本發(fā)明屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種豬副豬嗜血桿菌病和豬支氣管敗血波氏桿菌病二聯(lián)滅活疫苗。
背景技術(shù)：
支氣管敗血波氏桿菌(Bordetella bronchiseptica，Bb)可引起豬發(fā)生非進行性萎縮性鼻炎(non-progressive atrophic rhinitis，NPAR)和支氣管肺炎，也是豬呼吸道綜合征(porcine respiratory disease complex，PRDC)的重要致病因子之一。此類疾病現(xiàn)已廣泛分布于養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達的國家。近年來隨著中國集約化養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展及豬的引種、調(diào)動頻繁，由Bb引起的NPAR、PRDC等疾病也隨之?dāng)U散蔓延，造成較大經(jīng)濟損失。并且易與副豬嗜血桿菌(Haemophilus suis，HPS)有協(xié)同致病作用，這樣的協(xié)同作用可提高呼吸道疾病的發(fā)病率并增加疾病的嚴重程度，造成嚴重的經(jīng)濟損失。因此，迫切需要對中國的HPS和Bb的流行情況進行系統(tǒng)研究，并迫切需要研制出一種豬副豬嗜血桿菌病和豬支氣管敗血波氏桿菌病二聯(lián)滅活疫苗，來防治這兩種疫病對養(yǎng)殖業(yè)造成的危害。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種豬副豬嗜血桿菌病和豬支氣管敗血波氏桿菌病二聯(lián)滅活疫苗，從而彌補現(xiàn)有疫苗的不足。
本發(fā)明還提供一種滅活疫苗，其中抗原為滅活的副豬嗜血桿菌YBH05株和豬支氣管敗血波氏桿菌YBB01株；
其中副豬嗜血桿菌YBH05株已于2011年11月23日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC No.5480。
豬支氣管敗血波氏桿菌YBB01株(Bordetella bronchiseptica YBB01)，于2016年11月1日保藏在中國武漢、武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M 2016606。
上述的滅活疫苗，抗原的滅活采用甲醛滅活；
本發(fā)明的二聯(lián)滅活疫苗的制備方法如下：
1)油相：MONTANIDETM ISA 201 VG佐劑(以下簡稱201佐劑)；
2)水相制備：將純粹檢驗合格的YBH05株和YBB01株抗原，將菌泥分別重懸于適量滅菌的生理鹽水中，均稀釋至4.0×109CFU/ml滅活后，檢驗合格后，作為抗原；
3)乳化：
水相和油相預(yù)熱至31℃，按質(zhì)量比1:1混合，4000r/min攪拌30～40分鐘；
4)分裝：定量分裝，加蓋密封，并粘貼標(biāo)簽，置2～8℃保存。
本發(fā)明的疫苗所使用的副豬嗜血桿菌YBH05株和豬支氣管敗血波氏桿菌YBB01株的毒力強高、免疫原性好并具有較好的交叉保護性。本發(fā)明制備的疫苗的安全性良好，未出現(xiàn)由疫苗引起的任何局部和全身不良反應(yīng)。保存期試驗中經(jīng)過性狀、安全性試驗、效力試驗數(shù)據(jù)的分析，各項指標(biāo)均穩(wěn)定有效；效力試驗結(jié)果證明，YBH05株和YBB01株能產(chǎn)生良好抗體，并能產(chǎn)生較好的攻毒保護力。
具體實施方式
申請人篩選獲得了一株豬支氣管敗血波氏桿菌YBB01株，將其與副豬嗜血桿菌YBH05株聯(lián)合使用制成了滅活疫苗，從而促成了本發(fā)明。
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進行詳細的描述。
實施例1：豬支氣管波氏桿菌YBB01株的篩選
1.流行病學(xué)調(diào)查 自2013年以來，發(fā)明人對豬支氣管敗血波氏桿菌的流行病學(xué)進行調(diào)查，并對部分豬場進行跟蹤調(diào)查。調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，豬支氣管敗血波氏桿菌目前已在我國豬場廣泛存在。
2.細菌分離 采集疑似病豬的肺臟、胸腹腔積液、心包積液、心血、關(guān)節(jié)液和腦組織等病料，接種TSA培養(yǎng)基，于5％CO2條件下，37℃培養(yǎng)24～48h，挑取單個菌落，進行培養(yǎng)并鑒定。
3.細菌鑒定
3.1形態(tài)觀察 取疑似菌落，涂片后革蘭氏染色鏡檢，觀察其細菌形態(tài)。
3.2生化特性鑒定 對可疑菌落進行葡萄糖、甘露糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、阿拉伯糖、木糖、麥芽糖、鼠李糖、山梨醇、衛(wèi)矛醇、氧化酶、脲酶、硝酸鹽還原、檸檬酸鹽、鳥氨酸、賴氨酸、谷氨酸脫羧酶、枸櫞酸、明膠、甲基紅、VP、吲哚半固體等生化試驗，于37℃培養(yǎng)24～48h，觀察結(jié)果。
3.3 PCR鑒定 將上述初步鑒定的細菌進一步用PCR方法確定。用接種環(huán)取少許被檢菌落于100μL無菌PBS,混勻,取1μL菌懸液作PCR模板。根據(jù)波氏桿菌fla基因(NO.AF232939)序列設(shè)計引物,P1:5′-GCTCCCAAGAGAGAAAGGCT-3′,P2:5′-GGTGGCGCCTGCCCTATC-3′,擴增片段大小為235bp,引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。
4.毒力試驗 將分離的10株豬支氣管波氏桿菌分別滴鼻注射8～10周齡健康易感仔豬各5頭，3.0ml/頭(活菌量均約為4.0×109CFU)，另取5頭不攻毒作為對照。連續(xù)觀察14日，記錄試驗豬的發(fā)病及死亡情況。試驗結(jié)果表明，YBB01株毒力最強，5頭仔豬發(fā)病，其中4頭死亡。
5.免疫原性 根據(jù)毒力試驗結(jié)果，將篩選的毒力較強的YBB01株菌株菌液分別調(diào)整至2.0×109CFU/ml，甲醛滅活后與201佐劑按質(zhì)量比1:1混合乳化，制備單價滅活疫苗，每種疫苗分別肌肉注射3～5周齡仔豬，2.0ml/頭，每組5頭。一次免疫后21日按相同劑量相同方法進行二次免疫，二次免疫后14日所有仔豬采血并分離血清，使用間接血凝方法測定血清的抗體效價；并用本菌株進行滴鼻注射攻毒(活菌量均約為4.0×109CFU)。觀察試驗豬的發(fā)病及死亡情況?？贵w檢測結(jié)果表明，免疫組5/5均大于等于1:16,對照組5/5均小于等于1:4；攻毒保護結(jié)果表明，免疫組5/5保護,對照組5/5發(fā)病。
6.交叉攻毒保護 根據(jù)毒力試驗結(jié)果，將YBB01株分離菌株菌液調(diào)整至2.0×109CFU/ml，甲醛滅活后與201佐劑按質(zhì)量比1:1混合乳化，制備單價滅活疫苗，頸部肌肉注射仔豬，2.0ml/頭。一次免疫后21日按相同劑量相同方法進行二次免疫，二次免疫后14日所有仔豬分別用分離的10株同型菌株進行攻毒(4.0×109CFU)。觀察14日，記錄試驗仔豬的發(fā)病及死亡情況。試驗結(jié)果表明，免疫組仔豬均未發(fā)病或死亡，均5/5保護；而對照組仔豬，均4/5-5/5發(fā)病。表明YBB01株所制備的豬支氣管波氏桿菌滅活疫苗能抵御YBB01株及各地方分離株的攻擊而起到保護作用。
實施例2：副豬嗜血桿菌YBH05株的信息
2.1形態(tài)及生化特性 副豬嗜血桿菌菌株YBH05株菌為革蘭氏陰性細小桿菌，具有多種不同的形態(tài)(從單個的球桿菌到長的、細長的、以至絲狀的菌體)。接觸酶試驗、硝酸鹽還原試驗均為陽性，溶血性試驗、尿素酶試驗、氧化酶試驗、V-P試驗、吲哚試驗均為陰性，能呈現(xiàn)“衛(wèi)星生長”現(xiàn)象，能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、核糖和麥芽糖。
2.2培養(yǎng)特性 副豬嗜血桿菌YBH05株在含0.01％輔酶(NAD)和5％新生牛血清的胰蛋白胨大豆肉湯液體培養(yǎng)基中呈均勻一致的混濁生長；在含0.01％NAD和5％新生牛血清的胰蛋白胨大豆瓊脂固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24～48小時，形成直徑0.3～2.0mm、圓形、光滑、濕潤、無色透明的露珠樣菌落。
2.3血清型 應(yīng)用瓊脂擴散試驗進行血清型鑒定，副豬嗜血桿菌YBH05株菌為HPS 5型。
2.4菌株毒力 腹腔注射8～10周齡健康易感仔豬，能使至少4頭及以上仔豬發(fā)病的各菌株的攻毒量是YBH05株約為5.0×109CFU/頭。
2.5免疫原性 將YBH05株菌株菌液分別調(diào)整至2.0×109CFU/ml，甲醛滅活后與201佐劑按質(zhì)量比1:1混合乳化，制備單價滅活疫苗，每種疫苗分別肌肉注射3～5周齡仔豬，2.0ml/頭，每組5頭。一次免疫后21日按相同劑量相同方法進行二次免疫，二免后21日按相同方法和劑量進行二免，二免后14日攻毒。A、B組試驗豬腹腔注射YBH05株菌液3.0ml(活菌量約為5.0×109CFU/頭)。觀察14日，免疫組豬均應(yīng)至少4頭保護，對照組豬均應(yīng)至少4頭發(fā)病。
實施例3：副豬嗜血桿菌YBH05株和豬支氣管敗血波氏桿菌YBB01株抗原的制備
1.菌液培養(yǎng)
1.1 YBB01株的培養(yǎng) 采用發(fā)酵罐對YBB01株進行培養(yǎng)：按發(fā)酵罐容積的60％～80％加入TSB培養(yǎng)基，同時加入消泡劑，通入高壓蒸汽進行滅菌，待其溫度降至37～38℃時，分別加入5％新生牛血清、0.01％NAD和1％～3％二級種子液進行發(fā)酵培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度36～37℃、攪拌轉(zhuǎn)速100r/min、pH值7.2～7.4，整個培養(yǎng)過程通過調(diào)節(jié)進氣量來控制溶氧量為60％～80％，菌液培養(yǎng)8小時后，取樣進行活菌計數(shù)和純粹檢驗。分別將發(fā)酵完成的菌液，導(dǎo)入柱式離心機離心，收獲菌泥，置于2～8℃保存，不超過24小時。
1.2 YBH05株的培養(yǎng) 采用發(fā)酵罐對YBH05株進行培養(yǎng)：按發(fā)酵罐容積的60％～80％加入TSB培養(yǎng)基，同時加入消泡劑，通入高壓蒸汽進行滅菌，待其溫度降至37～38℃時，分別加入5％新生牛血清、0.01％NAD和3％～5％二級種子液進行發(fā)酵培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度36～37℃、攪拌轉(zhuǎn)速100r/min、pH值7.2～7.4，整個培養(yǎng)過程通過調(diào)節(jié)進氣量來控制溶氧量為60％～80％，菌液培養(yǎng)12小時后，取樣進行活菌計數(shù)和純粹檢驗。分別將發(fā)酵完成的菌液，導(dǎo)入柱式離心機離心，收獲菌泥，置于2～8℃保存，不超過48小時。
2.滅活 根據(jù)活菌計數(shù)結(jié)果，將兩株菌株的菌泥重懸于適量滅菌的生理鹽水中，均稀釋至4.0×109CFU/ml，分別計量加入10％甲醛溶液，使其終濃度為0.2％，37℃攪拌滅活16小時，進行滅活檢驗，其余菌液置2～8℃保存，不超過14日。
3.半成品檢驗
3.1純粹檢驗 按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行檢驗。
3.2活菌計數(shù) 按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行計數(shù)。
3.3滅活檢驗 按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行檢驗。
實施例4：疫苗的制備
1水相配制 檢驗合格的YBH05株和YBB01株抗原按1：1混勻，作為水相。
2油相 MONTANIDETM ISA 201VG佐劑(以下簡稱201佐劑)。
3乳化 水相和油相預(yù)熱至31℃，按質(zhì)量比1:1混合，4000r/min攪拌30～40分鐘。
3分裝 定量分裝，加蓋密封，并粘貼標(biāo)簽，置2～8℃保存。
4成品檢驗
4.1性狀
外觀 乳白色乳劑。
劑型 水包油包水型。取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴于冷水表面，應(yīng)呈云霧狀擴散。
穩(wěn)定性 吸取疫苗10ml加入離心管中，以3000r/min離心15分鐘，管底析出的水相應(yīng)不大于0.5ml。
黏度 按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行，應(yīng)符合規(guī)定。
4.2裝量檢查 按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行檢驗，應(yīng)符合規(guī)定。
4.3無菌檢驗 按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行檢驗，應(yīng)無菌生長。
4.4安全檢驗 用3～5周齡健康易感仔豬5頭，每頭頸部肌肉注射疫苗4.0ml，觀察14日，應(yīng)不出現(xiàn)因疫苗引起的局部或全身不良反應(yīng)。
4.5效力檢驗
4.5.1血清學(xué)方法 取3～5周齡健康易感仔豬10頭，其中5頭頸部肌肉注射疫苗2.0ml/頭，其余5頭作非免疫對照。一次免疫后21日，按相同劑量和相同方法進行二次免疫，二次免疫后14日對所有仔豬采血并分離血清，分別檢測副豬嗜血桿菌和豬支氣管敗血波氏桿菌抗體效價。副豬嗜血桿菌的微量凝集抗體：免疫組5頭仔豬的抗體效價均≥1:32，對照組5頭仔豬的抗體效價均≤1:4；豬支氣管敗血波氏桿菌的間接血凝抗體：免疫組5頭仔豬的抗體效價均≥1:16，對照組5頭仔豬的抗體效價均≤1:4。
4.5.2免疫攻毒法 用3～5周齡健康易感仔豬20頭，隨機分為A、B、C、D 4組，每組5頭，其中A、B組為免疫組，均頸部肌肉注射疫苗，2.0ml/頭，C、D組為非免疫對照組，均頸部肌肉注射生理鹽水，2.0ml/頭。一次免疫后21日按相同方法和相同劑量進行二次免疫，二次免疫后14日進行攻毒。A、C組試驗豬腹腔注射YBH05株3.0ml(活菌量約為5.0×109CFU/頭)；B、D組試驗豬滴鼻注射YBB01株菌液3.0ml(活菌量約為4.0×109CFU/頭)。觀察14日，副豬嗜血桿菌：免疫組豬均至少4頭保護，對照組豬至少4頭發(fā)??；豬支氣管波氏桿菌：免疫組豬均至少4頭保護，對照組豬均至少4頭發(fā)病。
5疫苗對比試驗
用市場上出售的豬副豬嗜血桿菌病滅活疫苗和豬萎縮性鼻炎滅活疫苗，及本發(fā)明的豬副豬嗜血桿菌病和豬支氣管敗血波氏桿菌病二聯(lián)滅活疫苗，分別免疫5頭、5頭和10頭豬，并設(shè)置10頭豬為未免疫對照豬。根據(jù)各自疫苗的免疫程序進行免疫，免疫后采血進行抗體測定。并分別用本發(fā)明的兩株菌株進行攻毒。試驗結(jié)果表明，市場上出售的豬副豬嗜血桿菌病滅活疫苗和豬萎縮性鼻炎滅活疫苗，無論是從抗體上還是從攻毒保護率上，均比本發(fā)明的豬副豬嗜血桿菌病和豬支氣管敗血波氏桿菌病二聯(lián)滅活疫苗的效果較差。試驗結(jié)果見表1。
表1：三種滅活疫苗的抗體和攻毒保護率結(jié)果