一種生物活性玻璃?改性明膠復合水凝膠及其制備方法與流程

本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料的制備領域，具體涉及一種生物活性玻璃-改性明膠復合水凝膠及其制備方法。

背景技術：

創(chuàng)傷、腫瘤切除、畸形矯正及感染等原因使骨喪失骨質后容易造成骨缺損。目前，治療骨缺損最主要的方法是骨移植，包括自體骨和異體骨。自體骨移植無需考慮組織相容性及免疫排斥反應，但供骨來源有限；異體骨來源廣泛，但存在免疫排斥和感染血源性病毒等風險。因此，需要研究和開發(fā)新型人工骨修復材料以滿足臨床需求。

骨組織的主要成分是膠原和羥基磷灰石?；诜律嵌?，采用與天然骨成分相似的有機和無機物制備骨修復材料已成為目前的研究熱點之一。生物活性玻璃作為典型的硅酸鹽材料，具有良好的生物相容性、骨引導性和骨誘導性，在骨缺損修復具有廣泛的應用。明膠是膠原部分水解得到的產物，生物相容性良好，同時鏈上帶負電的羧基基團可作為成核位點，控制和誘導羥基磷灰石形成。生物活性玻璃/明膠復合材料在組成上與人骨組織類似，并具有良好的生物相容性和誘導成骨作用等生物學特性，在一定程度上滿足骨修復材料的要求。

目前，制備生物活性玻璃/明膠復合材料的常用方法是將一定量的生物活性玻璃粉體加入至明膠溶液中，攪拌均勻后倒入模具中，冷凍干燥成型，隨后用交聯(lián)劑進行化學處理，再進行冷凍干燥，最后得到復合支架材料。然而，通過上述方法制備的復合骨修復材料存在以下問題：（1）制備工藝復雜，需經過成型、冷凍干燥和化學交聯(lián)等多個步驟；（2）支架成型后需要通過化學交聯(lián)提高穩(wěn)定性，但交聯(lián)劑（如戊二醛）容易殘留在支架中，造成細胞毒性；（3）復合支架含水率較低，不利于營養(yǎng)物質和代謝產物的運輸。

改性明膠是由明膠側鏈的活性氨基與甲基丙烯酸酐反應所得，在紫外光引發(fā)下發(fā)生自由基聚合反應形成水凝膠，改善了明膠力學性能差和降解速率快等缺點。明膠水凝膠具有良好的生物相容性和優(yōu)異的加工性，同時與細胞外基質具有類似的結構，可為細胞黏附、增殖和分化提供良好的微環(huán)境。有研究者通過在明膠水凝膠中添加無機納米粒子（納米金顆粒、二氧化硅和羥基磷灰石等），以提高復合水凝膠的生物活性和成骨作用。

本發(fā)明采用光聚合反應原理制備生物活性玻璃-改性明膠復合水凝膠支架材料。該復合水凝膠具有良好的生物相容性和骨誘導能力；生物活性玻璃均勻分散在三維網絡結構中，與改性明膠緊密結合，硅、鈣和磷等離子溶出產物可緩慢釋放；高含水率可保證營養(yǎng)物質和代謝產物的正常運輸；制備過程簡單，無需使用化學交聯(lián)劑，在骨組織工程領域具有廣闊的應用前景。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于針對現(xiàn)有技術和材料的不足，提供一種生物活性玻璃-改性明膠復合水凝膠及其制備方法，獲得具有良好生物活性和骨誘導能力的復合水凝膠，可用于非承重部位骨缺損的治療，實現(xiàn)骨組織的修復與再生。

本發(fā)明通過以下技術方案實現(xiàn)。

一種生物活性玻璃-改性明膠復合水凝膠的制備方法，包括以下步驟：

1）將改性明膠和光引發(fā)劑2-羥基-4’-（2-羥乙氧基）-2甲基苯丙酮（IRGACURE 2959）充分溶解于磷酸鹽緩沖溶液中，得到改性明膠預聚物溶液；

2）在改性明膠預聚物溶液中加入生物活性玻璃粉體，超聲分散和磁力攪拌，得到分散均勻的混合漿料；

3）將混合漿料倒入聚四氟乙烯模具中，在紫外光照射引發(fā)自由基聚合反應，將反應后的產物在磷酸鹽緩沖溶液中溶脹以去除未反應的單體和光引發(fā)劑，得生物活性玻璃-改性明膠復合水凝膠。

進一步地，步驟1）所述改性明膠的甲基丙烯酰胺基取代度為40%-80%。

進一步地，步驟1）中改性明膠預聚物在改性明膠預聚物溶液中的濃度為7-15 w/v%，優(yōu)選為10 w/v%。

進一步地，步驟1）所述的光引發(fā)劑在磷酸鹽緩沖溶液中的濃度為0.1-1 w/v%。

進一步地，步驟2）所述的生物活性玻璃粉體為采用有機模板結合溶膠-凝膠法制備的微/納米球形粉體。

進一步地，步驟2）所述超聲分散30min和磁力攪拌4 h。

進一步地，步驟2）所述的生物活性玻璃粉體在混合漿料中的濃度為1-10 w/v%。

進一步地，步驟3）所述紫外光的波長為 254-400 nm，強度為 5-20 mW/cm² ，照射時間為 1-20 min。優(yōu)選波長為365 nm，強度為 5m W/cm2。

由以上所述的制備方法得到的一種生物活性玻璃-改性明膠復合水凝膠。該生物活性玻璃-改性明膠復合水凝膠可應用于非承重骨缺損部位的治療，促進骨組織的修復與再生。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果是：

（1）本發(fā)明選取生物活性玻璃和改性明膠兩種材料進行復合，在紫外光照射下發(fā)生自由基聚合反應形成復合水凝膠。該復合水凝膠具有良好的生物相容性和骨誘導能力；合成材料來源廣泛，價格低廉；制備方法簡單方便，且無需使用化學交聯(lián)劑。

（2）本發(fā)明的復合水凝膠中生物活性玻璃均勻嵌入改性明膠水凝膠形成的三維網絡結構中，與改性明膠通過物理方式（氫鍵）緊密結合，使硅、鈣和磷等離子緩慢釋放。且復合水凝膠含水率較高（80%以上），可保證營養(yǎng)物質和代謝廢物的運輸。

（3）改性明膠作為良好的細胞載體，在室溫、短時間內即可成膠，可聯(lián)合骨髓間充質干細胞和生長因子等構建功能化的骨組織工程。

（4）本發(fā)明的生物活性玻璃-改性明膠復合水凝膠可應用于骨缺損修復、藥物緩釋載體和骨組織工程等領域。

附圖說明

圖1a、圖1b是本發(fā)明實施例1所得生物活性玻璃-改性明膠復合水凝膠在不同放大倍數(shù)的掃描電鏡圖；

圖1c、圖1d是本發(fā)明實施例2所得生物活性玻璃-改性明膠復合水凝膠在不同放大倍數(shù)的掃描電鏡圖；

圖1e、圖1f 是本發(fā)明實施例3所得生物活性玻璃-改性明膠復合水凝膠在不同放大倍數(shù)的掃描電鏡圖；

圖2是本發(fā)明實施例2所得生物活性玻璃-改性明膠復合水凝膠的紅外圖譜；

圖3是本發(fā)明實施例1、2、3所得生物活性玻璃-改性明膠復合水凝膠的含水率圖；

圖4是本發(fā)明實施例2所得生物活性玻璃-改性明膠復合水凝膠與小鼠骨髓間充質干細胞共培養(yǎng)24 h后的活死染色圖。

具體實施方式

下面結合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。

實施例1

（1）生物活性玻璃粉體的制備步驟：

生物活性玻璃粉體由有機模板結合溶膠-凝膠法制得，具體合成過程如下：先將40 g十二胺加入至250 ml去離子水和800 ml無水乙醇的混合溶液中，在40℃水浴鍋中攪拌至完全溶解；隨后加入202 ml正硅酸乙酯，攪拌30 min；加入24 ml磷酸三乙酯，攪拌30 min；加入137 g四水硝酸鈣；將得到的乳白色溶液繼續(xù)攪拌3 h；最后將玻璃溶膠離心得到白色沉淀，置于60℃干燥箱干燥24 h，再置于馬弗爐650℃燒結3 h ，即得生物活性玻璃粉體。

（2）改性明膠（取代度為40%）的制備步驟：

改性明膠由明膠側鏈的活性氨基與甲基丙烯酸酐反應所得，具體合成過程如下：先將2 g明膠加入至20 ml磷酸鹽緩沖溶液中，在60℃恒溫水浴鍋中攪拌，制成10%明膠溶液；待明膠完全溶解，加入0.25 ml甲基丙烯酸酐，繼續(xù)反應4 h；反應完后轉至40 ℃恒溫水浴鍋中，加入40 ml磷酸鹽緩沖溶液稀釋終止反應，繼續(xù)攪拌30 min；隨后轉移至12k的透析袋中透析7 d，以除去溶液中未反應的甲基丙烯酸酐和無機鹽；最后將溶液置于-80℃冰箱中預凍，冷凍干燥后得到改性明膠（取代度為 40%）。

（3）生物活性玻璃-改性明膠復合水凝膠具體合成過程如下：先將1 g改性明膠（取代度為40%）和0.01 g光引發(fā)劑IRGACURE 2959加入至10 ml磷酸鹽緩沖溶液中，在 60℃恒溫水浴鍋中攪拌至完全溶解；隨后加入0.1 g生物活性玻璃粉體，超聲分散30 min，磁力攪拌4 h ，使生物活性玻璃均勻分散在溶液中；最后將混合漿料加入至聚四氟乙烯模具中，在365 nm、5 mW/cm²的紫外光照射20 min，得到生物活性玻璃-改性明膠復合水凝膠。所得復合水凝膠在磷酸鹽緩沖溶液中溶脹24 h以除去未反應的單體和光引發(fā)劑。

實施例2

（1）生物活性玻璃粉體的制備步驟：

生物活性玻璃粉體由有機模板結合溶膠-凝膠法制得，具體合成過程如下：先將4 g十二胺加入至25 ml去離子水和80 ml無水乙醇的混合溶液中，在40℃水浴鍋中攪拌至完全溶解；隨后加入20.2 ml正硅酸乙酯，攪拌30 min；加入2.4 ml 磷酸三乙酯，攪拌30 min；加入13.7 g四水硝酸鈣；將得到的乳白色溶液繼續(xù)攪拌3 h；最后將玻璃溶膠離心得到白色沉淀，置于60℃干燥箱干燥24 h，再置于馬弗爐650℃燒結5 h，即得生物活性玻璃粉體。

（2）改性明膠（取代度為60%）的制備步驟：

改性明膠由明膠側鏈的活性氨基與甲基丙烯酸酐反應所得，具體合成過程如下：先將20 g明膠加入至200 ml磷酸鹽緩沖溶液中，在60℃恒溫水浴鍋中攪拌，制成10%明膠溶液；待明膠完全溶解，加入10 ml甲基丙烯酸酐，繼續(xù)反應4 h；反應完后轉至40℃恒溫水浴鍋中，加入500 ml磷酸鹽緩沖溶液稀釋終止反應，繼續(xù)攪拌30 min；隨后轉移至12k的透析袋中透析7 d，以除去溶液中未反應的甲基丙烯酸酐和無機鹽；最后將溶液置于-80℃冰箱中預凍，冷凍干燥后得改性明膠（取代度為60%）。

（3）生物活性玻璃-改性明膠復合水凝膠具體合成過程如下：先將1 g改性明膠（取代度為60%）和0.05 g光引發(fā)劑IRGACURE 2959加入至10 ml磷酸鹽緩沖溶液中，在60℃ 恒溫水浴鍋中攪拌至完全溶解；隨后加入0.5 g生物活性玻璃粉體，超聲分散30 min，磁力攪拌4 h，使生物活性玻璃均勻分散在溶液中；最后將混合漿料加入至聚四氟乙烯模具中，在365 nm、5 mW/cm² 的紫外光照射10 min，得到生物活性玻璃-改性明膠復合水凝膠。所得復合水凝膠在磷酸鹽緩沖溶液中溶脹24 h以除去未反應的單體和光引發(fā)劑。

實施例3

（1）生物活性玻璃粉體的制備步驟：

生物活性玻璃粉體由有機模板結合溶膠-凝膠法制得，具體合成過程如下：先將8 g十二胺加入至50 ml去離子水和160 ml無水乙醇的混合溶液中，在40℃ 水浴鍋中攪拌至完全溶解；隨后加入40.4 ml正硅酸乙酯，攪拌30 min；加入4.8 ml磷酸三乙酯，攪拌30 min；加入27.4 g四水硝酸鈣；將得到的乳白色溶液繼續(xù)攪拌3 h；最后將玻璃溶膠離心得到白色沉淀，置于60℃干燥箱干燥24 h，再置于馬弗爐650℃ 燒結3 h，即得生物活性玻璃粉體。

（2）改性明膠（取代度為80%）的制備步驟：

改性明膠由明膠側鏈的活性氨基與甲基丙烯酸酐反應所得，具體合成過程如下：先將5 g明膠加入至50 ml磷酸鹽緩沖溶液中，在60℃恒溫水浴鍋中攪拌，制成10%明膠溶液；待明膠完全溶解，加入5 ml甲基丙烯酸酐，繼續(xù)反應4 h；反應完后轉至40℃恒溫水浴鍋中，加入100 ml磷酸鹽緩沖溶液稀釋終止反應，繼續(xù)攪拌30 min；隨后轉移至12k的透析袋中透析7 d，以除去溶液中未反應的甲基丙烯酸酐和無機鹽；最后將溶液置于-80℃冰箱中預凍，冷凍干燥后得改性明膠（取代度為80%）。

（3）生物活性玻璃-改性明膠復合水凝膠具體合成過程如下：先將1 g改性明膠（取代度為80%）和0.1 g光引發(fā)劑IRGACURE 2959加入至10 ml磷酸鹽緩沖溶液中，在60℃恒溫水浴鍋中攪拌至完全溶解；隨后加入1 g生物活性玻璃粉體，超聲分散30 min，磁力攪拌4 h，使生物活性玻璃均勻分散在溶液中；最后將混合漿料加入至聚四氟乙烯模具中，在365 nm、5 mW/cm² 的紫外光照射1 min，得到生物活性玻璃-改性明膠復合水凝膠。所得復合水凝膠在磷酸鹽緩沖溶液中溶脹24 h以除去未反應的單體和光引發(fā)劑。

對實施例1、2、3所得的生物活性玻璃-改性明膠復合水凝膠進行性能表征，所得掃描電鏡圖如圖1a、圖1b、圖1c、圖1d、圖1e、圖1f所示，三種生物活性玻璃-改性明膠復合水凝膠均呈現(xiàn)窩蜂狀的連通多孔結構，孔徑范圍為200-500 μm，且生物活性玻璃顆粒均勻嵌入在復合水凝膠的三維網絡中。圖2為實施例2所得生物活性玻璃-改性明膠復合水凝膠的紅外圖譜，其中a曲線為10%改性明膠的紅外譜圖，呈現(xiàn)出典型的明膠蛋白所特有的酰胺峰，其中包括在1702 cm^-1酰胺I帶的C=O 伸縮峰，在1540 cm^-1酰胺II帶的N-H伸縮振動峰。b曲線為生物活性玻璃的紅外圖譜，1091，802和474 cm^-1處分別為生物活性玻璃中典型的Si-O-Si非對稱伸縮振動峰，Si-O的對稱伸縮振動峰以及Si-O-Si的對稱彎曲振動峰。c曲線為復合水凝膠的紅外圖譜，同時出現(xiàn)生物活性玻璃和改性明膠的特征峰，可證明復合水凝膠中同時存在生物活性玻璃和改性明膠。其它實施例的生物活性玻璃-改性明膠復合水凝膠的紅外圖譜與圖2相似，均能證明復合水凝膠中同時存在生物活性玻璃和改性明膠。圖3顯示實施例1、2、3的生物活性玻璃-改性明膠復合水凝膠均具有較高的含水率（80%以上），可保證營養(yǎng)物質和代謝廢物的運輸。圖4為小鼠骨髓間充質干細胞在實施例2的生物活性玻璃-改性明膠復合水凝膠培養(yǎng)24 h的活死染色圖，可見細胞能在水凝膠表面黏附，呈梭形狀，具有較好的細胞活力。其它實施例的生物活性玻璃-改性明膠復合水凝膠的活死染色情況與實施例2相似，均可見細胞能在水凝膠表面黏附，呈梭形狀，具有較好的細胞活力。