本發明涉及用于防御胞內勞森菌、豬肺炎支原體和豬圓環病毒的疫苗。在這個意義上，保護是指疫苗至少提供由胞內勞森菌、豬肺炎支原體和豬圓環病毒引起的負面影響的降低，這樣的負面影響為例如，組織損傷和/或臨床體征，如，下降的體重增加，腹瀉，咳嗽，打噴嚏等。本發明還涉及包含第一個容器、一個或多個其他容器和說明書的試劑盒，所述第一個容器中含有非活性的胞內勞森菌抗原，一個或多個其他容器中含有豬肺炎支原體和豬圓環病毒抗原，說明書用于混合胞內勞森菌、豬肺炎支原體和豬圓環病毒的抗原以配制一種適于全身接種的組合疫苗。許多動物(特別是豬)中的增生性腸病(PE或PPE，也稱為腸炎或回腸炎)呈現出未成熟隱窩上皮細胞(特別是在末端回腸中)粘膜增生的臨床體征和病理綜合征。可能受影響的腸的其他部位包括空腸、盲腸和結腸。斷奶和幼小的豬主要受到快速體重減輕和脫水的典型臨床表現的影響。豬的普通臨床疾病全世界普遍發生。該疾病一向與胞內曲狀細菌的存在相關，目前已知為胞內勞森菌。由細菌病原體豬肺炎支原體引起的豬支原體性肺炎是廣泛分布的豬慢性呼吸道疾病。尤其是幼仔豬易受這種非致命性疾病的攻擊。地方性動物病肺炎是導致飼料轉化差和生長受阻礙的慢性疾病。該疾病是高度傳染性的，并且通常通過直接接觸受感染呼吸道分泌物(例如，咳嗽/打噴嚏后的受感染液滴的形式)來傳播。這種疾病問題最大的后果在于易受所有種類的呼吸系統的繼發性感染的影響。例如，在美國，估計99％的養豬場受到感染。認為豬圓環病毒與幼豬中觀察到的斷奶后多系統消耗綜合征(PMWS)相關。在1991年，在加拿大，第一次遇到了這種疾病。1997年公開了臨床體征和病理學，并包括進行性消瘦、呼吸困難、呼吸急促以及偶發性黃疸和黃疸。豬圓環病毒是小的(17nm)二十面非包膜病毒，其含有環狀單鏈DNA基因組。PDNS(豬皮炎和腎病綜合征)是養豬場的另一個主要問題，其與PMWS大約在相同的時間出現，并且其也涉及豬圓環病毒。PDNS的特征是伴有出血的紅/棕圓形皮膚損傷，通常是在耳部、兩肋、腿部和大腿。關于PE，對抗胞內勞森菌的口服接種疫苗已經顯示出是一種在經濟上有效的措施，以控制回腸炎和更好地開發豬的遺傳生長潛能(PorcineProliferativeEnteropathyTechnicalManual3.0(豬增生性腸炎技術手冊3.0)，2006年7月；獲自BoehringerIngelheim)。此外，口服而非非腸道的疫苗接種將降低血液攜帶感染(如通過多次使用的針的PRRS)的傳播以及注射部位反應的減少和保留在畜體內的針。與單獨的疫苗接種相比，這將減少動物和人的應激、時間、勞動成本和精力(McOrist：“Ileitis-OnePathogen，SeveralDiseases”，IPVSIleitisSymposiuminHamburg，2004年6月28日)。通常了解減毒活疫苗方法的優勢是免疫的功效通常是相對良好的，因為宿主的免疫系統以更“自然”的方式暴露于生物體的所有抗原物質。特別地，對于胞內細菌劑，如胞內勞森菌，由于基于完全的和合適的T細胞的免疫應答，認為活的減毒疫苗方法給接種疫苗的動物給予了最好利用的保護。這與用于胞內細菌的亞基或殺滅疫苗類型相關的不定的差的免疫性相反。這對于專性胞內細菌(如，胞內勞森菌或衣原體(Chlamydia))也特別如此，這些胞內細菌在粘膜內引起致病的感染。研究表明目標胞內細菌完整的活減毒形式最好遞送至靶粘膜，它們需要作為完整的活細菌形式，以在靶粘膜中產生完全保護性的免疫應答，而且與使用部分細菌成分相比，它們在免疫上也是較好的。一般的了解是需要口服給予對抗胞內勞森菌的疫苗(參見上文中提到的TechnicalManual3.0)。這是基于如下的事實：身體抵抗回腸炎的基礎是小腸中的局部免疫力，這是細胞介導的免疫力和通過抗體(尤其是IgA)的局部防御的結果。根據目前的知識，血清抗體(IgG)不能給予任何保護，只是因為它們沒有到達腸腔。已經在研究中證明了口服疫苗接種產生細胞介導的免疫力，以及在腸道中局部產生IgA(Murtaugh，見Agrar-undNutztierpraxisAktuell，Ausgabe9，Juni2004；和Hyland等，見VeterinaryImmunologyandImmunopathology102(2004)329-338)。相反，肌內給藥沒有產生保護。此外，緊次于對抗胞內細菌的成功疫苗必須誘導細胞介導的免疫力以及局部抗體的產生的一般性了解，本領域技術人員知道實際上僅有非常低百分比的口服攝入的抗原被腸上皮細胞吸收，并且胞內勞森菌摻入細胞中是通過細菌啟動的活性過程。因此，滅活的疫苗將給腸提供不充足的免疫原性抗原(Haesebrouck等，見VeterinaryMicrobiology100(2004)255-268)。這是為什么認為只有減毒的活疫苗在腸細胞中誘導足夠的細胞介導的保護(參見上文中提到的TechnicalManual3.0)。目前，市場上只有一種防御胞內勞森菌的疫苗，即，由BoehringerIngelheim銷售的Ileitis。這種疫苗是真正的用于口服給藥的活疫苗。迄今為止，現有技術中已經提出了胞內勞森菌的組合疫苗。然而，實際上這些組合中沒有多少的功效得到了測試。這種情況的原因在于通常理解為抗原與胞內勞森菌抗原的組合只有當勞森菌抗原作為活(減毒)細胞提供時才能獲得成功的保護。在這點上，我們參考WO2005/011731，其也提出了基于胞內勞森菌的所有種類的組合疫苗。然而，關于該專利申請的說明書和權利要求結構，受讓人(BoehringerIngelheim)似乎確信只有當勞森菌抗原以活細胞形式存在時才能期望組合疫苗具有合理的成功機會。這對于WO2006/099561同樣如此，受讓人也是BoehringerIngelheim。實際上，基于普通常識，這是顯而易見的想法。然而，活抗原的組合沒有直接給出抗原和制造這樣的活組合疫苗的困難性之間沖突的高可能性。本發明的目的是提供對抗胞內勞森菌，并且同時對抗一種或多種其他豬病原體的疫苗。為此，發明了包含組合的胞內勞森菌、豬肺炎支原體和豬圓環病毒的非活性抗原和藥物學上可接受載體的疫苗。令人驚訝地，與長期以來怎樣對抗胞內勞森菌和組合疫苗應當包含活胞內勞森菌抗原的一般性了解相反，發現了通過使用非活性胞內勞森菌抗原，結合來自豬肺炎支原體和豬圓環病毒的抗原，可以提供防御胞內勞森菌、豬肺炎支原體和豬圓環病毒的疫苗。通常，可以通過使用本領域已知的方法制造疫苗，這些方法基本上包括將抗原與載體混合。通常，將抗原與攜帶該抗原的介質混合，該介質常常被簡單地稱為載體或“藥物學上可接受的載體”。這樣的載體可以是任何溶劑、分散介質、敷料、抗細菌和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等，這些載體在生理上與靶動物相容并且是靶動物可接受的，例如，通過無菌制得。這樣的攜帶介質的一些實例是水、鹽水、磷酸鹽緩沖的鹽水、細菌培養物流體、葡萄糖、甘油、乙醇等，及其組合。它們可以提供液體、半固體和固體劑型，這取決于預期的給藥方式。如通常所知的，攜帶介質的存在不是疫苗功效必需的，但可以明顯簡化抗原的劑量和給藥。同樣，疫苗的制造可以在工業環境中進行，而且，抗原可以就地(即，在獸醫處、農場等)與其他疫苗成分混合，例如，在實際給藥于動物之前(即刻)進行混合。在疫苗中，抗原應當以免疫有效量存在，即，能夠刺激靶動物的免疫系統足以至少降低用野生型微生物激發后接種的不利作用的含量。任選地，可以加入其他物質，如佐劑、穩定劑、粘度調節劑或其他成分，這取決于打算的用途或需要的疫苗特性。在一個實施方案中，疫苗是適于全身給藥的形式。令申請人驚訝的是發現了全身性給藥根據本發明的組合疫苗時，即，以達到身體循環系統(包括心血管和淋巴系統)的方式，可以誘導對抗胞內勞森菌的保護，這種保護與使用(單種)活疫苗Ileitis(根據相應的說明書給藥)提供的保護相當或甚至有提高，因此影響作為整體的身體，而不是特定部位，如胃腸道。例如，可以通過將抗原給予肌肉組織中(肌內)、真皮中(皮內)、皮膚下(皮下)、粘膜下(膜下)、靜脈中(靜脈內)等來進行全身給藥。對于全身性疫苗接種，許多形式是合適的，特別是液體制劑(含有溶解的、乳化的或懸浮的抗原)，以及固體制劑，如植入物或介質形式，如用于抗原懸浮于液體中的固體載體。全身性疫苗接種，特別是非腸道疫苗接種(即，不通過消化道)，和用于全身性疫苗接種的合適疫苗(物理)形式已經知道有200多年了。該實施方案的優勢在于可以使用目前對于給藥豬肺炎支原體或豬圓環病毒抗原標準的相同給藥方式，即，非腸道，特別是通過肌內或皮內注射(在后一種情況中，通常是無針的)。在一個實施方案中，從含有碳水化合物的組合物獲得非活性的胞內勞森菌抗原，該碳水化合物在活的胞內勞森菌中也能找到，與這些細胞的外細胞膜相連。出乎意料地，通過在組合疫苗中使用胞內勞森菌細胞的含碳水化合物部分(即，含有活胞內勞森菌細胞中存在的碳水化合物的組合物)，可以提供對抗PE的良好保護。注意到為了配制疫苗，可以使用直接獲自胞內勞森菌細胞的含碳水化合物組合物，也可以使用源自其的組合物，如原始組合物或提取物的稀釋物或濃縮物，一種或多種純化成分等。注意到已經報道了胞內勞森菌細胞的亞基作為疫苗中的抗原，用于保護以對抗這種細菌。然而，這些主要是重組蛋白，并且迄今為止沒有一個證明了能夠提供良好的保護。還注意到含有碳水化合物的組合物從Kroll等是已知的(ClinicalandDiagnosticLaboratoryImmunology，2005年6月，693-699)，其中該碳水化合物在活的胞內勞森菌中也能找到，與這些細胞的外細胞膜相連。然而，這種組合物是用于診斷的。出于如上所述的原因，尚未測得其為保護性抗原。在一個實施方案中，含有碳水化合物的組合物是由胞內勞森菌細菌的殺滅產生的材料。已經發現了非常方便的提供用于根據本發明使用的碳水化合物的方式是簡單地殺滅胞內勞森菌細胞并使用由此產生的材料作為碳水化合物的來源。從活細胞提取碳水化合物在理論上也是可行的(類似于通過除去細胞壁形成活的形骸細胞)，但需要更精密復雜的并因此更昂貴的技術。該材料可以作為整體使用，例如，胞內勞森菌細胞的全細胞懸浮液或裂解物，或可以從該材料中純化或甚至分離出碳水化合物。可以通過使用相對簡單的本領域已知的技術來進行這種方法。在優選的實施方案中，含有碳水化合物的組合物含有殺滅的胞內勞森菌細菌的完整細胞。已經證明了這是最方便用于提供碳水化合物作為疫苗中的抗原的方式。此外，甚至可進一步提高疫苗的功效，可能是因為這種將抗原給予靶動物的免疫系統的方式可更好地模擬碳水化合物的天然環境。在一個實施方案中，疫苗包含水包油型佐劑，其含有亞微米大小的油滴。通常，佐劑是非特異性的免疫刺激劑。原則上，可以將在免疫事件的級聯中能夠促進或擴大特定的過程并最終導致更好免疫應答(即，對抗原的綜合身體應答，特別是通過淋巴細胞介導的應答，并且通常涉及特定抗體或之前敏化的淋巴細胞對抗原的識別)的每種物質定義為佐劑。已經顯示出使用含有亞微米大小油滴的水包油型佐劑可提供非常好的對抗胞內勞森菌的保護。實際上，水包油型佐劑這樣結合非活性抗原的應用是常見的。然而，通常知道當油滴直徑大時獲得最好的免疫刺激特性。特別是，當認為安全性是重要問題時，特別地使用具有1微米以下直徑的油滴。在這種情況下，可以使用小的液滴，因為已知這些引起較少的組織損傷、臨床病征等。然而，對于通過全身性疫苗接種獲得腸道相關疾病保護(如本發明中的情況)來說，可以選擇大的液滴，因為期望免疫應答必須得到顯著加強。相反，我們發現了對于對抗胞內勞森菌的保護，在組合物中使用小的油滴可提供非常好的結果。在更優選的實施方案中，佐劑包含生物可降解油的液滴和礦物油的液滴，生物可降解油的液滴的平均大小不同于礦物油的液滴的平均大小。已經顯示出使用生物可降解油和礦物油的混合物對于功效和安全性提供了非常好的結果。除此之外，組合物的穩定性非常高，這是重要的經濟優勢。已經證明了穩定性是非常好的，特別是當生物可降解油液滴或礦物油液滴的平均(容重)大小小于500nm(優選大約400nm)時。本發明還涉及包含第一個容器、一個或多個其他容器和說明書的試劑盒，所述第一個容器中含有非活性的胞內勞森菌抗原，一個或多個其他容器中含有豬肺炎支原體和豬圓環病毒抗原，說明書用于混合胞內勞森菌、豬肺炎支原體和豬圓環病毒的抗原以配制一種適于全身接種的組合疫苗。在這個實施方案中，在還含有其他抗原(如本領域所知的，其在一個容器中混合，或甚至存在于形成試劑盒內含物一部分的分開的容器中)的試劑盒中提供了分開的用于胞內勞森菌抗原的容器。該實施方案的優勢在于勞森菌抗原可以防止與其他抗原的相互作用，直至就在疫苗給藥之前。此外，因為抗原在分開的容器中，生產損耗較低。在一個實施方案中，豬肺炎支原體和豬圓環病毒抗原包含在一個容器中，配制于水包油型佐劑中。在這個實施方案中，可以恰在使用前將勞森菌抗原與其他的抗原混合。基于以下的實施例將進一步解釋本發明。實施例1描述了獲得基本上無蛋白質的含碳水化合物的組合物的方法以及使用該組合物制得的疫苗。實施例2描述了一個實驗，其中將非活性的胞內勞森菌疫苗與目前市場上的疫苗和含有胞內勞森菌亞基蛋白的實驗疫苗進行比較。實施例3描述了一個實驗，其中將兩種不同的包含非活性胞內勞森菌抗原的疫苗與目前市場上的活疫苗進行比較。實施例1在這個實施例中，描述了獲得基本上無蛋白質的與胞內勞森菌細胞的外細胞膜相連的碳水化合物組合物的方法以及可以使用這種組合物制得的疫苗。通常，碳水化合物是含有碳、氫和氧的有機化合物，碳、氫和氧的比例通常為1:2:1。碳水化合物的實例是糖(糖類)、淀粉、纖維素和樹膠。通常，它們作為動物膳食中的主要能源。胞內勞森菌是革蘭氏陰性細菌，因此其含有不完全是由磷脂和蛋白質構成的外膜，而是外膜還含有碳水化合物，特別是多糖(通常是如脂多糖、脂寡糖或甚至非脂多糖這樣的多糖)。用于疫苗制備的碳水化合物級分取二十微升含有濃度為3.7E8(＝3.7×108)細胞/ml的胞內勞森菌細胞的緩沖水(0.04MPBS，磷酸鹽緩沖的鹽水)。通過將它們在100℃下保持10分鐘來裂解細胞。將0.04MPBS中的蛋白酶K(10mg/ml)加入，至1.7mg/ml的終濃度。將該混合物在60℃下培養60分鐘，以降解所有蛋白質并保持碳水化合物完整。隨后，將混合物在100℃下培養10分鐘，以滅活蛋白酶K。將所得到的材料在2-8℃下儲存，直至進一步使用，所得到的材料是含有碳水化合物的組合物，特別是含有存在于活的胞內勞森菌細菌中的與其外細胞膜相連的碳水化合物(參見以下的段落)。將組合物配制于Diluvacforte佐劑中。這種佐劑(參閱EP0382271)包括7.5％重量的具有大約400nm的平均容重大小的醋酸維生素E液滴，液滴懸浮于水中，并用0.5％重量的吐溫80(聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯)穩定。每微菌升疫苗含有從1.2E8胞內勞森菌細胞提取的材料。勞森菌碳水化合物抗原的免疫沉淀根據標準程序，在室溫下，用飽和的Na2SO4，將兩批對抗胞內勞森菌完整細胞產生的單克隆抗體(MoAb’s)進行沉淀。通過離心(10.000g，10分鐘)將沉淀物沉淀。用20％Na2SO4洗滌沉淀物，并重懸浮于0.04MPBS中。根據制造商的手冊，用0.1MNaPO4(pH7.4)預先洗滌酪氨酰(Tylosyl)激活的Dynal珠粒(DynaBeads，DK)。從每批MoAb’s取出140μg，并加入到2E8預先洗滌過的珠粒中，并在37℃下培養過夜。通過離心沉淀珠粒并通過抽吸上清液來除去未結合的MoAb’s。分光光度計測量顯示出20至35％加入的MoAb’s已經與珠粒結合。將0.04MPBS中的兩批1ml胞內勞森菌細胞(3.7E8/ml)超聲波處理1分鐘。將所得到的細胞裂解物加入到酪氨酰激活的珠粒-單克隆復合物中，并在4℃下培養過夜。用0.1MNaPO4(pH7.4)將酪氨酰激活的珠粒-單克隆復合物洗滌三次。以連續的方式，將珠粒在0.5ml的0.04MPBS中的8M脲(E1)；0.5ml10mM甘氨酸pH2.5(E2)；和0.5ml50mMHCl(E3)中洗滌來洗脫結合的化合物。洗脫后，用100μl和200μl1MTris/HCl(pH8.0)中和E2和E3。從每個步驟取樣并裝載于SDS-PAGE凝膠上。使用考馬斯亮藍(CBB)和銀染將凝膠染色或弄污。使用如上所述的相同MoAb’s來產生斑點。凝膠和斑點的觀察顯示出MoAb’s識別具有21和24kDa表觀分子量的條帶，這些條帶在CBB凝膠上未看到，但在銀染的凝膠上看到了。此外，確定了結合MoAb’s的細胞級分是蛋白酶K抗性的。因此，基于這些結果，可以推斷出該級分含有碳水化合物(即，所有蛋白被裂解了，并且超聲波處理的DNA級分在銀染中沒有作為清晰的條帶顯示出來)，并且碳水化合物與胞內勞森菌的外細胞膜(即：對抗這種級分產生的MoAb’s也識別完整的胞內勞森菌細胞)相連(即，形成其的一部分或與其結合)。已知胞內勞森菌是革蘭氏陰性細菌的事實，因此認為碳水化合物組合物包括多糖。實施例2進行該實施例來測試在疫苗中配制碳水化合物抗原的方便方法，即，通過殺滅的完整細胞(也稱為菌苗)。作為對照，使用了可購得的疫苗ileitis和包含蛋白質亞基的實驗亞基疫苗。接著，將未接種疫苗的動物用作對照。實施例2的實驗設計如下制得滅活的完整細胞疫苗。收集源自患有PPE的豬的腸的活胞內勞森菌細胞。用0.01％BPL(β-丙內酯)將細胞滅活。所得到的材料，在本發明的意義上固有地是非活性的含有碳水化合物的組合物(特別是因為它含有存在于活胞內勞森菌細菌中的與外細胞膜相連的碳水化合物)，將其以大約2.8×108細胞/ml疫苗的濃度配制于Diluvacforte佐劑中(參見實施例1)。亞基疫苗含有重組P1/2和P4，如從EP1219711中所知的(分別為19/21和37kDa蛋白)，并且該重組蛋白通過基因5074、4320和5464來表達，如WO2005/070958中所述。將蛋白質配制于Diluvacforte佐劑中。疫苗含有大約50μg每種蛋白/微升。使用了四十六周大的SPF豬。將豬分成4組，每組十頭豬。根據制造商的說明，組1口服接種一次(T＝0時)2ml“ileitis”(BoehringerIngelheim)。組2和3肌內接種兩次(在T＝0和T＝4周時)，分別接種2ml如上所述的滅活勞森菌完整細胞疫苗和重組亞基組合疫苗。組4留著作為未接種的對照。在T＝6周時，所有的豬用均質的胞內勞森菌感染的粘膜口服激發。隨后，每日觀察所有豬的豬增生性腸病(PPE)的臨床病征。在激發之前和之后，以規則的時間，從豬取樣血清血液(用于血清學)和糞便(用于PCR)。在T＝9周時，將所有豬安樂死并進行尸檢。獲取回腸的組織學樣品并通過顯微鏡進行檢查。從感染的粘膜制備激發接種物：將500克感染的粘膜(從感染的腸刮下來的)融化并與500ml生理鹽水混合。將該混合物在通用勻漿器中在冰上全速均質一分鐘。在T＝6周時，用20ml激發接種物口服激發所有豬。在T＝0、4、6、7、8和9w時，獲取每只豬的糞便樣品(克含量)和血清血樣并冷凍儲存直至測試。在定量PCR(Q-PCR)中測試糞便樣品并表示為以皮克(pg)計的量的對數。在常用的IFT測試(檢測對抗血清中完整胞內勞森菌細菌的抗體的免疫熒光抗體測試)中測試血清樣品。對于組織學評分，獲取回腸的相關樣品，在4％緩沖的福爾馬林中固定，常規包埋并切片。用蘇木精-曙紅(HE染色)和使用抗胞內勞森菌單克隆抗體的免疫組織化學染色(IHC染色)將這些切片染色。通過顯微鏡檢查這些切片。組織學評分如下：HE染色：IHC染色：單獨記錄每只豬的所有數據。按照激發后不同參數的陽性動物的平均值來計算每組的分數。使用非參數Mann-WhitneyU測試來評價統計學顯著性(雙側檢驗的并將顯著性水平設定為0.05)。實施例2的結果血清學在第一次接種之前，測試IFT抗體滴度時，所有豬是血清反應陰性的。用完整細胞菌苗(組2)接種疫苗后，豬產生了高IFT抗體滴度，而對照和接種亞基疫苗的豬仍然是陰性的，直至激發(表1)。接種Enterisol的豬(組1)中的兩只產生了中等的IFT滴度，而該組中的所有其他豬保持血清反應陰性。激發后，所有豬產生了高IFT抗體滴度。表1中描述了平均結果(使用所用的稀釋度，1.0是下側的檢測水平)。表1.接種和激發后豬血清的平均IFT抗體滴度(2log)組T＝0周T＝4周T＝6周T＝9周1<1.01.11.7>11.42<1.03.7>11.8>12.03<1.0<1.0<1.0>11.64<1.0<1.0<1.0>12.0糞便樣品的實時PCR在激發之前，所有糞便樣品是陰性的。激發后，在所有組中發現了陽性反應。組1(p＝0.02)、組2(p＝0.01)和組3(p＝0.03)與對照相比較，具有明顯較低的泄出水平。表2中給出了激發后的概述。表2.接種和激發后糞便樣品的PCR平均結果(logpg)組T＝6周T＝7周T＝8周T＝9周激發后總計101.33.61.86.3200.82.81.95.5300.53.82.05.9400.84.94.910.0組織學分數組2具有最低的組織學HE分數(p＝0.05)、IHC分數(p＝0.08)和總的組織學分數(p＝0.08)。其他組具有較高的分數，并且與對照組沒有明顯差異。參見表3。表3.回腸的平均組織學分數組HE分數IHC分數總分11.81.53.321.31.52.731.81.63.442.42.34.7關于實施例2的結論從結果可以推斷出非活性胞內勞森菌完整細胞疫苗的全身性給藥誘導了至少部分保護，該疫苗固有地含有還發現與活胞內勞森菌細胞的外膜相連的碳水化合物。與對照相比，研究的所有參數和組織學分數明顯或接近明顯地更好。實施例3進行該實驗來測試疫苗，該疫苗基本上不含蛋白質，并包含作為抗原的含碳水化合物組合物。除了殺滅的胞內勞森菌的完整細胞外，測試的第二種疫苗還含有豬肺炎支原體和豬圓環病毒的抗原(“組合”疫苗)。作為對照，使用了可購得的回腸炎疫苗。接著，將未接種的動物用作第二個對照。實施例3的實驗設計按照實施例1中所述的，獲得基于基本上無蛋白質的含碳水化合物組合物的疫苗。實驗組合疫苗含有水平為1.7×108細胞/ml的滅活胞內勞森菌完整細胞抗原(參見實施例2，所用的提供滅活細菌的方法)。接著，其含有滅活的PCV-2抗原(20μgORF2編碼的PCV2蛋白/ml；蛋白是在桿狀病毒表達系統中表達的，如本領域所知的，例如，如WO2007/028823中所述的)和滅活的豬肺炎支原體抗原(如從可購得的疫苗Porcilis得知的相同劑量的相同抗原，獲自Intervet，Boxmeer，荷蘭)。將抗原配制于雙乳化佐劑“X”中。這種佐劑是5體積份佐劑“A”和1體積份佐劑“B”的混合物。佐劑“A”由具有大約1μm的平均(容重)大小的礦物油滴組成，用水中的吐溫80穩定。佐劑“A”包含25重量％的礦物油和1重量％的吐溫，剩余為水。佐劑“B”由具有400nm的大致平均(容重)大小的生物可降解醋酸維生素E滴組成，也是用吐溫80穩定。佐劑“B”包含15重量％的醋酸維生素E和6重量％的吐溫80，剩余是水。使用了六十四只3天大的SPF仔豬。將豬分成四組14頭仔豬和一組8頭仔豬(組4)。組1在3天大時靜脈內接種2ml組合疫苗，接著在25天大時第二次接種。組2在25天大時肌內接種一次2ml組合疫苗。根據處方，組3在25天大時口服接種2mlileitis(BoehringerIngelheim)。組4在3天和25天大時肌內接種2ml非蛋白碳水化合物疫苗。組5留下未接種，作為激發對照組。在46天大時，用均質的感染的粘膜口服激發所有的豬。隨后，每日觀察所有豬的豬增生性腸病(PPE)的臨床病征。在激發之前和之后的規則時間，從豬獲取血清血液和糞便樣品，分別用于血清學和PCR。在68天大時，將所有豬安樂死并進行尸檢。對回腸進行組織學檢查。實驗設計中的其他情況與實施例2中所述的相同，除非另外指出。實施例3的結果血清學1-勞森菌在第一次接種前，所有豬對IFT勞森菌抗體滴定是血清反應陰性的。用組合疫苗(組1和組2)和非蛋白質碳水化合物疫苗(組4)接種后，許多豬產生了IFT抗體滴度，而對照和接種Enterisol的豬仍然是血清反應陰性的，直至激發。激發后，所有豬(除了Enterisol組中的兩只)產生了IFT抗體滴定。對于所獲得的平均值的概述，參見表4(與實施例2比較時，由于較高的稀釋，檢測水平為4.0)。表4.接種和激發后豬血清的平均IFT勞森菌抗體滴度(2log)組T＝3天T＝25天T＝46天T＝67天1<4.0<4.07.910.32<4.0<4.04.89.83<4.0<4.0<4.08.54<4.0<4.06.910.65<4.0<4.0<4.09.02-豬肺炎支原體對于Mhyo，在實驗開始時以及加強那天(25天大)，所有豬對Mhyo是血清反應陰性的。加強接種后，組1產生了高Mhyo抗體滴度，與用可購得的引發-加強疫苗Porcilis獲得的那些水平相同。在以下的表5中給出了結果。顯然，在這些情況(肌內給藥)下，只有當給予加強疫苗接種時，在46天時的抗體滴度才高于檢測水平(對于所用的方法為6.0)。然而，已知使用Mhyo抗原的單次短暫接種可以提供足夠的保護，特別是當皮內給藥時(參見，例如，WO2007/103042)。表5.接種后豬血清的平均IFTMhyo抗體滴度(2log)組T＝3天T＝25天T＝46天1低于檢測水平低于檢測水平8.32低于檢測水平低于檢測水平低于檢測水平5低于檢測水平低于檢測水平低于檢測水平3-豬圓環病毒對于PCV，3天大的仔豬具有高的母豬衍生的PCV抗體滴度。在強化那天(25天大)，與組2和對照組相比，接種的豬(組1)具有相似的滴度。與3天大的滴度相比，25天大時的PCV滴度略低。接種后，25天大時，組1(在第3天和25天時接種2次)和組2(25天時接種一次)的滴度保持在高水平，而對照仔豬顯示出正常的母豬衍生抗體的降低。所獲得的PCV滴度與用含有相同抗原的單次疫苗(例如，Intervet’sCircumventPCV，該疫苗提供非常好的對抗PCV的保護)獲得的滴度相當。對于平均值的綜述，參見下表。表6.接種后豬血清的平均IFTPCV抗體滴度(2log)組T＝3天T＝25天T＝46天111.59.610.1212.19.510.8510.99.17.0糞便樣品的實時PCR激發后三周，與組3和組5相比，組1、組2和組4的豬在其糞便中具有較少的勞森菌(DNA)。僅有組1和組3(Enterisol)之間以及組4和組3之間的差異是統計學顯著的(p<0.05，Mann-WhitneyU測試)。對于平均結果，參見表7。表7.接種和激發后糞便樣品的平均PCR結果(logpg)組平均值11.021.232.040.651.8組織學分數與組3和組5的組織學分數相比，組1和組4的明顯較低(p<0.05，雙邊Mann-WhitneyU測試(參見表8))。證實患有PPE的豬的數量為：組1，2/13，組2，6/12，組3，12/14，組4，2/7和對照組5，12/14。與組3和組5相比，組1和組4具有明顯較低的PPE發病率(p<0.05，雙邊Fischers’精確測試)。表8.回腸的平均組織學分數組HE分數IHC分數總分10.40.61.020.70.71.431.61.43.040.40.40.851.91.53.4實施例3的結論從結果可以推斷出碳水化合物外細胞膜抗原給予了相對良好的對抗回腸炎的保護。還發現了完整勞森菌細胞菌苗是在對抗回腸炎的疫苗中提供碳水化合物抗原的好方法。此外，已知的情況是：對于Mhyo和PCV抗體的滴度，組合疫苗提供了與用可購得的適于對抗這些微生物的單種疫苗可獲得的水平相當的水平，已經證明了含有非活性胞內勞森菌抗原并結合Mhyo和PCV抗原的組合疫苗適于對抗胞內勞森菌以及豬肺炎支原體和豬圓環病毒。當前第1頁1 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