本發明涉及丹酚酸A的新的醫藥用途，具體是指其在制備治療心腦血管疾病藥物方面的用途。
背景技術：
cAMP廣泛存在于各種細胞中，對細胞的功能和代謝起著重要的調節作用。藥理試驗表明，外源性cAMP具有舒張平滑肌、擴張血管、改善肝功能、促進神經再生、抑制皮膚外層細胞分裂和轉化異常細胞的功能，可促進呼吸鏈氧化酶的活性、改善心肌缺氧等。升高cAMP的含量可用于治療下列病癥，包括但不限于：血栓栓塞性疾病、周圍血管病、人工心臟瓣膜、充血性心力衰竭、冠脈搭橋手術、病毒性心肌炎、心律失常、甲亢、慢性肝炎、支氣管哮喘。【黨立等.環磷酸腺苷的臨床應用進展.山東科學，2007；20：61-64.】
血小板在血栓形成過程中，特別是動脈血栓和微血管血栓形成中起著關鍵作用。抗血小板藥可抑制血小板的黏附、聚集和釋放功能，阻抑血栓形成，多項循證醫學研究顯示加強抗血小板治療，可明顯減少急性冠脈綜合征患者心臟事件的發生率和有效減少缺血性腦卒中事件的發生。
細胞外和細胞內的鈣離子對于血小板的功能都起著重要的作用。細胞外的鈣離子是血小板聚集過程中的重要因素之一，而細胞內鈣離子的重新分布可能是血小板聚集的必要條件。隨著鈣離子釋放，胞內鈣濃度增高，與鈣調蛋白形成復合物，激活多種血小板內鈣依賴性酶，包括分解cAMP的磷酸二酯酶，促使糖原分解的磷酸化酶激酶，以及膜磷酸化相關的酶等。cAMP能抑制血小板的變形，顆粒中心化，分泌，釋放和聚集等反應。cAMP對血小板功能的抑制作用也主要是通過抑制Ca2+的釋放、降低胞內的Ca2+水平來實現的，因而使得磷脂酶不能被激活，花生四烯酸就不可能從血小板的膜磷脂中釋放出來。結果，前列腺素與TXA2的合成就不能進行。因此，文獻報道，對于鈣離子濃度的抑制、對于腺苷酸活化酶的抑制、對于血小板胞漿鈣離子濃度的抑制可用于治療下列疾病的一種或幾種：心肌梗塞、缺血性卒中、心絞痛、急性冠狀動脈綜合癥、冠狀動脈溶栓后再閉塞、血栓形成期間的閉塞和冠狀動脈再狹窄、中風、TIA(短暫性腦缺血發作或急性腦血管綜合征)、肺動脈高壓、糖尿病、外周血管疾病、心力衰竭、患有心血管和腦血管疾病的患者的臨床血管并發癥的二級預防、動脈粥樣硬化、血管介入性策略的結合藥物治療、周身血液血栓性疾病。
丹參為重要的傳統活血化瘀中藥，屬唇形科鼠尾草屬植物，具有抗血栓、擴張血管和改善微循環之功效，臨床常用于治療各種心腦血管疾病。丹酚酸A(Salvianolic acid A)為中醫常用活血化瘀藥丹參Salvia miltiorrhiza Bge中存在的酚酸類化合物，天然含量約為0.01％～0.08％之間，最早為北京藥物所黎蓮娘教授首先在丹參中發現，并經張均田，杜冠華等證明了其具一定的生物活性。但丹酚酸A對于促進血小板和/或血漿中cAMP含量升高、對于鈣離子濃度的抑制、對于腺苷酸活化酶的抑制、對于血小板胞漿鈣離子([Ca2+]i)濃度的抑制作用未見報道。
技術實現要素：
本發明公開了丹酚酸A在制備促進血小板和/或血漿中CAMP含量升高的藥物中的用途。其中所述的促進血小板和/或血漿中CAMP含量升高的藥物可用于治療以下病癥的一種或幾種：預防或治療溶栓、經皮冠狀動脈介入術或冠脈搭橋術等原因引起的心肌缺血再灌注損傷、血栓栓塞性疾病、周圍血管病、人工心臟瓣膜、充血性心力衰竭、冠脈搭橋手術、病毒性心肌炎、心律失常、甲亢、變態反應、免疫力低下、抑郁、慢性肝炎、支氣管哮喘，特別是可用于預防或治療溶栓、經皮冠狀動脈介入術或冠脈搭橋術等原因引起的心肌缺血再灌注損傷。
本發明還公開了，丹酚酸A在制備抑制血小板中磷酸二酯酶活性的藥物中的用途。其中所述的抑制血小板中磷酸二酯酶活性的藥物可用于治療以下病癥的一種或幾種：預防或治療溶栓、經皮冠狀動脈介入術或冠脈搭橋術等原因引起的心肌缺血再灌注損傷、心肌梗塞、缺血性卒中、心絞痛、急性冠狀動脈綜合癥、冠狀動脈溶栓后再閉塞、血栓形成期間的閉塞和冠狀動脈再狹窄、中風、TIA(短暫性腦缺血發作或急性腦血管綜合征)、肺動脈高壓、糖尿病、外周血管疾病、心力衰竭、患有心血管和腦血管疾病的患者的臨床血管并發癥的二級預防、動脈粥樣硬化、血管介入性策略的結合藥物治療、周身血液血栓性疾病，特別是可用于預防或治療溶栓、經皮冠狀動脈介入術或冠脈搭橋術等原因引起的心肌缺血再灌注損傷。
本發明還公開了丹酚酸A在制備促進腺苷酸活化酶活性的藥物中的用途。其中所述的促進腺苷酸活化酶活性的藥物可用于治療以下病癥的一種或幾種：預防或治療溶栓、經皮冠狀動脈介入術或冠脈搭橋術等原因引起的心肌缺血再灌注損傷、心肌梗塞、缺血性卒中、心絞痛、急性冠狀動脈綜合癥、冠狀動脈溶栓后再閉塞、血栓形成期間的閉塞和冠狀動脈再狹窄、中風、TIA(短暫性腦缺血發作或急性腦血管綜合征)、肺動脈高壓、糖尿病、外周血管疾病、心力衰竭、患有心血管和腦血管疾病的患者的臨床血管并發癥的二級預防、動脈粥樣硬化、血管介入性策略的結合藥物治療、周身血液血栓性疾病，特別是可用于預防或治療溶栓、經皮冠狀動脈介入術或冠脈搭橋術等原因引起的心肌缺血再灌注損傷。
本發明還公開了丹酚酸A在制備抑制血小板胞漿鈣離子濃度的藥物中的用途。其中所述的制血小板胞漿鈣離子濃度的藥物可用于治療以下病癥的一種或幾種：預防或治療溶栓、經皮冠狀動脈介入術或冠脈搭橋術等原因引起的心肌缺血再灌注損傷、心肌梗塞、缺血性卒中、心絞痛、急性冠狀動脈綜合癥、冠狀動脈溶栓后再閉塞、血栓形成期間的閉塞和冠狀動脈再狹窄、中風、TIA(短暫性腦缺血發作或急性腦血管綜合征)、肺動脈高壓、糖尿病、外周血管疾病、心力衰竭、患有心血管和腦血管疾病的患者的臨床血管并發癥的二級預防、動脈粥樣硬化、血管介入性策略的結合藥物治療、周身血液血栓性疾病，特別是可用于預防或治療溶栓、經皮冠狀動脈介入術或冠脈搭橋術等原因引起的心肌缺血再灌注損傷。
本發明采用體內、外實驗證明丹酚酸A有較好的抗血小板聚集效應，采用ADP、AA、凝血酶3種誘導劑檢測丹酚酸A對血小板聚集的作用，丹酚酸A對于ADP和凝血酶誘導劑引起的血小板聚集均有抑制作用，丹酚酸A能夠抑制AA誘導的血小板聚集，但作用較弱，處于一個平緩的抑制趨勢。環磷酸腺苷(cAMP)存在于血小板膜中，由ATP通過腺苷酸環化酶(AC)作用生成，又通過磷酸二酯酶(PDE)的作用而分解為5′-磷酸腺苷(5′-AMP)，因此內源性cAMP含量主要受AC和PDE調控，通過進一步測定ADP誘導的血小板內cAMP含量及血小板磷酸二酯酶和腺苷酸環化酶活性的影響，顯示丹酚酸A能夠升高血小板內cAMP的濃度，激活腺苷酸環化酶，并抑制磷酸二酯酶活性。細胞外和細胞內的鈣離子對于血小板的功能都起著重要的作用。細胞外的鈣離子是血小板聚集過程中的重要因素之一，而細胞內鈣離子的重新分布可能是血小板聚集的必要條件。隨著鈣離子釋放，胞內鈣濃度增高，與鈣調蛋白形成復合物，激活多種血小板內鈣依賴性酶，包括分解cAMP的磷酸二酯酶，促使糖原分解的磷酸化酶激酶，以及膜磷酸化相關的酶等。cAMP能抑制血小板的變形，顆粒中心化，分泌，釋放和聚集等反應。cAMP對血小板功能的抑制作用主要是通過抑制Ca2+的釋放、降低胞內的Ca2+水平來實現的，因而使得磷脂酶不能被激活，花生四烯酸就不可能從血小板的膜磷脂中釋放出來。結果，前列腺素與TXA2的合成就不能進行。本實驗采用熒光探針Fura-2定量測定丹酚酸A對ADP誘導所致的大鼠血小板胞漿中[Ca2+]i的影響。結果表明，ADP使血小板[Ca2+]i顯著升高，另一方面，使用抗血小板聚集等濃度的丹酚酸A卻使上述誘導劑刺激而升高的[Ca2+]i產生不同程度的降低，且其降[Ca2+]的濃度與其抗聚集的濃度基本一致。綜上所述丹酚酸A具有肯定的抑制血小板聚集的作用，該機制為丹酚酸A增加血小板內cAMP的含量，降低血小板[Ca2+]i等環節有關。迄今為止，還沒有發現丹酚酸A抗血小板聚集是通過增加血小板內cAMP的含量、降低血小板[Ca2+]i的報導。
cAMP廣泛存在于各種細胞中，對細胞的功能和代謝起著重要的調節作用。藥理試驗表明，外源性cAMP具有舒張平滑肌、擴張血管、改善肝功能、促進神經再生、抑制皮膚外層細胞分裂和轉化異常細胞的功能，可促進呼吸鏈氧化酶的活性、改善心肌缺氧等。升高cAMP的含量可用于治療下列病癥，包括但不限于：血栓栓塞性疾病、周圍血管病、人工心臟瓣膜、充血性心力衰竭、冠脈搭橋手術、病毒性心肌炎、心律失常、甲亢的治療、對周圍神經再生作用用于神經系統疾病的治療、慢性肝炎、支氣管哮喘的呼吸系統疾病。
體內血栓形成是一個復雜的生理、生化及病理過程。當血管壁損傷；凝血活性增高，血小板粘附、聚集性增高；血流緩慢、血液粘度增高時就容易形成血栓。動脈血栓栓塞性疾病是人類重要的致死疾病之一，由于血小板聚集是正常凝血機制中的一個關鍵環節，血小板的粘附、聚集、釋放反應是動脈血栓啟動的一個重要機制。本發明利用大鼠頸總動脈-頸外靜脈血流旁路形成血小板血栓，觀察丹酚酸A不同劑量對血栓形成的影響。結果顯示丹酚酸A劑量依賴性地降低血栓濕重，其機制研究發現丹酚酸A各劑量組對血漿中TXB2，6-keto-PGF1α以及TXB2/6-keto-PGF1α比值沒有明顯影響，但呈劑量依賴性升高大鼠血漿中cAMP含量。在丹酚酸A對大鼠血液流變學指標觀察中發現丹酚酸A 5mg/kg、10mg/kg劑量組全血粘度明顯低于模型組，10mg/kg組同時能降低大鼠血漿粘度、紅細胞壓積，10mg/kg組效果與賴氨匹林相當。
具體實施方式
實驗例1：丹酚酸A對體外不同誘導劑血小板聚集的影響
1、材料
丹酚酸A，山東靶點藥物研究有限公司提供
乙酰水楊酸(ASA)，sigma公司A5376
3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)，sigma公司I5879
二磷酸腺苷(ADP)，sigma公司A2754
凝血酶(Thr)，sigma公司T4648
花生四烯酸(AA)，sigma公司BMA001
乙二胺二乙酸二鈉鹽(EDTA.Na2)，天津市化學試劑一廠，批號：080616
乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)，sigma公司E4378
Hepes，sigma公司H3375
牛血清白蛋白第五組分(BSA)，Roche 738328
枸鹽酸鈉，國藥集團化學試劑有限公司，批號：F20071212
無水氯化鈣(CaCl2)，國藥集團化學試劑有限公司，批號：F20090113
氯化鉀(KCl)，天津市科密歐化學試劑有限公司，批號：20071008
無水氯化鎂(MgCl2)，天津市福晨化學試劑廠，批號：20030928
碳酸氫鈉(NaHCO3)，天津市福晨化學試劑廠，批號：20080402
氯化鈉(NaCl)，國藥集團化學試劑有限公司，批號：F20080723
磷酸二氫鉀(KH2PO4)，天津市科密歐化學試劑有限公司，批號：20080822
無水葡萄糖(Glucose)，天津市化學試劑一廠，批號：020202
LBY-NJ4血小板聚集儀，北京普利生公司產品
Z36HK型低速冷凍離心機，德國Hermle公司
AR1140萬分之一電子天平，OHAUS Corporation
AR2130千分之一電子天平，OHAUS Corporation
動物：SPF級SD大鼠，雄性，體重300～350g，購于北京大學醫學部實驗動物中心，合格證號：SCXK(京)2006-0008
2、方法與結果
取SD大鼠，10％水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，3.8％枸鹽酸鈉抗凝(1∶9)，1000rpm，20℃離心8min，取上清得PRP。PRP以2500rpm離心10min，得到血小板沉淀，用改良的無Ca2+Tyrode-Hepes洗滌液(NaCl 129mM，KCl 2.8mM，NaHCO3 8.9mM，MgCl2 0.8mM，KH2PO4 0.8mM，EGTA 2mM，glucose 5.6mM，Hepes 10mM，BSA 0.35％，pH7.4)洗滌血小板兩次，2500rpm離心10min，最后將血小板懸浮于含Ca2+(1mM)的Tyrode-Hepes緩沖液(NaCl 129mM，KCl 2.8mM，NaHCO3 8.9mM，MgCl2 0.8mM，KH2PO4 0.8mM，CaCl2 1mM，glucose 5.6mM，Hepes 10mM，BSA 0.35％，pH7.4)中，調節血小板數4.5×108個/ml。取血小板懸液280μl，加入10μl藥物或等體積溶媒孵育5min后，加入誘導劑ADP(終濃度10μmol/l)，AA(終濃度0.5mmol/l)，Thr(終濃度0.7u/ml)誘導血小板聚集。記錄血小板5min內聚集率，并計算血小板聚集抑制率(％)。
數據用表示，以組間t檢驗進行統計學處理，結果顯示，丹酚酸A能夠抑制ADP、AA、Thr誘導的大鼠血小板聚集，其作用強度為：ADP＞Thr＞AA，IC50分別為：ADP：389.7μg/ml，Thr：912μg/ml，AA：1499μg/ml。丹酚酸A能夠抑制AA誘導的血小板聚集，但作用較弱，處于一個平緩的抑制趨勢。對于凝血酶誘導的血小板聚集，在600μg/ml濃度以下，幾乎沒有抑制作用，但當濃度增大以后，丹酚酸A能夠較好的抑制血小板聚集。
實驗例2：丹酚酸A對血小板內cAMP含量及血小板中磷酸二酯酶和腺苷酸環化酶活性的影響
1、丹酚酸A對血小板內cAMP含量的影響
1.1材料
丹酚酸A，山東靶點藥物研究有限公司提供
3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)，sigma公司，批號：I5879，用生理鹽水100℃水浴中溶解，濃度為10mM。
二磷酸腺苷(ADP)，Sigma公司，批號：A2754，用生理鹽水配制成濃度為300μmol/l的溶液。
乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA)，天津市化學試劑一廠，批號：080616，用去離子水配制。
乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)，sigma公司，批號：E4378
Hepes，sigma公司，批號：H3375
牛血清白蛋白第五組分(BSA)，Roche公司，批號：738328
枸鹽酸鈉，國藥集團化學試劑有限公司，分析純，批號：F20071212，臨用時用超純水配制成3.8％的溶液。
無水氯化鈣(CaCl2)，國藥集團化學試劑有限公司，分析純，批號：F20090113
氯化鉀(KCl)，天津市科密歐化學試劑有限公司，優級純，批號：20071008
無水氯化鎂(MgCl2)，天津市福晨化學試劑廠，分析純，批號：20030928
碳酸氫鈉(NaHCO3)，天津市福晨化學試劑廠，分析純，批號：20080402
氯化鈉(NaCl)，國藥集團化學試劑有限公司，分析純，批號：F20080723
磷酸二氫鉀(KH2PO4)，天津市科密歐化學試劑有限公司，分析純，批號：20080822
無水葡萄糖(Glucose)，天津市化學試劑一廠，分析純，批號：020202
AR1140電子天平：OHAUS Corporation
動物：SPF級SD大鼠，雄性，體重300～350g，購于北京大學醫學部實驗動物中心，合格證號：SCXK(京)2006-0008
1.2方法與結果
取SD大鼠，10％水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，3.8％枸鹽酸鈉抗凝(1∶9)，制備PRP。PRP以2500rpm離心10min，得到血小板沉淀，用改良的無Ca2+Tyrode-Hepes洗滌液洗滌兩次，最后將血小板懸浮于含Ca2+(1mM)的Tyrode-Hepes緩沖液中，調節血小板數4.5×108個/ml，備用。取血小板懸液280μl，加入10μl不同濃度藥物或等體積溶媒孵育5min后，加入ADP(終濃度10μmol/l)誘導血小板聚集。反應5min后，加入10μl EDTA終止反應，立即放入100℃水浴中5min，冷卻至室溫后，4℃，4000rpm，離心10min，取上清液，-20℃凍存，放免法測血小板中cAMP含量。
數據用表示，以組間t檢驗進行統計學處理，結果加入ADP誘導血小板聚集后，血小板中cAMP含量降低，注射用丹酚酸A不同濃度均能一定程度上升高cAMP含量，從400μg/ml濃度開始，與空白對照比較，作用有顯著性差異。
2、丹酚酸A對血小板磷酸二酯酶和腺苷酸環化酶活性的影響
2.1材料
丹酚酸A，山東靶點藥物研究有限公司提供
[3H]cAMP(12.4Ci/mmol)，購自PerkinElmer
ATP，購自sigma公司
蛇毒，購自sigma公司
腺苷為BDH產品
Triton閃爍液，購自華美生物工程公司
茶堿，上海試劑二廠產品
福斯高林(Forskolin)，sigma公司產品，貨號：F6886
動物：健康家兔
2.2方法與結果
2.2.1血小板PDE的制備
健康家兔頸總動脈插管取血，以0.077mol/l EDTA抗凝，200×g離心10min，分離PRP，然后將PRP在室溫下繼續離心10min(1200×g)，得到血小板，用含0.15mol/l NaCl，0.15mol/l Tris-HCl，0.077mol/l EDTA的緩沖液洗滌血小板兩次。洗過的血小板懸浮于適量的無鈣Kreb’s液中，并加入少量蘇來醇溶液，于液氮快速凍融三次后，2500×g 4℃離心20min，上清部分即為血小板PDE溶液，置-20℃保存。
2.2.2PDE活性測定
各試管內依次加入50mM Tris，5mM MgSO4溶液100μl，藥液50μl(對照管為50μl 50mM Tris緩沖液)，純化的3H-cAMP 50μl(100,000cpm)，再加PDE溶液50μl，置30℃水浴溫孵15min后，立即放入100℃水浴2min，冷卻后再加入蛇毒10μl，30℃溫孵10min，再加入740μl 2.5mM腺苷溶液，將上述試管加于2×0.7cm的QAE Sephadex A-25柱后，加適量的20mM甲酸銨溶液洗脫，取收集液1.5ml加入甲苯-Triton(2∶1)閃爍液10ml，用液閃爍儀測定各管的脈沖數。所有樣品均作雙管測定，以3H-cAMP轉化率表示PDE的活性。
空白管用50μl 50mmol/l Tris緩沖液代替PDE溶液，總計數為50μl3H-cAMP加5ml 20mmol/l甲酸銨，取其中1.5ml加10ml甲苯-Triton閃爍液所測得的脈沖數。
2.2.3血小板AC的制備
將2.2.1中得到的血小板沉淀懸浮于1ml含145mM NaCl，10mM Tris溶液中，儲存于-70℃備用，用Lowry法測定酶粗提物的蛋白含量。
2.2.4AC活性的測定
測定血小板膜腺苷酸環化酶活性的反應液每管為450μl，含(2mM ATP、4mMMgCl2、5mM茶堿、290mM NaCl、250mM Tris、0.5mM EGTA、藥液或溶媒50μl)，將50μl血小板膜粗提物加入管中，立即于37℃孵育20min，然后將反應管置沸水中滅活3min，迅速冰水冷卻，離心后取適量上清液以蛋白激酶結合法測cAMP含量，空白對照管加50μl經煮沸3min的血小板膜粗提物代替活酶。酶基礎活性以pmol.cAMP/mg protein/min表示。
數據用表示，以組間t檢驗進行統計學處理，結果見表3。
實驗證明，丹酚酸A能激活腺苷酸環化酶，并抑制磷酸二酯酶活性，這可能是丹酚酸A能升高血小板中cAMP含量的作用機理。
3丹酚酸A對血小板磷酸二酯酶和腺苷酸環化酶活性的影響(n＝5)
實驗例3：丹酚酸A對血小板內游離[Ca2+]i的測定
1、材料
丹酚酸A，山東靶點藥物研究有限公司提供
二磷酸腺苷(ADP)：sigma公司A2754
乙酰羥甲基酯(Fura-2/AM)：sigma公司產品
TritonX-100，購自華美生物工程公司
動物：SPF級SD大鼠，雄性，體重300～350g，購于北京大學醫學部實驗動物中心，合格證號：SCXK(京)2006-0008。
2、方法與結果
大鼠腹主動脈取血，3.8％枸鹽酸鈉(1∶9)抗凝，制備PRP。取PRP，加入終濃度為2μmol/L的Fura-2/AM，37℃避光振搖30min。用無Ca2+ Tyrode-Hepes液洗滌2次，將血小板外多余的Fura-2/AM洗去，最后懸浮于含Ca2+Tyrode-Hepes液中，并調整血小板濃度值為4-5×108/mL。取該血小板懸液280μl，加入不同濃度的丹酚酸A各20μl，37℃孵育5min后加入ADP(終濃度約為10μmol/L)，37℃孵育1min，用熒光分光光度計測Ca2+濃度，固定發射光波長505nm，激發光波長340nm和380nm(波寬5nm)，測定熒光強度比值(R)，加入0.1％Triton-100(v/v)，混勻后測得最大熒光強度比值(Rmax)和Sb2，加入EGTA(終濃度10mmol/L)，測得最小熒光強度比值(Rmin)和Sf2。根據公式計算[Ca2+]i。
[Ca2+]i(nmmol/l)=Kd×R-RminRmax-R×Sf2Sb2]]>
公式中Kd為Ca2+結合Fura-2的解離常數，R為激發光波長340和380nm時Fura-2的熒光強度比值，Rmax為加入TritonX-100時使得Fura-2與Ca2+的結合達到飽和時所測得的熒光強度比值，Rmin為加入EGTA使Ca2+游離測得的熒光強度比值。Sf2和Sb2分別代表Ca2+與Fura-2的結合為0及飽和時，在Ex 380nm測得的Fura-2的熒光強度。
數據用表示，以組間t檢驗進行統計學處理，結果丹酚酸A能夠降低大鼠血小板胞漿鈣離子濃度。