本發明涉及免疫
技術領域：
，進一步涉及卵黃抗體免疫效果的協同增效技術，具體涉及一種針對腺病毒的多途徑協同免疫方法。
背景技術：
：雞心包積液和肝炎綜合征是由禽腺病毒I群中的一些血清型引起雞的一種急性傳染病，但各血清型的致病力不同。該病多發于3～6周齡的肉雞，也可偶發于20周齡內的后備蛋雞或種雞，無性別差異，在更大齡的肉雞也很少發生。各種品系肉雞對本病都易感，其他禽類如火雞、鵝、雉雞等也有發病的報道。臨床上以突發性死亡率增加，心包積液和肝炎綜合征為主要特征。本病的感染途徑主要是呼吸道、消化道及眼結膜等，可經機械方式和被帶毒糞便污染的器具而在雞群間、雞場間迅速傳播。國內曾經在非SPF雞胚傳代的疫苗生產用毒種中檢測到禽腺病毒的污染，如果污染的疫苗曾經推廣使用，可能會引起此病的廣泛傳播。越來越多的研究表明，心包積液和肝炎綜合征的發生與某些免疫抑制病有關，常與引起禽類呼吸道疾病的病原微生物混合感染，隨著家禽養殖規模的逐漸擴大，該病的危害也更加嚴重，對該病的防控現已成為國際禽病研究的熱點。由于腺病毒的多血清型，該病至今沒有有效疫苗可供使用。技術實現要素：本發明旨在針對現有技術的技術缺陷，提供一種針對腺病毒的多途徑協同免疫方法，以解決現有技術中針對腺病毒的人工免疫方法效果不佳的技術問題。本發明要解決的另一技術問題是現有技術注射卵黃抗體免疫腺病毒的方法效果不佳。為實現以上技術目的，本發明采用以下技術方案：一種針對腺病毒的多途徑協同免疫方法，包括以下步驟：1)制備腺病毒液；2)制備腺病毒卵黃抗體；3)將所述腺病毒液與腺病毒卵黃抗體混合后對雞進行免疫注射。作為優選，所述腺病毒液中的抗原成為為腺病毒I群血清4型。作為優選，步驟3)所述腺病毒液中病毒效價為108.5TCID50、108.0TCID50或107.5TCID50。作為優選，步驟3)所述腺病毒卵黃抗體中抗體效價為1:4、1:8或1:16。作為優選，步驟3)中腺病毒液與腺病毒卵黃抗體的混合體積比是1:1。作為優選，步驟3)中所述注射的劑量是0.5mL。作為優選，步驟3)中腺病毒液與腺病毒卵黃抗體混合后先加入油佐劑乳化，油水混合制劑型，而后再對雞進行免疫注射。作為優選，步驟1)所述腺病毒液是通過以下方法制備的：取分離鑒定株腺病毒I群血清4型，用滅菌生理鹽水10倍稀釋病毒液，接種已長滿單層的雞胚成纖維細胞，待細胞病變達到80％時，收獲，反復凍融三次，測得的病毒含量為108.0TCID50，將檢驗合格的凍融液濃縮4倍后，為免疫原。作為優選，步驟2)所述腺病毒卵黃抗體是通過以下方法制備的：A)制備腺病毒滅活疫苗；B)取120日齡蛋雞，每只胸部肌肉注射步驟A)所述疫苗2ml，10日后每只胸部肌肉再注射步驟A)所述疫苗2ml，10日后每只胸部肌肉再注射步驟A)所述疫苗2ml；C)取步驟B)三免后的雞卵，制備卵黃抗體。作為優選，步驟C)所述制備卵黃抗體，具體包括以下操作：將分離的蛋黃攪拌成均勻膏狀，加入等體積注射用水，攪拌均勻后，65℃加熱滅活30分鐘；加入6倍量酸化水，重復3組；將各組降溫至1～4℃；4℃靜置2～5小時，14000轉離心取上清；加入正辛酸終濃度為0.3％，室溫放置5～12小時；卵黃液用孔徑為0.45μm濾器過濾澄清，再用0.22μm濾器過濾除菌；經截留分子量為100KD超濾膜堆進行濃縮；加入終濃度為0.2％甲醛溶液，室溫放置24小時，期間振搖4～6次。作為優選，所述雞是SPF雞。本發明提供了一種針對腺病毒的多途徑協同免疫方法，該技術方案在卵黃抗體免疫方法的基礎上加以改進，在卵黃抗體中加入腺病毒免疫原，利用所得到的抗原抗體復合物執行免疫注射。實驗驗證發現，在控制特定的混合比例的基礎上不僅不會產生感染問題，而且能顯著提升免疫效果。本發明創新性的在SPF雞上使用腺病毒免疫原加入卵黃抗體復合物，各組雞均未見異常，全部健活，進行腺病毒抗體的監測，免疫原加入卵黃抗體復合物和滅活疫苗都能迅速的產生抗體。在優選技術方案中，優選用SPF雞；優選用腺病毒滅活疫苗免疫，制備卵黃抗體；優選的，用腺病毒免疫原加入卵黃抗體的復合物免疫。此外，本發明方法可以用于雞心包積液和肝炎綜合征的免疫和預防。本發明巧妙的利用腺病毒加入卵黃抗體復合物的免疫方法，能夠在現疫地有效的預防安卡拉病。本發明效果突出，同時成本較低、易于實現，因此具有突出的推廣前景。附圖說明圖1是本發明具體實施方式中不同實驗組免疫后血清中抗體水平變化圖。具體實施方式以下將對本發明的具體實施方式進行詳細描述。為了避免過多不必要的細節，在以下實施例中對屬于公知的結構或功能將不進行詳細描述。除有定義外，以下實施例中所用的技術和科學術語具有與本發明所屬領域技術人員普遍理解的相同含義。實施例11、免疫原的制備取分離鑒定株腺病毒I群血清4型，用滅菌生理鹽水10倍稀釋病毒液，接種已長滿單層的雞胚成纖維細胞，待細胞病變達到80％時，收獲，反復凍融三次，測得的病毒含量為108.0TCID50，將檢驗合格的凍融液濃縮4倍后，為免疫原。2、卵黃抗體的制備2.1疫苗的制備將免疫原加入甲醛滅活后，制備成水相。將白油10號高壓滅菌后，水相與油相乳化比例為1:1(V/V)，先將油相導入膠體磨，2500r/min攪拌，緩慢加入水相，加完后10000r/min乳化15分鐘。充分振蕩混勻，制成疫苗。2.2免疫首免：120日齡蛋雞100只，每只胸部肌肉注射疫苗2ml；二免：首免10日后進行二免，每只胸部肌肉注射疫苗2ml；三免：二免后10日后進行三免，每只胸部肌肉注射疫苗2ml；2.3卵黃抗體的制備卵黃抗體制備方法：將分離的蛋黃攪拌成均勻膏狀，加入等體積注射用水，攪拌均勻后，65℃加熱滅活30分鐘。加入6倍量酸化水，重復3組。將各組降溫至1～4℃。4℃靜置2～5小時，14000轉離心取上清。加入正辛酸終濃度為0.3％，室溫放置5～12小時。卵黃液用孔徑為0.45μm濾器過濾澄清，再用0.22μm濾器過濾除菌。經截留分子量為100KD超濾膜堆進行濃縮。加入終濃度為0.2％甲醛溶液，室溫放置24小時，期間振搖4～6次。卵黃抗體效價達到1:8以上，為合格。3、腺病毒免疫原加入卵黃抗體復合物的制備3.1配制不同濃度的免疫原將免疫原的108.0TCID50配制成108.5、108.0、107.5TCID50三種濃度。3.2配制不同腺病毒的抗體效價將腺病毒卵黃抗體的效價配制成1:4、1:8、1:16三種濃度。3.3配制不同體積混合的腺病毒加入卵黃抗體復合物將三種不同濃度的免疫原和三種不同濃度的卵黃抗體按照1:1的比例混合，制成抗原抗體復合物(三組)如表1，加入油佐劑中進行乳化，即可得到抗原抗體復合物的油水混合制劑型。表1抗原抗體復合物混合比例表項目復合物一復合物二復合物三免疫原108.5TCID50108.0TCID50107.5TCID50卵黃抗體1:41:81:164、對雞進行免疫取10日齡SPF雞50只，隨機分為5組，每組10只，分別為復合物一組、復合物二組、復合物三組、疫苗組和空白對照組。分別肌肉注射1.0ml/只，空白對照組不免疫。免疫后，每周進行采血，檢測抗體，直至7周。如表2所示。血清中的抗體水平見圖1。表2不同實驗組免疫方法及注射劑量由曲線圖可知，注射抗原抗體復合物的雞只，產生免疫應答的時間都要短于疫苗組，復合物二組是各組中血清抗體效價上升最快的，能夠產生抗體的水平也是各組中最高的；復合物一組和復合物三組與疫苗組在抗體水平達到穩定時，抗體水平沒有明顯差異。5、攻毒保護取10日齡SPF雞50只，隨機分為5組，每組10只，分別為復合物一組、復合物二組、復合物三組、疫苗組和空白對照組。分別肌肉注射1.0ml/只，空白對照組不免疫。免疫后第7天，分別進行腺病毒I群血清4型攻毒，觀察10天。見表3。表3不同實驗組免疫效果評價表組別免疫劑量攻毒發病只數死亡只數復合物一組復合物一0.5mlI群4型42復合物二組復合物二0.5mlI群4型10復合物三組復合物三0.5mlI群4型32疫苗組疫苗組0.5mlI群4型75空白對照組//I群4型1010各組免疫7天后，分別進行腺病毒I群血清4型攻毒，觀察10天。統計各組中雞只發病率、死亡率及保護率。結果表明：空白對照組雞只死亡率為100％，復合物二組死亡率最低，保護率可達到100％。復合物一組和復合物三組的保護率都高于疫苗組。實施例2一種針對腺病毒的多途徑協同免疫方法，包括以下步驟：1)制備腺病毒液；2)制備腺病毒卵黃抗體；3)將所述腺病毒液與腺病毒卵黃抗體混合后對雞進行免疫注射。在以上技術方案的基礎上，滿足以下條件：所述腺病毒液中的抗原成為為腺病毒I群血清4型。步驟3)所述腺病毒液中病毒效價為108.5TCID50、108.0TCID50或107.5TCID50。步驟3)所述腺病毒卵黃抗體中抗體效價為1:4、1:8或1:16。步驟3)中腺病毒液與腺病毒卵黃抗體的混合體積比是1:1。步驟3)中所述注射的劑量是0.5mL。步驟3)中腺病毒液與腺病毒卵黃抗體混合后先加入油佐劑乳化，油水混合制劑型，而后再對雞進行免疫注射。步驟1)所述腺病毒液是通過以下方法制備的：取分離鑒定株腺病毒I群血清4型，用滅菌生理鹽水10倍稀釋病毒液，接種已長滿單層的雞胚成纖維細胞，待細胞病變達到80％時，收獲，反復凍融三次，測得的病毒含量為108.0TCID50，將檢驗合格的凍融液濃縮4倍后，為免疫原。步驟2)所述腺病毒卵黃抗體是通過以下方法制備的：A)制備腺病毒滅活疫苗；B)取120日齡蛋雞，每只胸部肌肉注射步驟A)所述疫苗2ml，10日后每只胸部肌肉再注射步驟A)所述疫苗2ml，10日后每只胸部肌肉再注射步驟A)所述疫苗2ml；C)取步驟B)三免后的雞卵，制備卵黃抗體。步驟C)所述制備卵黃抗體，具體包括以下操作：將分離的蛋黃攪拌成均勻膏狀，加入等體積注射用水，攪拌均勻后，65℃加熱滅活30分鐘；加入6倍量酸化水，重復3組；將各組降溫至1～4℃；4℃靜置2～5小時，14000轉離心取上清；加入正辛酸終濃度為0.3％，室溫放置5～12小時；卵黃液用孔徑為0.45μm濾器過濾澄清，再用0.22μm濾器過濾除菌；經截留分子量為100KD超濾膜堆進行濃縮；加入終濃度為0.2％甲醛溶液，室溫放置24小時，期間振搖4～6次。實施例3一種針對腺病毒的多途徑協同免疫方法，包括以下步驟：1)制備腺病毒液；2)制備腺病毒卵黃抗體；3)將所述腺病毒液與腺病毒卵黃抗體混合后對雞進行免疫注射。以上對本發明的實施例進行了詳細說明，但所述內容僅為本發明的較佳實施例，并不用以限制本發明。凡在本發明的申請范圍內所做的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。當前第1頁1 2 3