一種增強免疫力的藥物組合物及其應(yīng)用的制作方法

本發(fā)明屬于藥物組合物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說，涉及一種增強免疫力的藥物組合物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

中醫(yī)藥用于養(yǎng)生治病已有二千多年的歷史。伴隨著社會的進步、競爭的激烈，如今的人們工作壓力更大，導致人體體質(zhì)下降，人體的疫力也同樣的下降，處于一種亞健康狀態(tài)，因此人們對提高機體免疫力的產(chǎn)品需求量與日俱增。而增強機體免疫力的產(chǎn)品已經(jīng)不滿足于生化類產(chǎn)品，更多地青睞于植物和中藥提取物的產(chǎn)品。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供一種增強免疫力的藥物組合物及其應(yīng)用，產(chǎn)品具有增強人體免疫力的功效。

本發(fā)明目的是這樣實現(xiàn)的：一種增強免疫力的藥物組合物，其關(guān)鍵在于由以下重量份數(shù)的原料組成：

天麻340～360份、

靈芝340～360份、

酸棗仁600～650份、

柏子仁250～300份。

上述原料中還添加有輔料，該輔料由150～155份乳糖、58～62份甘露醇、58～62份微晶纖維素、22～27份羧甲基淀粉鈉和2～3份硬脂酸鎂組成，所述原料和輔料混合最終制成片劑。

上述原料由350份天麻、350份靈芝、625份酸棗仁、275份柏子仁組成，所述輔料由152.5份乳糖、60份甘露醇、60份微晶纖維素、25份羧甲基淀粉鈉和2.5份硬脂酸鎂組成。

上述的一種增強免疫力的藥物組合物的制片方法由以下步驟組成：先將天麻切片，并將酸棗仁炒制，然后將天麻、靈芝、酸棗仁和柏子仁按重量份數(shù)混合，并加入10倍原料總重量的水，并熬煮提取兩次，兩次的濾液濃縮至相對密度為1.2～1.3后，于65～75℃下真空干燥成干浸膏，粉碎成浸膏粉，按重量份數(shù)將輔料與浸膏粉混合均勻后，制粒干燥，最后壓片得到片劑。

一種增強免疫力的藥物組合物在制備用于增強免疫力的藥物中的應(yīng)用。

一、本發(fā)明原料公知的藥理作用如下：

1、天麻：塊莖入藥，味甘性平，歸肝經(jīng)，天麻的化學成分包括酚性化合物及其苷類(天麻苷)、甾醇和有機酸類(琥珀酸、β-谷甾醇、檸檬酸、棕櫚酸等)、多糖類及其他成分；具有息風止痙，平肝陽，祛風通絡(luò)的功效。

2、靈芝：真菌的干燥子實體入藥，味淡性溫，歸心、肺、肝、腎經(jīng)，靈芝的主要生理活性成分有靈芝多糖、三萜類化合物、蛋白質(zhì)、多肽、核苷類、呋喃類、甾醇、生物堿和氨基酸等。而其中的靈芝多糖、三萜類化合物和蛋白質(zhì)是靈芝的主要活性成分；具有益氣血、安心神、健脾胃的功效。

3、酸棗仁：成熟種子入藥，味甘、酸，性平，歸肝膽心經(jīng)，酸棗仁的化學成分主要包括脂肪酸類、皂苷類、黃酮類、生物堿以及氨基酸等；具有補肝、寧心、斂汗、生津的功效。

4、柏子仁：成熟種子入藥，味甘性平，歸心肝脾經(jīng)，柏子仁含大量脂肪油并含少量的揮發(fā)油、皂苷、植物甾醇、維生素A、蛋白質(zhì)等。具有養(yǎng)心安神、斂汗、潤腸通便的功效。

二、樣品放置條件：溫度37±0.2℃，相對濕度75±0.2％，密閉保存0天、l個月、2個月、3個月各測1次，共測4次。結(jié)果分別如圖1和2和3和4所示：由圖1～4可見，本申請制備的片劑于密閉、陰涼干燥處放置，保質(zhì)期為24個月，色、味、形狀和狀態(tài)等均正常。

三、天麻、靈芝、酸棗仁和柏子仁配伍具有增強人體免疫力的作用。

1、材料和方法：

1.1樣品：本申請制片方法得到的片劑，樣品核準凈含量為0.5g/片×60片/瓶。人體推薦劑量為：每日2.0/60kgBW，去包衣顆粒推薦劑量為：每日1.94g/60kgBW。以下使用的樣品均為本申請片劑去3％包衣分的顆粒。

1.2實驗動物：動物選用16～18g清潔級雌性小鼠192只，共分為四批進行試驗，每批分四組，每組12只，試驗一批進行臟器/體重比值測定、遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)實驗、半數(shù)溶血值(HC₅₀)的測定和抗體生成細胞數(shù)的測定；試驗二批進行碳廊清試驗；試驗三批進行小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗；試驗四批進行ConA誘導的小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗和NK細胞活性測定。

1.3劑量：本申請片劑的推薦劑量為成人每日1.94g，相當于0.0323g/kgBW/d，實驗設(shè)人體推薦量的5倍、10倍、30倍，即每日0.16g/kgBW、0.32g/kgBW、0.97g/kgBW為低、中、高劑量組。受試物配制：稱取5.82g樣品加無菌水至60mL為高劑量受試物；稱取1.92g樣品加無菌水至60mL為中劑量受試物；稱取0.96g樣品加無菌水至60mL為低劑量受試物；受試物每日一次經(jīng)口給予，連續(xù)灌胃31天后，測各項指標。小鼠灌胃體積為10mL/kgBW。同時設(shè)一空白對照組0g/kgBW，用無菌水代替受試物，每日灌胃體積與各受試物組相同。各劑量組均給予維持飼料。

1.4試驗方法：

1.4.1臟器體重比值的測定

小鼠稱重后頸椎脫臼處死，取脾臟和胸腺，去盡筋膜，用濾紙吸干臟器表面血污，稱重，計算脾臟體重比值和胸腺體重比值。

1.4.2遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)試驗(足跖增厚法)

取羊血，生理鹽水洗滌3次，每只小鼠經(jīng)腹腔注射2％(v/v，用生理鹽水配制)SRBC懸液(2000r/min，10min)0.2mL，致敏后4天，測量左后足跖部厚度，然后在測量部位皮下注射20％(v/v，用生理鹽水配制)SRBC懸液20μL，于注射后24h測量左后足跖部厚度，以上兩次測量均為同一部位測量三次，取平均值，以攻擊前后足跖厚度的差值來表示DTH的程度，受試樣品組的撤職顯著高于對照組的差值，可判定該項實驗結(jié)果陽性。

1.4.3ConA誘導的小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗(MTT法)

無菌取脾，置于盛有適量無菌Hank’s液洗2次，每次離心5min(1000r/min)，然后將細胞懸浮于1mL的完全培養(yǎng)液中鏡檢計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為3×10⁶個/mL，再將脾細胞懸液分兩孔加入24孔培養(yǎng)板中，沒空1.0mL，在其中一孔加75μL ConA液(相當于7.5μg/mL)，另一孔作為對照，置二氧化碳培養(yǎng)箱中5％二氧化碳，37℃培養(yǎng)72h。培養(yǎng)結(jié)束前4h，每孔輕輕吸去上清液0.7mL不含小牛血清的RPMII640培養(yǎng)液，同時加入MTT 50μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h，培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入1mL酸性異丙醇，吹打混勻，使紫色結(jié)晶完全溶解，然后將此液體移入比色杯中，在分光光度計上比色測定，波長570nm，淋巴細胞的增殖能力用加ConA孔的光密度值減去不加ConA孔的光密度值差值表示，受試樣品組的光密度差值顯著高于對照組的光密度差值，可判定該項實驗結(jié)果陽性。

1.4.4抗體生成細胞數(shù)的測定

取羊血，生理鹽水洗滌3次，每只小鼠經(jīng)腹腔注射2％(v/v，用生理鹽水配制)SRBC懸液0.2mL，將SRBC免疫5天后的小鼠頸椎脫臼處死，取出脾臟，輕輕磨碎脾臟，制成細胞懸液，離心5min，用Hank’s液洗2遍，最后將細胞懸浮在8mL Hank’s液中，將瓊脂糖加熱溶解后，與等量雙倍Hank’s液混合，分裝小試管，每管0.5mL，再向管內(nèi)加10％(v/v，用SA液配制)SRBC懸液μL、脾細胞懸液8μL，迅速混勻后，傾倒于已刷瓊脂糖薄層的玻片上，作平行片，待瓊脂凝固后，將玻片水平扣放于片架上，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃溫育1h，然后用SA緩沖液稀釋的補體)(1:8)加入到玻片架凹槽內(nèi)，繼續(xù)溫育1.5h后，計數(shù)溶血空斑數(shù)?？煞从晨贵w生成細胞數(shù)用空斑數(shù)/全脾細胞來表示。受試樣品組的空斑數(shù)顯著高于對照組的空斑數(shù)，可判定該項實驗結(jié)果陽性。

1.4.5半數(shù)溶血值的測定

取羊血，生理鹽水洗滌3次，每只小鼠經(jīng)腹腔注射2％(v/v，用生理鹽水配制)SRBC懸液0.2mL，將SRBC免疫5天后摘除眼球取血于離心管內(nèi)，放置約1h，將凝固血于管壁剝離，使血清充分析出，離心收集血清，SA緩沖液稀釋血清300倍，取1.0mL置試管內(nèi)，依次加入10％(v/v，用生理鹽水配制)SRBC懸液0.5mL，補體1.0mL，另設(shè)不加血清的對照管，置37℃恒溫水浴中保溫15min后，冰浴終止反應(yīng)。離心取上清1mL，加Hb稀釋液3.0mL，同時取10％(v/v，用SA緩沖液配制)的SRBC懸液0.25mL，加Hb稀釋液至4mL，于另一試管中，充分混勻，放置10min后，于540nm處以對照管作空白，分別測定各管光密度值，溶血素的量以半數(shù)溶血值表示，按下式計算：

樣品半數(shù)溶血值＝樣品光密度值/SRBC半數(shù)溶血時的光密度值×稀釋倍數(shù)

受試樣品組的HC50顯著高于對照組的HC50，可判定該項實驗結(jié)果陽性。

1.4.6小鼠碳廊清實驗

按體重從小鼠尾靜脈注射稀釋4倍的印度墨汁，待墨汁注入，立即計時，注入墨汁后10min，分別從內(nèi)呲靜叢取血20μL，并將其加到2.0mL 0.1％Na₂CO₃溶液中，用分光光度計在600nm波長處測定光密度值，以0.1％Na₂CO₃溶液作為空白對照，將小鼠處死，取肝臟和脾臟稱重，以吞噬指數(shù)(a)表示小鼠碳廊清的能力按下式計算a：其中k＝(lgOD₁-lgOD₂)/(t₂-t₁)；a＝體重+(肝重+脾重)×k^1/3。受試樣品組的吞噬指數(shù)顯著高于對照組的吞噬指數(shù)，可判定該項實驗結(jié)果陽性。

1.4.7小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗

小鼠腹腔注射20％(v/v，用生理鹽水配制)雞紅細胞懸液1mL，間隔30min，頸椎脫臼處死，經(jīng)處理后，取腹腔巨噬細胞洗液1mL，分別于2片載玻片上，放入墊有濕紗布的搪瓷盒內(nèi)，移置37℃溫育30min，漂洗，去除未貼片細胞，晾干，以1:1丙酮甲醇溶液固定，染色，再用蒸餾水漂洗晾干，油鏡下計數(shù)，每片計數(shù)100個巨噬細胞，按下式計算吞噬率和吞噬指數(shù)：

吞噬百分率(％)＝吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數(shù)/計數(shù)的巨噬細胞數(shù)×100％

吞噬指數(shù)＝被圖示的雞紅細胞總數(shù)/計數(shù)的巨噬細胞數(shù)

得出的吞噬百分率再按下式進行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，式中P為吞噬百分率，用小數(shù)表示，所得數(shù)據(jù)為計量資料，受試樣品組的吞噬百分率和吞噬指數(shù)均顯著高于對照組的吞噬百分率和吞噬指數(shù)，可判定該項實驗結(jié)果陽性。

1.4.8NK細胞活性的測定

通過乳酸脫氫酶LDH測定法測定，計算NK細胞活性：實驗前3天將靶細胞YAC-1進行傳代培養(yǎng)，應(yīng)用前以Hank’s液洗3次，用含10％小牛血清的RPMII640完全培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為4×10⁵個/mL，受試小鼠頸椎脫臼處死，無菌取脾，制成脾細胞懸液，清洗2次后，離心，棄上清液將細胞漿彈起，加入0.5mL滅菌20秒，裂解紅細胞后再加入0.5mL雙倍Hank’s液及8.0mLHank’s液，離心10min，用1mL含含10％小牛血清的RPMII640完全培養(yǎng)液重懸，鏡檢計數(shù)，用RPMII640完全培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為2×10⁷個/mL，使效應(yīng)細胞與靶細胞比為50:1。取靶細胞和效應(yīng)細胞各100μL，加入U形96孔培養(yǎng)吧中，靶細胞自然四方孔加靶細胞和培養(yǎng)液各100μL，靶細胞最大稀釋孔加靶細胞和1％NP40各100μL，上述各項均設(shè)三個平行孔，置二氧化碳培養(yǎng)箱中5％二氧化碳，37℃培養(yǎng)4h，將96孔板離心，吸取每孔上清100μL，置平底96孔培養(yǎng)板中，加入LDH基質(zhì)液100μL，反應(yīng)3～10min，然后每孔加入1mol/L HCl溶液30μL，終止反應(yīng)，在酶標儀490nm處測光密度值，計算NK細胞活性：

NK細胞活性(％)＝(反應(yīng)孔OD-自然釋放孔OD)/(最大四釋放孔OD-自然釋放孔OD)×100％

得出的NK細胞活性按下式劑型數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，式中P為NK細胞活性，用小數(shù)表示，所得數(shù)據(jù)為計量資料，受試樣品組的NK細胞活性顯著高于對照組的NK細胞活性，可判定該項實驗結(jié)果陽性。

2、實驗結(jié)果：

2.1本申請原料制得的片劑對小鼠體重的影響

表1各組小鼠的初始體重

由表1可見，小鼠的初始體重在四批實驗動物各劑量組與0g/kgBW組間比較，差異均無顯著性(P＞0.05)。即小鼠的初始體重在各組間較為均衡。

表2對小鼠體重的影響

由表2可見，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的本申請片劑去包衣顆粒31天后后，小鼠的體重在四批各劑量組與0g/kgBW組間比較，差異均無顯著性(P＞0.05)。即本申請原料制成的片劑對小鼠體重無不良影響。

2.2本申請原料制得的片劑對小鼠臟器/體重比值的影響

表3對小鼠脾臟/體重比值的影響

由表3可見，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的本申請片劑去包衣顆粒31天后，各劑量組小鼠脾臟/體重比值與0g/kgBW組比較，差異均無顯著性(P＞0.05)，即本申請片劑對小鼠的脾臟/體重比值無影響。

表4對小鼠胸腺/體重比值的影響

由表3可見，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的本申請片劑去包衣顆粒31天后，各劑量組小鼠胸腺/體重比值與0g/kgBW組比較，差異均無顯著性(P＞0.05)，即本申請片劑對小鼠的胸腺/體重比值無影響。

2.3本申請原料制得的片劑對小鼠細胞免疫功能的影響

表5對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響

由表5可見，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的本申請片劑去包衣顆粒31天后，各劑量組小鼠足跖腫脹度與0g/kgBW組比較，差異均無顯著性(P＞0.05)，即本申請片劑對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)程度無影響。

表6對小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗的影響

由表6可見，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的本申請片劑去包衣顆粒31天后，各劑量組小鼠淋巴細胞增殖能力與0g/kgBW組比較，差異均無顯著性(P＞0.05)，即本申請片劑對小鼠淋巴細胞增殖能力無影響。

2.4本申請原料制得的片劑對小鼠體液免疫的影響

表7對小鼠抗體生成細胞數(shù)的影響

由表7可見，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的本申請片劑去包衣顆粒31天后，與0g/kgBW組比較，0.97g/kgBW小鼠溶血空斑數(shù)提高，有顯著性差異(P＜0.05)，即本申請片劑在高劑量組能提高小鼠抗體生產(chǎn)細胞數(shù)。

表8對小鼠半數(shù)溶血值的影響

由表7可見，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的本申請片劑去包衣顆粒31天后，與0g/kgBW組比較，0.97g/kgBW小鼠溶血值提高，有顯著性差異(P＜0.05)，即本申請片劑在高劑量組能提高小鼠半數(shù)溶血值。

2.5本申請原料制得的片劑對小鼠單核-巨噬細胞吞噬功能的影響

表9對小鼠碳廊清能的影響

由表9可見，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的本申請片劑去包衣顆粒31天后，與0g/kgBW組比較，差異均無顯著性(P＞0.05)，即本申請片劑對小鼠的碳廊清能力無影響。

表10對小鼠巨噬細胞吞噬雞紅細胞吞噬率的影響

由表10可見，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的本申請片劑去包衣顆粒31天后，與0g/kgBW組比較，0.32g/kgBW組小鼠巨噬細胞吞噬雞紅細胞吞噬率提高，有顯著性差異(P＜0.05)，0.97g/kgBW小鼠巨噬細胞吞噬雞紅細胞吞噬率提高，有顯著性差異(P＜0.01)，即本申請片劑在高劑量組能提高小鼠巨噬細胞吞噬雞紅細胞吞噬率。

表11對小鼠巨噬細胞吞噬雞紅細胞吞噬指數(shù)的影響

由表11可見，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的本申請片劑去包衣顆粒31天后，與0g/kgBW組比較，0.32g/kgBW組小鼠巨噬細胞吞噬雞紅細胞吞噬指數(shù)提高，有顯著性差異(P＜0.01)，0.97g/kgBW小鼠巨噬細胞吞噬雞紅細胞吞噬指數(shù)提高，有顯著性差異(P＜0.01)，即本申請片劑在高劑量組能提高小鼠巨噬細胞吞噬雞紅細胞吞噬指數(shù)。

2.6本申請原料制得的片劑對小鼠NK細胞活性的影響

表12對小鼠NK細胞活性的影響

由表12可見，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的本申請片劑去包衣顆粒31天后，與0g/kgBW組比較，差異均無顯著性(P＞0.05)，即本申請片劑對小鼠NK細胞活性無影響。

綜上所述，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的本申請片劑去包衣顆粒31天后，與0g/kgBW組比較，該受試物在0.32g/kgBW組能提高小鼠巨噬細胞吞噬雞紅細胞吞噬率和吞噬指數(shù)；在0.97g/kgBW組能提高小鼠抗體生成細胞數(shù)、提高小鼠半數(shù)溶血值、提高小鼠巨噬細胞吞噬雞紅細胞吞噬率和吞噬指數(shù)。受試物對小鼠體重增長無不良影響。根據(jù)《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》對增強免疫力保健食品的判定標準可知，本申請原料制得的片劑具有增強免疫力的功能。

有益效果：

本發(fā)明一種增強免疫力的藥物組合物及其應(yīng)用，產(chǎn)品具有增強人體免疫力的功效。

附圖說明

圖1為放置0天的檢測結(jié)果；

圖2為放置1個月的檢測結(jié)果；

圖3為放置2個月的檢測結(jié)果；

圖4為放置3個月的檢測結(jié)果。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明。

實施例1：

一種增強免疫力的藥物組合物，稱取原料：350g天麻、350g靈芝、625g酸棗仁、275g柏子仁。稱取輔料：152.5g乳糖、60g甘露醇、60g微晶纖維素、25g羧甲基淀粉鈉、2.5g硬脂酸鎂。

將天麻切片，并將酸棗仁炒制，然后將天麻、靈芝、酸棗仁和柏子仁按重量份數(shù)混合，并加入10倍原料總重量的水，并熬煮提取兩次，兩次的濾液濃縮至相對密度為1.2～1.3后，于65～75℃下真空干燥成干浸膏，粉碎成浸膏粉，按重量份數(shù)將輔料與浸膏粉混合均勻后，制粒干燥，最后壓片得到片劑。

上述藥物組合得到的產(chǎn)品具有增強人體免疫力的功效。

實施例2：

一種增強免疫力的藥物組合物，稱取原料：340g天麻、340g靈芝、600～650g酸棗仁、250g柏子仁。稱取輔料：150g乳糖、58g甘露醇、58g微晶纖維素、22g羧甲基淀粉鈉、2g硬脂酸鎂。

將天麻切片，并將酸棗仁炒制，然后將天麻、靈芝、酸棗仁和柏子仁按重量份數(shù)混合，并加入10倍原料總重量的水，并熬煮提取兩次，兩次的濾液濃縮至相對密度為1.2～1.3后，于65～75℃下真空干燥成干浸膏，粉碎成浸膏粉，按重量份數(shù)將輔料與浸膏粉混合均勻后，制粒干燥，最后壓片得到片劑。

上述藥物組合得到的產(chǎn)品具有增強人體免疫力的功效。

實施例3：

一種增強免疫力的藥物組合物，稱取原料：360g天麻、360g靈芝、650g酸棗仁、300g柏子仁。稱取輔料：155g乳糖、62g甘露醇、62g微晶纖維素、27g羧甲基淀粉鈉、3g硬脂酸鎂。

將天麻切片，并將酸棗仁炒制，然后將天麻、靈芝、酸棗仁和柏子仁按重量份數(shù)混合，并加入10倍原料總重量的水，并熬煮提取兩次，兩次的濾液濃縮至相對密度為1.2～1.3后，于65～75℃下真空干燥成干浸膏，粉碎成浸膏粉，按重量份數(shù)將輔料與浸膏粉混合均勻后，制粒干燥，最后壓片得到片劑。

上述藥物組合得到的產(chǎn)品具有增強人體免疫力的功效。

最后需要說明的是，上述描述僅僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的啟示下，在不違背本發(fā)明宗旨及權(quán)利要求的前提下，可以做出多種類似的表示，這樣的變換均落入本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。