發的預防或治療用組合物有關的本實施方式，在上述已經說明的與脫發的預防或治療用組合物有關的還有一實施方式中明確限定了有效成分的含量，因而引用在上述發明的詳細說明中就針對上述還有一實施方式記載的所有內容，為了避免本說明書的記載過于復雜，將省略重復的內容。
本發明的又一實施方式提供如下的促進育發、養發或生發的方法，即，上述促進育發、養發或生發的方法包括向所需對象給藥藥劑學有效量的包含褪黑激素、d-泛醇、生物素及煙酰胺作為有效成分的育發、養發或生發促進用組合物的步驟。
本說明書中的術語“藥劑學有效量”表示利用上述組合物促進對象的育發、養發或生發，預防脫發癥狀，實現減輕或治療功效所需的充分量。本說明書中的術語“對象(subject)”表示包括人類在內的所有動物，其不受特殊限制，尤其表示需要促進育發、養發或生發的對象。本發明的方法涉及向對象給藥上述育發、養發或生發促進用組合物的方法，因而引入重復的內容，為了避免本說明書的記載過于復雜，將省略重復的內容。
本發明的又一實施方式提供如下的促進育發、養發或生發的方法，即，上述促進育發、養發或生發的方法包括向所需對象(subject)給藥藥劑學有效量的包含0.001-1.0重量百分比的褪黑激素、0.01-0.5重量百分比的d-泛醇、0.001-0.05重量百分比的生物素及0.006-0.3重量百分比的煙酰胺作為有效成分的育發、養發或生發促進用組合物步驟。
本發明的方法涉及向對象(subject)給藥上述育發、養發或生發促進用組合物的方法，已經在發明的一實施方式中具體限定上述促進育發、養發或生發的方法中的組成成分的含量，因而引入重復的內容，為了避免本說明書的記載過于復雜，將省略重復的內容。
發明的效果
對本發明的特征及優點概括如下：
(a)本發明提供包含褪黑激素、d-泛醇、生物素及煙酰胺作為有效成分的育發、養發或生發促進用藥劑學組合物；化妝品組合物；功能性食品組合物；或利用上述組合物的促進育發、養發或生發的方法。
(b)本發明的組合物改善作為藥理活性成分的褪黑激素的光穩定性，并使制劑穩定化，顯著抑制頭皮炎癥，從而使生發或養發效果極大化。
(c)本發明的組合物可作為同時提高光穩定性、保存性、用藥便利性及治療效果的有效的生發、養發促進劑或脫發的預防或治療用劑來有效利用。
附圖說明
圖1示出在被地塞米松(dexamethasone)誘導的脫發癥(alopecia)c57bl/6小鼠模型中，在處理試驗物質之后第九天的生發效力評價(areaofhairrestoration)結果。圖1中經箭頭處理的部分表示在利用數碼相機拍攝涂敷部位之后，利用imagej軟件(美國國立衛生研究院(nih)，馬里蘭州貝塞斯達(bethesda，md))分析的范圍。
具體實施方式
以下，通過實施例進一步詳細說明本發明。這些實施例僅僅用于進一步具體說明本發明，而根據本發明的主旨，本發明的范圍并不局限于這些實施例，這對于本發明所屬技術領域的普通技術人員而言是顯而易見的。
實施例
實施例制劑的制備
制備出用于本發明的含有褪黑激素、d-泛醇、生物素及煙酰胺這4種復合成分的9種制劑，上述制劑的具體成分示出在以下表1中。
實施例制劑的組成
表1
各種制劑的制備方法
表2
實施例1至實施例5用于確定適合于本發明的組合物的功效、效果及性狀的基本制劑的處方，在實施例6及實施例7中適用用于確保穩定性及增加吸收率的組成，在實施例8及實施例9中適用用于從因紫外線而發生的化學、物理變化中確保制劑的穩定性的組成。
實驗例1：抗氧化效果(dpph)的測定
自由基被當作引發老化(例如，脫發、皮膚老化)的原因物質，通過使用光穩定劑來測定自由基清除活性，由此測定出抗氧化效果程度。
為了制備dpph試驗組的試樣，對0.1重量百分比的褪黑激素、0.01重量百分比的生物素、0.06重量百分比的煙酰胺及0.1重量百分比的d-泛醇進行了10分鐘的攪拌，直到完全溶解于乙醇中。并且，由80μg/ml配置dpph(1-二苯基-2-苦肼基(1-diphenyl-2-picrylhydrazyl))溶液，并以使1ml的上述溶液的各個分餾的濃度達到2mg/ml的方式溶解于乙醇中。之后，針對dpph的顏色變化，通過使用紫外分光光度計在517nm的吸收波長下對吸光度進行測定，并將對活性的大小進行測定的結果值代入以下數學式中，由此計算出抑制效果。實驗結果，在包含褪黑激素、生物素、煙酰胺及d-泛醇的情況下，所測定出的抗氧化效果最為優秀，在分別單獨使用d-泛醇、生物素、煙酰胺的情況下，導出抗氧化效果顯著低于將褪黑激素、生物素、煙酰胺及d-泛醇全部包含的情況的結果。其結果示出在表3中。
數學式1
表3
上述實施例通過參照衛生毒理學雜志(journaloftoxicologyandpublichealthvol.23no.3，2007.9，263-269.)來進行。
實驗例2：劑型組合物的穩定化效果測定
為了確定適合于本發明的組合物的功效、效果及性狀的制劑，制備出包含褪黑激素、生物素、d-泛醇及煙酰胺作為有效成分的組合物，并通過光穩定性試驗，對上述有效成分的組成對褪黑激素的穩定性產生的效果進行了測定。利用光穩定性腔室并依據國際協調會議(ich，internationalconferenceonharmonization)方針的q1b(穩定性試驗：新原料藥和制劑的光穩定性測試(stabilitytesting：photostabilitytestingofnewdrugsubstancesandproducts))，在視覺識別系統(vis)為40klux的條件下實施了試驗。
按照表2的方法來制備出劑型組合物試驗組(實施例1-實施例5)。并且，在泵型的透明容器(hdpe)中分別填充50g作為試驗組的試樣。將完成填充的試樣放置于光穩定性腔室內的照射方向，之后根據時間段分別采樣2ml。若完成采樣，則通過液體色譜法(hplc)進行定量分析。液體色譜法的分析條件如下：利用檢測器、紫外吸收光譜(波長為225nm)柱為c18(4.6mm×50mm，1.8μm)或與此相同的欄，流動相為0.018mol/l磷酸鹽緩沖液(ph為3.0)：乙腈(90：10)，且流速為1ml/min，注入量為50μl，溫度為25℃，以標準液(3次)、檢液(2次)順序進行了注入。實驗結果，對于劑型組合物的穩定性而言，相對于褪黑激素的單獨組，褪黑激素、生物素、煙酰胺及d-泛醇的混合組維持了含量穩定性，可知在褪黑激素中混合生物素、煙酰胺及d-泛醇在提高含量穩定性方面具有顯著效果。將其結果示出在表4中。
作為參考，將2.45g的磷酸二氫鉀溶解于水中來使溶液達到1l，之后投入20％的磷酸來將ph調整為3.0，由此制備出磷酸鹽緩沖液。
實驗例3：褪黑激素的光穩定化效果測定
由于作為主要成分的褪黑激素對光比較脆弱，為此添加穩定劑或光穩定劑，通過光穩定性試驗來測定由此產生的效果。利用光穩定性腔室并依據國際協調會議方針的q1b(穩定性試驗：新原料藥和制劑的光穩定性測試)，在視覺識別系統為40klux的條件下實施了試驗。
為了制備穩定劑試驗組試樣，在0.1重量百分比的褪黑激素中分別攪拌了0.1重量百分比的各種穩定劑(甲基-2-吡咯烷酮、抗壞血酸、生育酚、丁基羥基茴香醚)，共攪拌10分鐘，直到完全溶解于乙醇中。
為了制備光穩定劑試驗組試樣，在0.1重量百分比的褪黑激素中分別攪拌了0.1重量百分比的各種穩定劑(二苯甲酮、氧化鋅、水楊酸異辛酯、二氧化鈦)，共攪拌10分鐘，直到完全溶解于乙醇中。
并且，在泵型的透明容器(hdpe)中分別填充50g作為試驗組的試樣。
將完成填充的試樣放置于光穩定性腔室內的照射方向，之后根據時間段分別采樣2ml。若完成采樣，則通過液體色譜法(hplc)進行定量分析。液體色譜法的分析條件如下：利用檢測器、紫外吸收光譜(波長為225nm)柱為c18(4.6mm×50mm，1.8μm)或與此相同的欄，流動相為0.018mol/l磷酸鹽緩沖液(ph為3.0)：乙腈(90：10)，且流速為1ml/min，注入量為50μl，溫度為25℃，以標準液(3次)、檢液(2次)順序進行了注入。實驗結果，以甲基-2-吡咯烷酮、抗壞血酸、生育酚、丁基羥基茴香醚順序對穩定劑的活性進行了測定，可知甲基-2-吡咯烷酮的穩定化活性最為優秀，因而作為穩定劑，最優選地，可利用甲基-2-吡咯烷酮。
以二苯甲酮、氧化鋅、水楊酸乙基己烷、二氧化鈦順序測定了光穩定化活性，可知二苯甲酮的光穩定化活性最為優秀，因而作為光穩定劑，最優選地，可利用二苯甲酮。將其結果示出在表5及表6中。
作為參考，將2.45g的磷酸二氫鉀溶解于水中來使溶液達到1l，之后投入20％的磷酸來將ph調整為3.0，由此制備出磷酸鹽緩沖液。
基于劑型組合物的穩定性評價結果
表4
(保管條件：25℃，60rh)，(光條件：vis40klux)
制劑用穩定劑篩選實驗結果
表5
(保管條件：25℃，60rh，光條件：vis40klux)
光穩定劑篩選實驗結果
表6
(保管條件：25℃，60rh，光條件：vis40klux)
如表4所示，在生物素、煙酰胺及d-泛醇均包含于褪黑激素的情況下，相對于單獨追加生物素、煙酰胺或d-泛醇的情況，可獲得更加優秀的含量穩定性，如表5所示，在利用甲基-2-吡咯烷酮的情況下，含量穩定性最為優秀，因而示出可將甲基-2-吡咯烷酮用作適當的穩定劑。并且，如表6所示，在利用二苯甲酮的情況下，含量穩定性最為優秀，因而示出可將二苯甲酮用作適當的光穩定劑。但是，如上所述，雖然可將二苯甲酮用作優秀的光穩定劑，但存在可通過擾亂內分泌系統來使過敏性疾病惡化等以往公知的一部分副作用，因而為了代替二苯甲酮，可通過還使褪黑激素包含生物素、煙酰胺及d-泛醇的復合組，或利用甲基-2-吡咯烷酮，或減少二苯甲酮的含量，并為了補充上述二苯甲酮而利用生物素、煙酰胺及d-泛醇的復合組及甲基-2-吡咯烷酮等方式提高褪黑激素的光穩定性。
僅利用d-泛醇、生物素及煙酰胺的復合成分，也可使褪黑激素的光穩定性得到顯著提高，通過追加包含穩定劑或光穩定劑，例如，還包含甲基-2-吡咯烷酮、二苯甲酮來可確保進一步提高的光穩定性。
實驗例4：在被地塞米松誘導的脫發癥(alopecia)c57bl/6模型中試驗物質的生發效力的評價
為了評價在被地塞米松誘導的脫發癥c57bl/6小鼠模型中試驗物質的給藥對促進生發產生的影響，委托韓國動物科學研究所進行了本實驗。
4-1.試驗系統
無特定病原菌(spf)的c57bl/6小鼠，c57bl/6ncrljori(東方生物)廣泛使用于各種藥效及毒性試驗，并積累有豐富的試驗基礎資料，且可利用這些資料來容易對試驗結果進行解釋及評價，因而選擇用作利用于本實驗的種類及系統。入手100只5周齡的雌性小鼠，在入手之后經過了7天的檢疫及馴化期間，并將70只雌性小鼠利用于試驗。
在馴化期間(藍色)、給藥及觀察期間(紅色)內通過使用尾部標記法來對動物進行了尾部標記。在飼養箱附著以顏色來區分的個體尾部標記卡，在飼養室的入口附著動物室使用記錄簿。
4-2.飼養環境
本試驗在被設定為溫度為23±3℃，相對濕度為55±15％，通風次數為10～20次/hr，照明時間為12小時(上午8點開燈～下午8點閉燈)及照度為150～300lux的韓國動物科學研究有限公司的嚙齒類飼養區域2號室內實施。
飼養期間內，每周1次對動物室的溫度、濕度、通風次數及照度等環境條件進行了測定。未檢測出可能對環境測定結果試驗的結果產生不良影響的情況。
從dreambio公司購進由嘉吉農標普瑞納有限公司生產的實驗動物用飼料，并將上述飼料投入于飼喂器，使小鼠自由攝取，將經過凈化水投入于聚碳酸酯飲水瓶，使小鼠自由攝取。作為墊子，從沙龍生物有限公司購進木墊來使用。
在馴化、給藥及觀察期間內，在嚙齒類用聚碳酸酯飼養箱(w170×l235×h125mm)中以每箱飼養5只以下的方式進行了飼養。
經作為韓國動物科學研究有限公司的動物實驗倫理委員會的kamsiiacuc的核準，實施了本試驗。
4-3.試驗組的組成及給藥量的設定
試驗組的組成示出在以下表7中。
表7
篩選出脫毛后皮膚未受傷且膚色為粉紅色的動物，并隨機實施了組分離。在組分離之后，將各個組分為賦形劑對照組、陽性對照組(3％的米諾地爾給藥組)、htb005(1)～htb005(5)給藥組來投放試驗物質。
4-4.給藥
通過作為臨床預定途徑的皮膚涂敷來進行給藥，在試驗物質的情況下，從脫毛后的第七天開始以1次/日，共給藥9天的方式進行給藥，在地塞米松的情況下，從脫毛后的第九天開始以1次/日，共給藥7天的方式進行了給藥。在地塞米松的情況下，以1ml/head的方式進行了涂敷。利用噴劑容器(約0.18ml/1次)進行涂敷，以均勻地擴散于皮膚規定區域。
在被脫毛的皮膚上放上1.5cm×1.5cm大小的框之后，以均勻擴散的方式利用噴劑容器涂敷試驗物質及陽性對照物質。
4-5.試驗方法及檢查項目
(1)模型的制備
在利用舒泰50(zoletil50，virbac，france)及甲芐噻嗪(xylazine，
(2)照片的拍攝及分析
分別在脫毛實施日(0天(day))、第7天、第9天、第12天及第16天利用舒泰50及甲芐噻嗪誘導麻醉，之后利用數碼相機拍攝了涂敷部位，之后利用imagej軟件(software)(nih，bethesda，md)進行了分析。
(3)體重的測定：在脫毛實施日之后以1次/周的方式測定體重。
(4)尸檢
在脫毛后的第16天，通過摘除涂敷試驗物質的部位，并固定于10％的中性緩沖福爾馬林溶液中。
(5)組織病理學檢查
通過對被固定的組織進行修剪、脫水、石蠟包埋、切割等普通的組織處理過程來制作用于組織病理學檢查的試料，之后實施蘇木精-伊紅(h&e，hematoxylin&eosin)染色，并基于是否形成毛囊及毛囊的生長期比率實施了生發效力評價。在利用光學顯微鏡(olympusbx53，japan)拍攝照片之后，按每個個體隨機選擇5張照片來對毛囊數量及生長期比率進行了評價。
4-6.統計學分析
對于毛囊數量及生發面積，假設資料的正規性，并適用單因素方差分析(one-wayanova)。在單因素方差分析結果顯著的情況下，通過實施包括新復極差法檢驗(dunnett’smultiplecomparisontest)在內的事后檢驗來確認呈現出與賦形劑對照組及陽性對照組顯著差異的組。
對于生長期比率評價，利用順序化的數據來實施非參數檢驗獨立樣本檢驗(kruskal-wallis’h-test)，在其結果顯著的情況下，通過作為事后分析的鄧肯氏多重比較測試(dunn’smultiplecomparisontest)來確認呈現出與賦形劑對照組及陽性對照組顯著差異的組。
統計學分析利用棱鏡(prism)5.03(graphpadsoftwareinc.，sandiego，ca，usa)，在ph值小于0.05的情況下，統計學上判定為效果顯著。
4-7.實驗結果
為了評價在被地塞米松誘導的脫發癥c57bl/6小鼠模型中試驗物質的給藥對促進生發產生的影響而進行了本試驗(g1：賦形劑對照組，g2：陽性對照組(3％的米諾地爾(minoxidil))，g3：0.01％的褪黑激素給藥組，g5：0.1％的褪黑激素給藥組，g6：單獨使用0.1％褪黑激素的給藥組，g7：0.2％的褪黑激素給藥組)。
據報道，米諾地爾(minoxidil)對男性脫發癥(androgeneticalopecia)具有效果(messengeragetal，2004)，在本試驗中，米諾地爾被用作陽性對照組。在對生發面積進行測定的結果，在公開給藥試驗物質之后第七天，所有試驗物質給藥組的生發面積呈現出大于賦形劑對照組的傾向。并且，在公開給藥試驗物質后的第12天及第16天，相對于賦形劑對照組，0.01％的褪黑激素(melatonin)及0.2％的褪黑激素給藥組的生發面積呈現出大面積傾向，0.01％的褪黑激素及0.2％的褪黑激素給藥組的生發面積呈現出比陽性對照組還大的傾向，因而認為試驗物質有助于促進生發。
在組織病理學檢查中，在對毛囊數量測定結果及生長期毛囊比率進行分析的結果，統計學上未觀察到顯著差異。但是，在生長期毛囊比率分析結果中，0.01％的褪黑激素及0.2％的褪黑激素給藥組的生長期毛囊比率呈現出比陽性對照組還大的傾向，因而認為試驗物質的給藥對轉換為生長期毛囊的方面產生影響。
總之，當向被地塞米松誘導的脫發癥c57bl/6的小鼠模型的皮膚涂敷9天的試驗物質時，在所有測定日內，觀察到0.2％的褪黑激素給藥組的生發面積比賦形劑對照組及陽性對照組的的傾向，在0.01％的褪黑激素給藥組中，在除第9天之外的所有測定日內，觀察到比賦形劑對照組及陽性對照組大的傾向。并且，觀察到0.01％的褪黑激素及0.2％的褪黑激素給藥組的毛囊數量及生長期毛囊比率比賦形劑對照組及陽性對照組多的傾向。
因此，在本試驗條件下，認為在被地塞米松誘導的脫發癥c57bl/6的小鼠模型中，投放0.01％的褪黑激素及0.2％的褪黑激素的試驗物質可有助于促進生發。
表8
在表8中，以平均來表示數據，g1為賦形劑對照組，g2為3％的米諾地爾0.18ml/head，g3為0.01％的褪黑激素0.18ml/head，g5為0.1％的褪黑激素0.18ml/head，g6為單獨使用的0.1％的褪黑激素0.18ml/head，g7為0.2％的褪黑激素0.18ml/head。
表9
在全部毛囊中以活性形態毛囊的數量之比來進行計算。活性毛囊表示在生發試驗的組織病理學檢查意見中，轉換為生長期毛囊及毛發的個體的比率。在組織病理學檢查中，分為生長期、毛發生長靜止期及毛發生長中期，在全部毛囊中僅計算出生長期毛囊的比率。生長期、毛發生長靜止期及毛發生長中期通過在顯微鏡下綜合考慮毛囊數量、毛囊的大小及毛發的粗細、形態等來進行了判斷并確定。計算方法如下：
活性毛囊比率(anagenratio)＝脫毛部位轉換為生長期的動物數量/各個試驗組的全部動物數量x100。
即，表示比率越高，則生發面積越大。
在表9中，以平均來表示數據，g1為賦形劑對照組，g2為3％的米諾地爾0.18ml/head，g3為0.01％的褪黑激素0.18ml/head，g6為單獨使用的0.1％的褪黑激素0.18ml/head，g7為0.2％的褪黑激素0.18ml/head。
以上，對本發明的特定部分進行詳細描述，本發明所屬技術領域的普通技術人員明確理解這種具體的描述僅僅為優選的實例，而本發明的范圍并不局限于此。因此，本發明的實際范圍應通過所附的發明要求保護范圍及其等同技術方案來定義。