表面胍基修飾的納米佐劑材料及其制備方法與應用與流程

本發明屬于免疫學領域，特別涉及一種表面胍基修飾的納米佐劑材料及其制備方法與應用。

背景技術：

疫苗是一種主要由蛋白、多糖或核酸等成分基于傳統方法或基因工程等生物技術加工而成的生物制品，用于人類疾病的預防和治療。根據制備疫苗的技術和疫苗成分，疫苗分為傳統疫苗和新型疫苗或高技術疫苗。傳統疫苗包括滅活、減毒活疫苗和從微生物及其衍生物分離提取的亞單位疫苗，如蛋白疫苗和多糖疫苗。新型疫苗包括基因工程亞單位疫苗、重組載體活疫苗、核酸疫苗、基因缺失活疫苗、遺傳重配疫苗及合成肽疫苗。疫苗的最終目的是促進機體產生長期、有效的抗病原體感染的能力，然而當前的眾多疫苗其免疫效力差強人意，因此需要佐劑增強其體液和細胞免疫應答。

納米材料作為一種新型佐劑，能夠模擬大多數生物活性物質如病毒，細菌及其它病原體等的天然球形結構，在高效包載抗原及免疫增強劑，增強抗原穩定性，促進抗原遞呈細胞（antigen presenting cell，APC）對抗原的攝取與加工，調控抗原在細胞內的遞送，促進抗原的交叉呈遞，引起更強的體液免疫和細胞免疫反應等方面具有重要的作用。因此，基于納米生物材料的疫苗佐劑將成為突破傳統疫苗瓶頸的有力手段，促進重大疾病相關的疫苗研制與免疫治療的發展與進步。然而，常規的納米佐劑仍然存在免疫原性弱、抗原負載率低、生物安全性不明確、納米佐劑的物理化學性質與疫苗免疫應答之間的關系不明確等問題。

中國專利CN201410519465.8公開了一種陽離子聚合物納米免疫佐劑的制備方法，引入帶正電核的聚乙烯亞胺（分子量為2000 g/mol），利用疏水相互作用形成mPEG-PCL-PEI三嵌段聚合物納米體系。關于表面胍基修飾的納米佐劑材料及其制備方法未見報道。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種表面胍基修飾的納米佐劑材料及其制備方法與應用。該納米佐劑可以負載各類蛋白、多肽或核酸抗原。本發明具有免疫原性強、抗原負載率高、穩定性強、體內外免疫應答強等優點，可用于免疫疫苗的制備。

本發明提供的一種表面胍基修飾的納米佐劑材料（含有胍基的共聚物）為:

聚乙二醇-b-聚己內酯-g-聚（胍基-乙基-甲基丙烯酸酯），其中ε-CL (ε-己內酯)與BMPCL (γ-(2-溴-2-甲基丙酸酯)-ε-己內酯)的聚合度范圍分別為30~35和3~3.5，胍基-乙基-甲基丙烯酸酯的聚合度為3~105。

所述共聚物為三嵌段共聚物，主鏈結構為聚乙二醇與聚己內酯嵌段共聚物，聚己內酯側鏈含有胍基。

本發明的納米佐劑材料的制備方法包括以下步驟：

1)將干燥的聚乙二醇單甲醚（mPEG）加入Schlenk管中，稱取定量的ε-己內酯（ε-CL）、γ-(2-溴-2-甲基丙酸酯)-ε-己內酯（BMPCL）與辛酸亞錫加入反應管中，在氮氣保護下于120-130℃油浴中，攪拌反應10-20小時。待反應冷卻后，加入二氯甲烷溶解產物，然后將溶液滴加至冷乙醚中，過濾，取沉淀，真空干燥，得到聚乙二醇與聚己內酯嵌段共聚物大分子引發劑mPEG-b-P(CL-co-BMPCL)。

2)將步驟1）制備的mPEG-P(CL-co-BMPCL)，單體2-[（叔丁氧基羰基）氨基]乙基-甲基丙烯酸酯（tBMA），以及二聯吡啶溶于丁酮。將上述混合物反復進行三次除氧后，加入溴化亞銅，在無氧和60℃條件下反應24小時。在純水中反復透析提純，冷凍干燥獲得聚乙二醇-b-聚己內酯-g-聚（2-[（叔丁氧基羰基）氨基]乙基-甲基丙烯酸酯）（mPEG-b- PCL-g-PtBMA）。

3)將mPEG-b-PCL-g-PtBMA溶于三氟乙酸，室溫攪拌2-5小時。在真空條件下將三氟乙酸旋蒸掉，然后加入N,N-二甲基甲酰胺溶解產物，將所獲溶液滴加到冷乙醚中，過濾，取沉淀。用無水乙醚洗滌兩次，真空干燥獲得聚乙二醇-b-聚己內酯-g-聚（氨基-乙基-甲基丙烯酸酯）（mPEG-b-PCL-g-PAEM）。

4)將PEG-b-PCL-g-PAEM溶于碳酸氫鈉水溶液中，加入S-乙基異硫脲氫溴酸鹽，室溫下攪拌反應48-96小時。然后在純水中透析提純，冷凍干燥后獲得聚乙二醇-b-聚己內酯-g-聚（胍基-乙基-甲基丙烯酸酯）（mPEG-b-PCL-g-PGEM，PECG）。

聚乙二醇單甲醚的分子量為2000 g/mol，聚己內酯的分子量范圍為3420-3990 g/mol，聚（γ-(2-溴-2-甲基丙酸酯)-ε-己內酯（BMPCL））的分子量范圍為834-973 g/mol，聚（胍基-乙基-甲基丙烯酸酯）的分子量范圍為516-18060 g/mol。

本發明所述的納米佐劑材料的制備步驟1）中，單體ε-CL與聚乙二醇單甲醚的摩爾比為30~35:1；BMPCL與ε-CL的摩爾比為1:10；辛酸亞錫的投料量為單體摩爾總數的0.05%。

本發明所述的納米佐劑材料的制備步驟2）中，單體tBMA與大分子引發劑mPEG-b-P(CL-co-BMPCL)的摩爾比為3~105:1。

本發明所述的納米佐劑材料的制備步驟3）中，三氟乙酸的體積（mL）與mPEG-b-PCL-g-PtBMA的質量（g）比例為5:1。

本發明所述的納米佐劑材料的制備步驟4）中，S-乙基異硫脲氫溴酸鹽與mPEG-b-PCL-g-PAEM的摩爾比為6~7:1。

本發明所述的表面胍基修飾的納米佐劑為聚乙二醇-b-聚己內酯-g-聚（胍基-乙基-甲基丙烯酸酯）共聚物在水溶液中自組裝形成的納米顆粒。

本發明所述的表面胍基修飾的納米佐劑的應用形式為納米佐劑與蛋白抗原、多肽抗原、核酸、免疫增強劑中任意一種或幾種的復合物溶液或凍干粉制劑。

本發明提供了所述的表面胍基修飾的納米佐劑具有積極的突出的有益效果：

本發明所述的納米佐劑能夠高效負載蛋白、多肽、核酸類抗原和免疫增強劑，所形成的抗原與納米佐劑的復合物具有長期的穩定性。冷凍干燥后能夠均勻的分散于水、PBS、或氯化鈉溶液中。

本發明所述的納米佐劑可以有效的刺激小鼠骨髓來源樹突狀細胞（BMDC）成熟，促進其表面CD80，CD86，CCR7等標志物分子的表達。

本發明所述的納米佐劑，能夠促進外源抗原被抗原遞呈細胞的交叉呈遞效果。

本發明所述的納米佐劑經皮內免疫接種可引起較強的免疫反應，表現為淋巴結中的相關免疫細胞因子大量分泌。

本發明所述的納米佐劑的材料合成與納米疫苗制備方法簡單、操作簡便、重復性好，適合于大規模生產。

附圖說明：

圖1：PECG共聚物的合成路線圖。

圖2：PECG共聚物核磁共振氫譜圖。

圖3：PECG納米佐劑的粒徑(a)與形貌圖(b)。

圖4：PECG自組裝納米粒促BMDCs成熟圖。

圖5：PECG納米佐劑促抗原交叉呈遞效果圖。

圖6：PECG納米佐劑體內皮下免疫后淋巴結中細胞因子表達情況。

具體實施方式

下面結合具體實施例，進一步詳細闡述本發明。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件以及手冊中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件；所用的通用設備、材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。

實施例1：mPEG-b-P(CL-co-BMPCL)的制備

將1.0 g無水聚乙二醇單甲醚（分子量2000 g/mol）、18.24 g ε-己內酯、4.87 g γ-(2-溴-2-甲基丙酸酯)-ε-己內酯，以及58 μL辛酸亞錫加入容器中，氮氣保護下，于130 ℃攪拌反應12小時。冷卻后，加入二氯甲烷溶解，滴加至冰乙醚中沉淀，過濾、干燥得到共聚物mPEG-b-P(CL-co-BMPCL)。

實施例2：mPEG-b-PCL-g-PtBMA的制備

將mPEG-b-P(CL-co-BMPCL)（0.626 g），2-[（叔丁氧基羰基）氨基]乙基-甲基丙烯酸酯（1.52 g）以及二聯吡啶（0.0365 g）溶于3 mL丁酮中。將上述混合溶液在液氮中冷卻，反復充氮氣與抽真空三次，然后加入溴化亞銅（0.0144 g），進一步抽真空后，于60 ℃條件下攪拌反應12小時。將產物封裝到透析袋中(截留分子量3500 Da)，在超純水中透析，冷凍干燥后得到mPEG-b-PCL-g-PtBMA共聚物。

實施例3：mPEG-b-PCL-g-PAEM的制備

將mPEG-b-PCL-g-PtBMA（1.0 g）溶于5 mL三氟乙酸，室溫攪拌5小時。在真空條件下將三氟乙酸旋干，然后加入5 mL N,N-二甲基甲酰胺溶解，將所獲溶液滴加到冷乙醚中，過濾，真空干燥獲得mPEG-b-PCL-g-PAEM。

實施例4：mPEG-b-PCL-g-PGEM的制備

將mPEG-b-PCL-g-PAEM（1.0 g）溶于10 mL 0.1M碳酸氫鈉溶液中，加入摩爾數為胍基兩倍的S-乙基異硫脲氫溴酸鹽，上述反應室溫攪拌48小時。將所獲溶液封裝到透析袋中，透析(截留分子量3500 Da) 72小時，冷凍干燥得到mPEG-b-PCL-g-PGEM，其核磁譜圖如圖2所示。

實施例1-4的制備過程見圖1。

實施例5：mPEG-b-PCL-g-PGEM（PECG）納米佐劑的自組裝

稱量20 mg PECG共聚物溶解于2 mL三氟乙醇，逐滴加入置于磁力攪拌器上內含10 mL PBS (pH=7.2, 0.01 M)的燒杯中。持續攪拌24 h，揮發掉三氟乙醇，將溶液體積補加到10 mL。通過馬爾文激光粒度儀和透射電子顯微鏡分別檢測PECG組裝體的粒徑大小與形貌（圖3）。

實施例6：PECG納米佐劑促BMDCs成熟

將1 mL BMDCs（密度為2×10⁶/mL）懸液加入6孔板，然后加入2 mL cRPMI1640培養基。將PECG納米粒加入鋪有小鼠骨髓來源樹突狀細胞 (bone marrow-derived cells, BMDCs)的孔板中，最終濃度為20 μg/mL。將6孔板轉移至5% CO₂，37℃細胞培養箱中培養24 h。收集各組細胞后離心（1500 rpm，5 min），取上清，置于-20 ℃保存備用。PBA（含有0.1% BSA的PBS溶液）洗細胞（1200 rpm，5 min）兩次，1 mL/次。收集細胞，使用1 mL PBA重懸各組細胞，在離心管中分別加入熒光素標記抗體兔抗鼠CCR7-PE單克隆抗體，兔抗鼠CD86-PE單克隆抗體，兔抗鼠CD40-PE單克隆抗體及其同型對照各1 μL，置于冰浴中30 min。PBA洗細胞（1200 rpm，5 min）兩次，各離心管中加入1.0 mL 2%多聚甲醛溶液，冰浴中固定30 min。PBA洗細胞（1200 rpm，5 min）兩次，1.0 mL PBA重懸細胞后，流式細胞儀檢測各組BMDCs活化相關信號分子CD86，CD40，CCR7的表達，結果如圖4所示。

實施例7：PECG納米佐劑促進抗原體外交叉呈遞

將BMDCs以6×10⁴/孔的密度鋪于U型底96孔板中，置于5% CO₂，37℃培養箱中培養過夜。次日，將裸抗原（雞卵清蛋白OVA）或封裝有OVA的PECG納米粒溶液加入96孔板中，濃度為50 μg/mL，以SINFEKL肽段及培養基分別作為陽性與陰性對照。繼續培養5小時后，使用DPBS輕柔洗細胞3次，然后將培養于含55 μM β-巰基乙醇，1 mM丙酮酸的cRPMI164培養基中的B3Z細胞（密度，5×10⁵）加入96孔板中。共培養24小時后，離心（500 rcf，7 min），棄上清，每孔加入150 μL CPRG裂解緩沖液（0.15 M氯酚紅-β-D-吡喃半乳糖，0.1% Trion-X-100，9 mM氯化鎂，100 μM巰基乙醇），避光孵育20小時。而后，將U型96孔板中的液體轉移至平底96孔板中，測定570 nm波長處的吸光值，結果如圖5所示。

實施例8：PECG納米佐劑的體內免疫應答

以6-8周，雌性BALB/C小鼠為動物模型，皮下注射PECG納米粒，間隔7天注射一次，共免疫三次。第三次免疫2周后，使用密度梯度離心法分離小鼠回流淋巴結中的淋巴細胞，與PECG納米粒共孵育48小時后，使用ELISA試劑盒檢測細胞上清中細胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-10、IL-6的濃度，結果如圖6所示。