本發(fā)明屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種豬支氣管敗血波氏桿菌病疫苗。
背景技術(shù)：
豬支氣管敗血波氏桿菌病,又稱波氏菌病,是一種重要的豬呼吸道系統(tǒng)疾病,以各種急慢性的呼吸道病癥為特征,極易引起其它病原菌的混合和繼發(fā)感染,全世界多數(shù)養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達(dá)的國(guó)家均有此病發(fā)生,給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。豬波氏桿菌病在全世界分布廣泛,在歐洲、美國(guó)、加拿大、日本的感染率都很高,全世界已經(jīng)有30％-50％的豬群受到波氏桿菌的感染。我國(guó)對(duì)豬波氏桿菌進(jìn)行的流行學(xué)調(diào)查顯示,我國(guó)多個(gè)省份和地區(qū)爆發(fā)嚴(yán)重,感染率高達(dá)61.1％。隨著集約化程度的不斷提高,對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的危害也日趨嚴(yán)重。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種豬支氣管敗血波氏桿菌病疫苗，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有疫苗的不足。
本發(fā)明還提供一種滅活疫苗，其中抗原為滅活的豬支氣管敗血波氏桿菌YBB01株；
本發(fā)明所提供豬支氣管敗血波氏桿菌YBB01株(Bordetella bronchiseptica YBB01)，于2016年11月1日保藏在中國(guó)武漢、武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M 2016606。
上述的滅活疫苗，抗原的滅活采用甲醛滅活；
本發(fā)明的滅活疫苗的制備方法如下：
1)油相：采用MONTANIDETM ISA 201 VG佐劑(以下簡(jiǎn)稱201佐劑)；
2)水相制備：將純粹檢驗(yàn)合格的YBB01株抗原，將菌泥分別重懸于滅菌的生理鹽水中，均稀釋至4.0×109CFU/ml滅活后，檢驗(yàn)合格后，作為抗原；
3)乳化：將水相和油相預(yù)熱至31℃，按質(zhì)量比1:1混合，4000r/min攪拌30～40分鐘；
4)分裝：定量分裝，加蓋密封，并粘貼標(biāo)簽，置2～8℃保存。
本發(fā)明的疫苗所使用的豬支氣管敗血波氏桿菌YBB01株的毒力強(qiáng)高、免疫原性好并具有較好的交叉保護(hù)性。本發(fā)明制備的疫苗的安全性良好，未出現(xiàn)由疫苗引起的任何局部和全身不良反應(yīng)。保存期試驗(yàn)中經(jīng)過(guò)性狀、安全性試驗(yàn)、效力試驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析，各項(xiàng)指標(biāo)均穩(wěn)定有效；效力試驗(yàn)結(jié)果證明，YBB01株產(chǎn)生抗體快，重要的是免疫后能夠抵御流行株的保護(hù)。
具體實(shí)施方式
申請(qǐng)人篩選獲得了一株豬支氣管波氏桿菌YBB01株，并用其制備疫苗，從而促成了本發(fā)明。
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。
實(shí)施例1：豬支氣管波氏桿菌YBB01株的篩選
1.流行病學(xué)調(diào)查 自2013年以來(lái)，發(fā)明人對(duì)豬支氣管敗血波氏桿菌的流行病學(xué)進(jìn)行調(diào)查，并對(duì)部分豬場(chǎng)進(jìn)行跟蹤調(diào)查。調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，豬支氣管敗血波氏桿菌目前已在我國(guó)豬場(chǎng)廣泛存在。
2.細(xì)菌分離 采集疑似病豬的肺臟、胸腹腔積液、心包積液等病料，接種TSA培養(yǎng)基，于5％CO2條件下，37℃培養(yǎng)24～48h，挑取單個(gè)菌落，進(jìn)行培養(yǎng)并鑒定。
3.細(xì)菌鑒定
3.1 形態(tài)觀察 取疑似菌落，涂片后革蘭氏染色鏡檢，觀察其細(xì)菌形態(tài)。
3.2 生化特性鑒定 對(duì)可疑菌落進(jìn)行葡萄糖、甘露糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、阿拉伯糖、木糖、麥芽糖、鼠李糖、山梨醇、衛(wèi)矛醇、氧化酶、脲酶、硝酸鹽還原、檸檬酸鹽、鳥(niǎo)氨酸、賴氨酸、谷氨酸脫羧酶、枸櫞酸、明膠、甲基紅、VP、吲哚半固體等生化試驗(yàn)，于37℃培養(yǎng)24～48h，觀察結(jié)果。
3.3 PCR鑒定 將上述初步鑒定的細(xì)菌進(jìn)一步用PCR方法確定。用接種環(huán)取少許被檢菌落于100μL無(wú)菌PBS,混勻,取1μL菌懸液作PCR模板。根據(jù)波氏桿菌fla基因(NO.AF232939)序列設(shè)計(jì)引物,P1:5′-GCTCCCAAGAGAGAAAGGCT-3′,P2:5′-GGTGGCGCCTGCCCTATC-3′,擴(kuò)增片段大小為235bp,引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。
4.毒力試驗(yàn) 將分離的10株豬支氣管波氏桿菌分別滴鼻注射8～10周齡健康易感仔豬各5頭，3.0ml/頭(活菌量均約為4.0×109CFU)，另取5頭不攻毒作為對(duì)照。連續(xù)觀察14日，記錄試驗(yàn)豬的發(fā)病及死亡情況。試驗(yàn)結(jié)果表明，YBB01株毒力最強(qiáng)，5頭仔豬發(fā)病，其中4頭死亡。
5.免疫原性 根據(jù)毒力試驗(yàn)結(jié)果，將篩選的毒力較強(qiáng)的YBB01株菌株菌液分別調(diào)整至2.0×109CFU/ml，甲醛滅活后與201佐劑按質(zhì)量比1:1混合乳化，制備單價(jià)滅活疫苗，每種疫苗分別肌肉注射3～5周齡仔豬，2.0ml/頭，每組5頭。一次免疫后21日按相同劑量相同方法進(jìn)行二次免疫，二次免疫后14日所有仔豬采血并分離血清，使用間接血凝方法測(cè)定血清的抗體效價(jià)；并用本菌株進(jìn)行滴鼻注射攻毒(活菌量均約為4.0×109CFU)。觀察試驗(yàn)豬的發(fā)病及死亡情況。抗體檢測(cè)結(jié)果表明，免疫組5/5均大于等于1:16,對(duì)照組5/5均小于等于1:4；攻毒保護(hù)結(jié)果表明，免疫組5/5保護(hù),對(duì)照組5/5發(fā)病。
6.交叉攻毒保護(hù) 根據(jù)毒力試驗(yàn)結(jié)果，將YBB01株及其他9株分離菌株菌液調(diào)整至2.0×109CFU/ml，甲醛滅活后與201佐劑按質(zhì)量比1:1混合乳化，分別制備單價(jià)滅活疫苗，頸部肌肉注射仔豬，2.0ml/頭。一次免疫后21日按相同劑量相同方法進(jìn)行二次免疫，二次免疫后14日所有仔豬分別用分離的10株同型菌株進(jìn)行攻毒(4.0×109CFU)。觀察14日，記錄試驗(yàn)仔豬的發(fā)病及死亡情況。試驗(yàn)結(jié)果表明，YBB01組免疫組仔豬均未發(fā)病或死亡，均5/5保護(hù)；而對(duì)照組仔豬，均4/5-5/5發(fā)病。其他分離菌株免疫組攻毒后，保護(hù)率為1/5～3/5。表明YBB01株所制備的豬支氣管波氏桿菌滅活疫苗能抵御YBB01株及各地方分離株的攻擊而起到保護(hù)作用。
實(shí)施例2：豬支氣管波氏桿菌YBB01株抗原的制備
1.菌液培養(yǎng) 采用發(fā)酵罐對(duì)YBB01株進(jìn)行培養(yǎng)：按發(fā)酵罐容積的60％～80％加入TSB培養(yǎng)基，同時(shí)加入消泡劑，通入高壓蒸汽進(jìn)行滅菌，待其溫度降至37～38℃時(shí)，分別加入5％新生牛血清、0.01％NAD和1％～3％二級(jí)種子液進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度36～37℃、攪拌轉(zhuǎn)速100r/min、pH值7.2～7.4，整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程通過(guò)調(diào)節(jié)進(jìn)氣量來(lái)控制溶氧量為60％～80％，菌液培養(yǎng)8小時(shí)后，取樣進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)和純粹檢驗(yàn)。分別將發(fā)酵完成的菌液，導(dǎo)入柱式離心機(jī)離心，收獲菌泥，置于2～8℃保存，不超過(guò)24小時(shí)。
2.滅活 根據(jù)活菌計(jì)數(shù)結(jié)果，將菌泥重懸于適量滅菌的生理鹽水中，稀釋至4.0×109CFU/ml，分別計(jì)量加入10％甲醛溶液，使其終濃度為0.2％，37℃攪拌滅活16小時(shí)，進(jìn)行滅活檢驗(yàn)，其余菌液置2～8℃保存，不超過(guò)14日。
3.半成品檢驗(yàn)
3.1 純粹檢驗(yàn) 按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)。
3.2 活菌計(jì)數(shù) 按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行計(jì)數(shù)。
3.3 滅活檢驗(yàn) 按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)。
實(shí)施例3：疫苗的制備
1 水相配制 檢驗(yàn)合格的YBB01株抗原。
2 油相 MONTANIDETM ISA 201VG佐劑(以下簡(jiǎn)稱201佐劑)。
3 乳化 水相和油相預(yù)熱至31℃，按質(zhì)量比1:1混合，4000r/min攪拌30～40分鐘。
3 分裝 定量分裝，加蓋密封，并粘貼標(biāo)簽，置2～8℃保存。
4 成品檢驗(yàn)
4.1 性狀
外觀 乳白色乳劑。
劑型 水包油包水型。取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴于冷水表面，應(yīng)呈云霧狀擴(kuò)散。
穩(wěn)定性 吸取疫苗10ml加入離心管中，以3000r/min離心15分鐘，管底析出的水相應(yīng)不大于0.5ml。
黏度 按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行，應(yīng)符合規(guī)定。
4.2 裝量檢查 按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)符合規(guī)定。
4.3 無(wú)菌檢驗(yàn) 按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。
4.4 安全檢驗(yàn) 用3～5周齡健康易感仔豬5頭，每頭頸部肌肉注射疫苗4.0ml，觀察14日，應(yīng)不出現(xiàn)因疫苗引起的局部或全身不良反應(yīng)。
4.5 效力檢驗(yàn)
4.5.1 血清學(xué)方法 取3～5周齡健康易感仔豬10頭，其中5頭頸部肌肉注射疫苗2.0ml/頭，其余5頭作非免疫對(duì)照。一次免疫后21日，按相同劑量和相同方法進(jìn)行二次免疫，二次免疫后14日對(duì)所有仔豬采血并分離血清，檢測(cè)間接血凝抗體效價(jià)。免疫組5頭仔豬的抗體效價(jià)均應(yīng)≥1:16，對(duì)照組5頭仔豬抗體效價(jià)均應(yīng)≤1:4。
4.5.2 免疫攻毒法 用3～5周齡健康易感仔豬10頭，隨機(jī)分為A、B兩組，每組5頭，其中A組為免疫組，均頸部肌肉注射疫苗，2.0ml/頭，B組為非免疫對(duì)照組，均頸部肌肉注射生理鹽水，2.0ml/頭。一次免疫后21日按相同方法和相同劑量進(jìn)行二次免疫，二次免疫后14日進(jìn)行攻毒。A、B組試驗(yàn)豬滴鼻注射YBB01株菌液3.0ml(活菌量約為4.0×109CFU/頭)。觀察14日，免疫組豬均應(yīng)至少4頭保護(hù)，對(duì)照組豬均應(yīng)至少4頭發(fā)病。
實(shí)施例4：免疫交叉保護(hù)試驗(yàn)
用YBB01株制備的滅活疫苗，頸部肌肉注射仔豬，2.0ml/頭。一次免疫后21日按相同劑量相同方法進(jìn)行二次免疫，二次免疫后14日所有免疫仔豬分別用分離的10株同型菌株進(jìn)行攻毒(4.0×109CFU)。觀察14日，記錄試驗(yàn)仔豬的發(fā)病及死亡情況。攻毒后，免疫組仔豬均未發(fā)病或死亡，均5/5保護(hù)；而對(duì)照組仔豬，均4/5-5/5發(fā)病。表明YBB01株所制備的豬支氣管波氏桿菌滅活疫苗能抵御YBB01株及各地方分離株的攻擊而起到保護(hù)作用(表1)。而且，發(fā)明人用各地方分離株制備疫苗，免疫仔豬后，再用本發(fā)明篩選的YBB01株進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)；結(jié)果表明其它分離株疫苗的免疫效果遠(yuǎn)低于本發(fā)明YBB01株制成的滅活疫苗的效果。因此YBB01株可作為豬波氏桿菌病滅活疫苗的候選菌株。
表1：YBB01株疫苗對(duì)不同菌株的免疫交叉保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果