Cornulin作為靶點在制備防治銀屑病的藥物中的應用的制作方法

本發明屬于生物醫藥
技術領域：
，涉及Cornulin在制備防治銀屑病中的應用。
背景技術：
：銀屑病是炎癥性、免疫介導的慢性皮膚疾病，以角質形成細胞增生和異常分化、炎癥細胞浸潤為特征。銀屑病的臨床特征是上覆在紅斑基礎上的銀白色鱗屑，長期的疾病發展嚴重影響了患者的生活質量。典型銀屑病的組織病理為：表皮角化不全，常伴有角化過度；顆粒層消失，棘層肥厚，表皮突延伸，下端增寬，可與鄰近表皮突相吻合，真皮乳頭上延，其上方棘層變薄。基地細胞可有輕度海綿形成，甚至空泡形成或水腫變性。乳頭內毛細血管迂曲擴張充血，周圍淋巴細胞、中性白細胞浸潤。角化不全區域常可見中性白細胞聚集，稱為Munro氏小膿腫。銀屑病的治療方法有很多種，治療銀屑病的藥物包括皮質類固醇類、維A酸類、維生素D3衍生物類、鈣調神經磷酸酶抑制劑等藥物，但是由于該病病因不清，目前許多治療方法的療效并不能使患者滿意，并且該病容易復發，由于治療銀屑病的藥物不良反應或者藥物價格等方面，而限制了這些藥物在臨床上的使用。Cornulin(CRNN)，也稱為clorf10(Chromosome1openreadingframe10)和SEP53(SquamousEpithelialinducedstressProteinof53kDa)，最初是Xu等(XuZ，WangMR，XuX，etal.Novelhumanesophagus-specificgeneclorf10：cDNAcloning，genestructure，andfrequentlossofexpressioninesophagealcancer.Genomics.2000.69(3)：322-30.)于2000年在食管上皮細胞中發現的。由于cornulin在熱休克后合成明顯增多，并且編碼了一個分子量53kDa的鈣結合蛋白，故Yagui-Beltran等又稱為SEP53[7]。Clorf10產物是蛋白質，并且它的結構特征與表皮分化復合體的“融合基因”家族成員相似，在表皮分化中起作用，故Contzler稱之為cornulin。Cornulin是分子量為53kDa的編碼495個氨基酸且它的N末端有約90個氨基酸殘基的鈣結合基序和60個氨基酸的保守的連續重復序列，cornulin是編碼在表皮分化復合體的1q21染色體上，主要定位在細胞質和核周區。除食管上皮細胞發現cornulin外，還在口腔鱗狀上皮細胞，宮頸鱗狀上皮細胞，表皮鱗狀上皮細胞，瞼板腺上皮細胞和甲狀腺濾泡等也被鑒定出了cornulin。除在鱗狀細胞腫瘤cornulin表達降低外，還在甲狀腺癌和濕疹等cornulin表達也降低。技術實現要素：本發明解決的問題在于提供Cornulin作為靶點在制備防治銀屑病的藥物中的應用，以Cornulin作為干預靶點對防治銀屑病作用更加明確，而且安全性良好。本發明是通過以下技術方案來實現：Cornulin作為靶點在制備防治銀屑病的藥物中的應用。所述的藥物是在基因水平和/或蛋白水平以Cornulin作為藥物靶點。所述的藥物是針對Cornulin的抗體。所述的藥物是阻礙Cornulin表達或轉錄的DNA或RNA。所述的藥物是阻礙或抑制Cornulin活化AKT信號的藥物。針對Cornulin的抗體在制備防治銀屑病的藥物中的應用。siRNA敲除Cornulin的載體在制備防治銀屑病的藥物中的應用。與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果：本發明提示cornulin與銀屑病的發展呈正相關，采用適當濃度的cornulin抗體治療咪喹莫特小鼠銀屑病模型，能夠改善鱗屑和皮損厚度，并且通過抑制AKT信號來促成銀屑病的進展以及抑制皮損恢復正常，因此提出制備防治銀屑病的藥物時新的藥物作用靶點-cornulin。cornulin抗體相比其它治療銀屑病藥物，干預靶點更加明確，即針對銀屑病發病的炎癥通路中AKT信號相關分子通路。cornulin抗體安全性良好，cornulin抗體特異性結合cornulin，可以來源于兔的多克隆抗體，以及其輔料BSA都對身體無毒副作用，具有良好的安全性。附圖說明圖1為不同濃度的CRNN外用治療咪喹莫特小鼠的臨床照片，其中對照組為0.1％疊氮鈉，治療組分別為0.5，1，2ng/ml的CRNN。圖2為外用0.5ng/ml的CRNN治療咪喹莫特小鼠皮損和對照組小鼠皮膚組織蛋白的Westernblot，其中veh為對照組0.1％疊氮鈉，CRNN為0.5ng/ml的CRNN。圖3為0.5ng/ml的CRNN治療咪喹莫特小鼠的PASI評分。其中A為總的PASI評分，B為紅斑的PASI評分，C為鱗屑的PASI評分，D為皮膚厚度的PASI評分。圖4為人體正常皮膚組織和銀屑病皮損組織中cornulin免疫組化及半定量對比圖。圖5為人體正常皮膚組織和銀屑病皮損組織中cornulinwesternblot及其相對表達。圖6為在HaCaT細胞用不同濃度的M5刺激后24小時，提取細胞總RNA，real-timePCR測cornulinmRNA的相對表達變化。圖7為在HaCaT細胞應用si-negative、si-crnn1和si-crnn2敲除cornulin后48小時，提細胞總蛋白，檢測相關分子的westernblot。圖8為在HaCaT細胞應用si-negative、si-crnn1和si-crnn2敲除cornulin后24小時、48小時及72小時，應用MTT法檢測對HaCaT細胞增殖的影響。具體實施方式下面結合具體的實施例對本發明做進一步的詳細說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。本發明發現在銀屑病患者皮損和咪喹莫特小鼠皮損中cornulin表達升高，應用M5(IL-17A，IL-22，IL-1a，OSM和TNF-a混合物)刺激HaCaT和HEKa細胞模擬銀屑病細胞水平后，cornulin表達升高；這些提示cornulin與銀屑病的發展呈正相關，下面對本發明進一步詳細的說明。1)咪喹莫特小鼠模型的建立購買6-7周BALB/c小鼠，2％水合氯醛麻醉后，剃去背部毛約2*2cm大小，外用咪喹莫特乳膏62.5mg，每天一次，外用不同濃度(0.5ng/ml，1ng/ml和2ng/ml)的CRNN抗體(catalognumber：11799-1-AP)40ul，每天一次，每天拍照并PASI評分，共7天，第八天脫頸椎處死小鼠后，取皮損，一部分做免疫組化，一部分提蛋白做WB。不同濃度的CRNN外用治療咪喹莫特小鼠的臨床照片結果如圖1所示，其中對照組為0.1％疊氮鈉，治療組分別為0.5，1，2ng/ml的CRNN；0.5ng/ml的CRNN治療咪喹莫特小鼠的PASI評分結果如3所示，其中A為總的PASI評分，B為紅斑的PASI評分，C為鱗屑的PASI評分，D為皮膚厚度的PASI評分。咪喹莫特小鼠皮損對照實驗結果表明經過常規的治療銀屑病藥物外用和cornulin抗體治療后，小鼠皮損癥狀均明顯改善。2)CRNN治療咪喹莫特小鼠皮損的Westernblot檢測檢測方法如下：(1)細胞總蛋白的提取a)提前按照100∶1的比例將RIPA裂解液和PMSF混合均勻，放置于冰上；b)棄去六孔板或1.5cm培養皿中的培養基，用PBS洗兩遍；c)每孔加入150μl的裂解液，冰上裂解20min；d)冰上充分刮細胞，將其轉移至EP管中；e)用液氮反復凍融3次；f)4℃12000rpm離心15min，小心吸取上清，轉移至另一個EP管中；g)BCA法測蛋白濃度：試劑盒A液和B液按照50∶1的濃度混合均勻，向96孔板的每個孔中加入98μl，再加入2μl所提蛋白或者標準蛋白品(0μg/μl，0.25μg/μl，0.5μg/μl，1μg/μl，2μg/μl)，振蕩器上震蕩混合均勻后，放入37℃恒溫箱中30min，然后在分光光度儀上測定OD562nm，根據標準曲線，計算出蛋白濃度。h)蛋白內加入1/4體積的5×上樣緩沖液，95℃煮5min后-20℃保存備用。(2)SDS-PAGE電泳a)配制聚丙烯酰氨凝膠電泳的下層膠，待膠凝固后，倒入上層膠，插入洗凈干燥的梳子，確保無氣泡，靜置20-30min待濃縮膠聚合；b)將膠固定于蛋白電泳槽中，根據蛋白濃度，調整上樣量，保證每孔上相同含量蛋白(約20-25μg)，同時加入預染蛋白分子量marker5μl以確定待檢蛋白的分子量；c)電泳：加樣后，于15mA電泳30min后用25mA電泳約60min，至溴酚蘭至分離膠底部停止電泳；d)取下凝膠，置于轉膜緩沖液中。(3)轉膜a)準備2張濾紙和1張PVDF膜，尺寸和SDS-PAGE凝膠的大小相近；b)PVDF膜需先在甲醇中浸泡1min，然后浸泡于轉移緩沖液中備用；c)轉膜裝置上從陰極向陽極依次放置濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙，注意各層間無氣泡；d)恒流230mA轉膜1.5-2h。(4)封閉用TBST配置的5％脫脂奶粉或BSA的封閉液室溫封閉PVDF膜1h。(5)抗體孵育a)將PVDF膜按照抗體的分子量大小才成適當寬度的條帶；b)用TBST漂洗一下后，加入按要求濃度配制好的一抗，4℃孵育過夜；c)回收一抗，用TBST將膜漂洗3次，每次10min；d)加入按要求濃度配好的二抗，溫孵育1h；e)再用TBST將膜漂洗3次，每次10min，然后倒盡液體。(6)顯影(暗室中操作)a)取等體積的化學發光試液A液和B液，用前臨時混合均勻；b)將配置好的發光液均勻鋪于PVDF膜上，反應1min后濾紙吸干發光液，放置膠片，根據曝光效果調整曝光時間；c)取出膠片浸入顯影液中，清水漂洗后定影，晾干后進行掃描采圖與分析。(7)膜再生strip法a)發光后的PVDF膜用TBST漂洗5min；b)加入適量的膜再生液，室溫孵育30min；c)再用TBST漂洗5min×3遍；d)重新封閉、抗體孵育、顯影，同步驟(4)(5)(6)。CRNN治療咪喹莫特小鼠皮損和對照組小鼠皮膚組織蛋白的Westernblot檢測結果如圖2所示，可以看到治療效果與CRNN含量正相關，治療效果更好的對照組的CRNN含量更高。3)正常皮膚組織和銀屑病皮損組織中cornulin檢測，包括免疫組織化學染色和westernblot1)免疫組織化學染色(1)臨床標本的處理將手術過程中得到的標本用生理鹽水徹底沖洗，去除血液和污染物，隨后將組織塊置于4％多聚甲醛中，固定24h。(2)載玻片的處理a)將載玻片洗潔精超聲清洗后，放入重鉻酸鉀-濃硫酸混合液中浸泡24h；b)酸缸中取出后用自蒸餾水沖洗至完全干凈，置于烤箱中60℃烘干過夜；c)為防止組織掉片，載玻片需經3-氨丙基-3-乙氧基甲硅烷(3-Aminopropyl-Triethoxysilane，APES)處理。將APES原液與丙酮1∶50稀釋成工作液，將洗凈的玻片放入新配置的APES工作液中停留30s后取出；d)取出玻片，停頓10s鐘，再放入丙酮溶液30s，涮去未結合的APES；e)再置于烤箱中烘干2h，裝盒后備用。(3)石蠟包埋和組織切片a)包埋組織：先在模具中加入一些液態石蠟，稍微冷卻后，將待包埋的組織置于石蠟之中，并排列整齊，再將塑料模具盒蓋上，最后加入少許液體石蠟，冷卻使其變成固態；b)切片：將包埋好的組織從模具上取下來，置于石蠟切片機上，調節切片的厚度4μm，連續切片；c)切片置于60℃烤箱中烤90min，然后轉入37℃烤箱中過夜。(4)免疫組織化學染色步驟a)將組織切片置于二甲苯中脫蠟10min×2次；b)再依次置于無水酒精、95％酒精、90％酒精、80％酒精、70％酒精各10min；c)置于PBS中水化5min×3次；d)滴加新鮮配制的3％H2O2，室溫孵育20min，以阻斷內源性過氧化物酶，然后用PBS洗5min×3次；e)將切片放入盛0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH6.0)的高壓鍋中，加熱至壓力閥開始噴氣時開始計時2min，然后離開熱源，冷卻后取下氣閥，取出切片，蒸PBS洗5min×3次；f)滴加5％山羊血清37℃封閉20min，甩除勿洗；g)加一抗：滴加稀釋好的一抗工作液(CRNN的稀釋比例為1∶100)，4℃過夜；h)室溫復溫30min，用PBS洗5min×3次；i)加二抗：滴加生物素標記二抗，37℃孵育30min，PBS洗5min×3次；j)滴加辣根過氧化酶標記的鏈霉卵白素，37℃孵育20min，PBS洗5min×3次；k)按照說明書配制DAB顯色液，滴加于切片上，顯色3-5min，顯微鏡下觀察顯色反應；l)清水沖洗后，用蘇木素復染2min，再用清水沖洗；m)將切片依次置于70％酒精、80％酒精、90％酒精、95％酒精、無水酒精各3min，二甲苯透明10min×2次；n)中性樹膠封片，陰性對照以PBS代替一抗，其余步驟相同，在顯微鏡下觀察、拍照并對結果進行分析。(5)免疫組化染色結果的判定由兩位醫師分別雙盲閱片。陽性表達為細胞質和(或)細胞核內出現黃色、棕黃色或褐色顆粒。在400倍鏡下隨機挑選10個視野，觀察細胞染色強度，計算陽性細胞百分率。陽性率≤5％為0分，6％～25％為1分，26％～50％為2分，51％～75％為3分，＞75％為4分；染色強度分為4級，無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。每個視野陽性細胞百分率與染色強度相乘為該視野得分，最終得分為5個視野得分的平均值。0分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～8分為中等程度陽性(++)，9～12分為強陽性(+++)。檢測結果分別如圖4、圖5所示，結果表明在皮損組織中CRNN的含量較正常組織提升明顯。以上結果表明CRNN與銀屑病的發展呈正相關。4)應用M5刺激HaCaT和HEKa細胞模擬銀屑病細胞的檢測應用M5(IL-17A，IL-22，IL-1a，OSM和TNF-a混合物)刺激HaCaT和HEKa細胞模擬銀屑病細胞水平，然后提取cornulinRNA進行檢測；具體操作如下：(1)細胞復蘇a)將細胞凍存管從液氮罐中取出，立即置于37℃水浴箱中，使其在1min內迅速融化；b)加入事先準備好的含有5ml10％FBS的DMEM培養基的中，800rpm離心5min，棄去上清；c)加入5ml含10％FBS的DMEM培養基重懸細胞，接種到25cm2培養瓶中，置37℃、5％CO2培養箱中培養，次日更換培養基。(2)細胞培養細胞常規培養于37℃恒溫、5％CO2培養箱中，每2d更換一次培養基。(3)細胞傳代a)當細胞覆蓋率達到80％以上時，可以進行傳代。先棄去舊的培養基，用PBS洗2次；b)加入2ml0.25％胰酶消化，37℃放置約5min，在倒置顯微鏡下觀察，可見細胞變圓，細胞間隙變大，此時立刻加入4ml含10％FBS的DMEM培養基終止消化，用移液槍輕輕吹打細胞懸液，轉入離心管中；c)將細胞懸液移至離心管，800rpm離心5min，棄去上清，加入新鮮的培養基重懸，重新接種于新的培養瓶中繼續培養。一般傳代比例為1∶2-4。(4)細胞凍存a)當細胞覆蓋率達到80％以上且狀態較好時時，可進行細胞凍存。先棄去舊的培養基，用PBS洗2次；b)用0.25％胰酶消化，含10％FBS的DMEM培養基終止消化，轉移到離心管中，800rpm離心5min；c)棄去上清，加入1ml細胞凍存液，吹打均勻，轉移至凍存管中；d)將凍存管放入凍存盒中后，放入-80℃冰箱過夜，最后轉移到液氮罐中進行長期保存。細胞總RNA的提取及反轉錄成cDNA(1)細胞總RNA的提取a)提前用DEPC浸泡實驗所需的槍頭、槍頭盒、EP管等過夜，以除去RNA酶；b)棄去六孔板或1.5cm培養皿中的培養基，用PBS洗兩遍；c)加入1mlTrizol靜置2min，用加樣槍吹打數下，轉移至1.5mlEP管中，輕柔顛倒10次，冰上放置5mind)加入200μl氯仿，上下顛倒10次，使其充分混勻呈乳白狀，冰上放置5min，然后4℃12000rpm離心15min；e)小心地將上層無色透明的上清液(約300μl)轉移至新的1.5mlEP管中，加入等體積的異丙醇，輕柔顛倒10次，然后冰上放置20min；f)4℃12000rpm離心15min，可見管底有白色沉淀，小心棄去上清；g)加入預冷的75％乙醇1ml洗滌沉淀，然后4℃7500rpm離心5min；h)棄去上清，室溫干燥5-10min，可見底部白色沉淀物變為透明，加入適量的(30-50μl)DEPC水，彈勻并放置在55-60℃10min，使RNA充分溶解；i)RNA純度和濃度的測定：吸取1μl提取的RNA加入99μlDEPC水中(稀釋100倍)，于分光光度儀上測OD260nm和OD280nm值，OD260/OD280在1.9-2.0之間說明所提取的RNA純度較高。總RNA濃度(μg/ml)＝A260nm×40×稀釋倍數，以備其后反轉錄為cDNA實驗所需，余RNA產物放于-80℃冰箱保存備用。(2)反轉錄反應a)在冰上向PCR管中按照如下反轉錄體系加入試劑，混勻之后短暫離心；5×RTsupermix4μlRNA2μgDEPC水加至總體積20μlb)放入PCR儀中，反轉錄條件：25℃，10min；42℃，30min；85℃，5min；c)反轉錄產物放入-20℃保存備用。4)普通PCR(1)PCR擴增反應a)向反轉錄好的20μlcDNA中加入80μlDEPC水(即稀釋至5倍)；b)在冰上向PCR管中按照如下體系加入試劑，混勻之后短暫離心。引物序列見表3-2；表3-2PCR引物序列b)放入PCR儀中，反應條件如下所示：(2)瓊脂糖凝膠電泳a)配2.5％的瓊脂糖凝膠，室溫冷卻20-30min待其凝固成凝膠；b)取各個RNA樣品10μl，Marker6μl混勻，加入加樣孔中；c)電泳：110V電壓下電泳20-30min，用凝膠紫外分析儀觀察并拍照。5)熒光實時定量PCR(qRT-PCR)(1)在冰上向PCR管中按照如下體系加入試劑，混勻之后短暫離心；(2)放入實時定量PCR儀中，反應條件如下所示：95℃10min95℃30s58℃30s40個循環72℃30s60℃1min95℃30s熔解曲線61.5℃15s(3)結果判定：用2-ΔΔCt的方法對CT值進行分析，計算該基因的相對表達量。real-timePCR測cornulinmRNA的相對表達變化檢測結果如圖6所示，結果表明刺激HaCaT和HEKa細胞模擬銀屑病細胞水平后，cornulin表達升高5)對M5刺激HaCaT和HEKa細胞應用siRNA敲除cornulin后進行檢測針對cornulin的siRNA為si-negative、si-crnn1和si-crnn2，其序列分別為：siRNA轉染過程a)轉染前24h將約1.5-2×105個細胞接種至6孔板，用含10％FBSDMEM培養基在37℃、5％CO2的溫箱中孵育24h，轉染時細胞融合度需要達到60-70％；b)將Lipofectamine2000以5μl/孔加入250μl/孔的Opti-MEM減血清培養基中，輕輕上下顛倒混勻后室溫孵育5min；c)分別取5μl/孔的CRNN-siRNA和陰性對照siRNA分別加入250μl/孔的Opti-MEM減血清培養基中混合均勻；d)將b)和c)中的液體混合，輕柔顛倒混勻，室溫孵育20min，以便形成siRNA與Lipofectamine2000的轉染復合物；e)把相應的siRNA與Lipofectamine2000的混合液滴加到各孔中，用純DMEM培養基補充至每孔的液體總量為2ml，輕柔地搖晃6孔板以混勻，做好標記后將6孔板放入細胞培養箱；f)常規培養6h后，更換為含10％FBS和1％雙抗的普通DMEM培養基。(3)轉染效率的驗證a)轉染24h后提取RNA進行qRT-PCR實驗檢測CRNNmRNA表達水平；b)轉染48h后提取蛋白進行WesternBlot實驗檢測CRNN蛋白表達水平。圖6為在HaCaT細胞應用si-negative、si-crnn1和si-crnn2敲除cornulin后48小時，提細胞總蛋白，檢測相關分子的westernblot。結果表明在cornulin被抑制表達之后AKT表達提升，提示cornulin通過活化AKT信號來促成銀屑病的進展。6)MTT法檢測敲除cornulin對HaCaT細胞增殖的影響(1)取對數生長期的細胞，用胰酶消化收集細胞后，用含10％FBS的DMEM培養基制成單個細胞懸液，調整細胞密度為2.5×104個/ml；(2)96孔板中每孔加入200μl細胞懸液(5×103個細胞/孔)，每組設5個復孔，同時設置空白對照組只加培養基，37℃、5％CO2細胞培養箱中常規培養；(3)24h后行轉染(各種試劑用量按照6孔板/96孔板培養基體積換算)；(4)于轉染后24h進行檢測。測時每孔加入0.5mg/ml的MTT溶液20μl，置于培養箱中繼續孵育4h，棄去液體，每孔加入150μlDMSO，室溫震蕩10min溶解結晶，在波長490nm測定吸光度(OD)值；(5)轉染后48h、72h分別重復步驟(4)；(6)以無細胞完全培養液為本底對照，繪制細胞生長曲線(以平均OD值為縱坐標，以時間為橫坐標)。在HaCaT細胞應用si-negative、si-crnn1和si-crnn2敲除cornulin后24小時、48小時及72小時的細胞增殖如圖8所示，結果表明cornulin被抑制表達后影響到所模擬的銀屑病細胞的增殖，提示cornulin促進細胞銀屑病細胞的增殖。綜上實驗檢測表明，cornulin與銀屑病的發展呈正相關，適當濃度的cornulin抗體治療咪喹莫特小鼠銀屑病模型，能夠改善鱗屑和皮損厚度，并且通過抑制AKT信號來達到抑制銀屑病發展以及抑制皮損恢復正常。鑒于此，Cornulin可以作為靶點在制備防治銀屑病的藥物中的應用。而且可以在基因水平和/或蛋白水平以Cornulin作為藥物靶點。比如通過阻礙Cornulin表達或轉錄的DNA或RNA，或者是阻礙或抑制Cornulin作用AKT信號的藥物。相應的針對Cornulin的抗體在制備防治銀屑病的藥物中的應用。siRNA敲除Cornulin的載體在制備防治銀屑病的藥物中的應用。以上給出的實施例是實現本發明較優的例子，本發明不限于上述實施例。本領域的技術人員根據本發明技術方案的技術特征所做出的任何非本質的添加、替換，均屬于本發明的保護范圍。當前第1頁1 2 3