本發明涉及一種生物治療黑色素瘤的藥物及其制備方法。
背景技術：
黑色素瘤來源于黑色素細胞，是一種常見的惡性體表腫瘤，在所有體表腫瘤中惡性程度最高。由于環境污染，尤其是臭氧層破壞導致的UV輻射增加，黑色素瘤的發病率正在呈現逐年上升趨勢，全球每年約新增20萬黑色素瘤病例，且黑色素瘤發病年齡有年輕化的趨勢。黑色素瘤的疾病病程進展異常迅速，療效及預后極差，5年生存率僅約20%。因此探索及創制針對惡性黑色素瘤的新型藥物已迫在眉睫。
氧化石墨烯是一種新型的納米醫藥載體，其具有表面積大、載藥量大、副作用小、生產成本低廉等諸多優點。由于氧化石墨烯不溶于水及有機溶劑，因此解決其分散/溶解性成為將其應用于藥物載體的首先需要解決的問題。
由于人體存在細胞膜這一天然的生物學屏障，其限制了藥物分子、多肽蛋白質以及核酸等進入細胞的能力。然而，越來越多的研究表明需要在分子水平對某些疾病進行干預、治療，但是由于細胞膜這一天然生物學屏障的存在,導致了大分子如多肽蛋白質、核酸等進入細胞仍是一個亟待攻克的難題。
microRNA通過特異性結合靶mRNA，能夠對基因轉錄后的表達進行調控，同時還能夠影響生物體多種生理病理學進程。最近研究表明microRNA 參與調控癌癥細胞的增殖、凋亡、侵襲及轉移等。目前，已有研究表明，miR-33a與miR-199a對黑色素瘤的發生發展及侵襲轉移具有一定的抑制作用，但其抑制率尚不顯著，且尚未對其進行進一步研究，miR-33a與miR-199a是否可以對黑色素瘤發生協同抑制作用。
技術實現要素：
本發明所要解決的技術問題是制備一種同時搭載miR-33a與miR-199a對黑色素瘤進行生物治療的納米載體及其制備方法。
本研究擬利用已成熟的納米材料組裝技術構建“一箭多靶”多重響應安全高效的納米載藥復合體：將氧化石墨烯（GO）接枝殼聚糖（CS）形成氧化石墨烯-殼聚糖（GO-CS）納米復合體，增強氧化石墨烯的水溶性、穩定性及生物相容性，再將此復合體與細胞穿膜肽MPG多肽進行有機結合，合成GO-CS-MPG納米載藥復合體，進一步增強該載體通過細胞膜的穿膜效率，增大藥物或者其他生物活性物質進入細胞的能力，并對其進行結構及制備工藝的優化，然后搭載miR-33a與miR-199a，構建出GO-CS-MPG-miR-33a/miR-199a復合體。在此基礎上，一方面對載藥體進行細胞毒性研究，另一方面將載藥體轉染黑色素瘤A375細胞后進行增殖轉移以及相關動物學實驗研究，確定其對黑色素瘤的治療作用，并與單一治療及空白對照比較其治療有效率。
為了達到上述目的，本發明提供的技術方案為：
a.將鱗片石墨和KMnO4混合物（質量比為1: 3~1: 10）兩種固體混合均勻。將混合物放入燒杯，置于在恒溫水浴箱（35~42℃）中，攪拌下緩慢滴加濃H2SO4-濃H3PO4混酸（體積比為5: 1~10: 1），；再超聲乳化30~60分鐘，然后在50~100℃下反應12-72小時；反應結束后，產物在空氣之中自然冷卻至室溫。然后將產物與500~1000毫升冰水（0-4℃）混合，并在攪拌下緩慢滴加H2O2至不再產生氣泡為止；所得混合物經離心（1000r/min，5min）后，所得固體用稀鹽酸洗滌2-10次，再用蒸餾水洗至中性，所得固體用20~50毫升去離子水分散后放入冷凍干燥器中，冷凍干燥得氧化石墨烯粉末。
b.稱取10-1000mg氧化石墨烯粉末、10-1000mg4-二甲氨基吡啶（DMAP）、10-6000mg殼聚糖以及1-100ml二甲基亞砜（DMSO），混合，然后經超聲分散0.5-2h，混合均勻后，加入0.1-10g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC），加熱至50~100℃下反應12~72小時；反應結束后，所得混合物用去離子水洗2-10遍， 稀鹽酸洗2-10遍，最后用去離子水洗至中性，冷凍干燥，得氧化石墨烯-殼聚糖復合物（GO-CS）。
c.將10-1000mg氧化石墨烯-殼聚糖復合物用雙蒸水洗滌2-10遍，純化，加入10-3000mgMPG多肽，超聲分散0.5-2h，透析提純2-5遍，無酶水洗滌2-10遍，完全去除多余未反應的MPG多肽，再進行冷凍干燥，得氧化石墨烯-殼聚糖-MPG多肽（GO-CS-MPG）載體。
d.應用10-1000mg GO-CS-MPG載體搭載10-1000ug質粒miR-33a與miR-199a，然后進行細胞增殖以及動物實驗。
e.為了驗證該載體的生物安全性以及細胞毒性，對其進行了細胞毒性實驗。細胞毒性實驗結果表明，該載體在濃度為0-320mg/L時，其對細胞增殖是無毒性的。
f.為了驗證該藥物對黑色素瘤具有抑制作用，進行了細胞增殖實驗。空白的GO-CS-MPG載體，其對A375細胞的抑制作用并不明顯，不具有統計學意義。GO-CS-MPG搭載單個miR33a或者單個miR199a后，其對A375細胞存在一定的抑制作用，其抑制率分別為15-35%和15-30%。GO-CS-MPG同時搭載miR33a與miR199a后，抑制率約為40-65%；與搭載單個miR33a或者單個miR199a相比，聯合搭載miR33a與miR199a對A375細胞抑制作用更加明顯。
g.為了進一步驗證該藥物在體內對黑色素瘤具有抑制作用，進行了動物皮下成瘤實驗。實驗結果表明，接受GO-CS-MPG-miR-33a/miR-199a治療組的種植瘤體積明顯小于對照組，接受治療組腫瘤體積約為100-300mm3，而空白對照組約為300-600mm3，且治療組腫瘤的生長速率亦遠遠低于對照組。
具體實施方式
以下結合實施例旨在進一步說明本發明，而非限制本發明。
氧化石墨烯（GO）制備：稱取0.3g鱗片石墨和1.5g的KMnO4，將兩種固體混合均勻轉移至100mL的圓底燒瓶中，量取36mL的濃H2SO4和4mL的H3PO4混淆均勻，在冰水浴中逐漸滴加至圓底燒瓶，超聲處理之后，溶液呈現墨綠色，在50℃水浴中反應12h，滴加H2O2，溶液呈現亮黃色，至不再產生氣泡后，離心，用0.1M HCl洗滌3次，用蒸餾水洗至pH=7，冷凍干燥得氧化石墨烯粉末。
氧化石墨烯接枝殼聚糖：將0.20g氧化石墨烯、0.10g4-二甲氨基吡啶（DMAP）、0.75g 殼聚糖以及30mL二甲基亞砜（DMSO）一起加入50mL圓底燒瓶中，混勻后，加入0.5g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC），在60℃油浴中反應36h，所得混合溶液用水洗3遍，0.5M的HCl洗3遍，最后水洗至中性，冷凍干燥，得氧化石墨烯-殼聚糖復合物（GO-CS）。
氧化石墨烯-殼聚糖接枝MPG多肽：稱取200mg氧化石墨烯-殼聚糖復合物，高溫高壓滅菌蒸餾水洗滌3遍，純化，冷凍蒸干，嚴格無菌操作，得到的蒸干物中取100mg氧化石墨烯-殼聚糖復合物，溶于500ml無RNase酶水中，充分震蕩搖勻，在超聲波振蕩器中震蕩4-6h。然后加入500mg MPG多肽，37℃超聲乳化，靜置6h，然后透析提純，無酶水洗滌3遍，完全去除多余未反應的MPG多肽，再進行冷凍蒸干，得到完整的氧化石墨烯-殼聚糖-MPG多肽（GO-CS-MPG）載體。
將制備所得的100mg GO-CS-MPG搭載100ug質粒miR-33a與miR-199a，然后進行細胞毒性、細胞增殖以及動物實驗。
細胞毒性實驗結果表明，隨著GO-CS-MPG濃度的增高，其對細胞有一定的毒性作用。但即使當GO-CS-MPG濃度高達 320mg/L時，細胞的相對生存率仍然能夠達到81%。這充分表明GO-CS-MPG載體與細胞的生物相容性良好，細胞毒性作用極低。
細胞增殖實驗結果表明，空白的GO-CS-MPG載體，其對A375細胞的抑制作用并不明顯，不具有統計學意義。GO-CS-MPG搭載單個miR33a或者單個miR199a后，其對A375細胞存在一定的抑制作用，其抑制率分別為25.95%和24.47%。GO-CS-MPG搭載miR33a與miR199a后，其與空白對照組相比，對A375細胞有顯著抑制作用，抑制率約為51.02%；與搭載單個miR33a或者單個miR199a相比，聯合搭載miR33a與miR199a對A375細胞抑制作用更加明顯，說明GO-CS-MPG搭載miR33a與miR199a后，其對A375細胞起到了協同抑制作用，能夠更加有效的抑制A375細胞的生長。
動物皮下成瘤實驗結果表明，接受GO-CS-MPG-miR-33a/miR-199a治療組的種植瘤體積約為234.12 mm3，而對照組腫瘤體積約為453.35 mm3，治療組腫瘤體積明顯小于對照組，且治療組腫瘤的生長速率亦遠遠低于對照組。此結果表明，納米運載體GO-CS-MPG-miR-33a/miR-199a能夠顯著抑制裸鼠黑色素瘤A375細胞皮下種植瘤的生長。
本發明不限于實施例的范圍，凡是通過制備該類載體搭載一箭多靶或單靶抑癌基因治療黑色素瘤的藥物均在本發明保護范圍之內。