一種含千層紙素用于治療白血病的組合物及其應用的制作方法

本發明屬于抗腫瘤藥物領域，涉及一種含千層紙素用于治療白血病的組合物及其應用。

背景技術：

千層紙素(Oroxylin A)是黃芩的活性組分之一，具有明顯的抗腫瘤作用，是一個具有廣闊應用前景的天然抗腫瘤藥物。目前不少文獻對千層紙素的抗腫瘤作用及誘導凋亡和周期阻滯進行了系統的研究，發現千層紙素對體外培養的人肝癌細胞HepG2有顯著的生長抑制作用，且對ICR小鼠實驗性移植瘤S₁₈₀也具有顯著的生長抑制作用，抑制率最高可達40％以上，作用于低分化人胃腺癌細胞株BGC-823導致其周期阻滯于G2/M期，提示千層紙素可以誘導腫瘤細胞凋亡，并且可以針對細胞周期檢測點調控腫瘤細胞生長。但是目前沒有千層紙素對白血病影響的研究報道。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種含千層紙素的抗白血病組合物。

本發明的另一個目的是提供上述組合物在制備治療白血病藥物中的應用。

全反式維甲酸(ATRA)的治療對U937和HL-60等非急性早幼粒細胞白血病無效，TNFα可促進U937和HL-60分化，但分化過程中有明顯的副作用抑制其分化效果，千層紙素聯用TNFα可增敏細胞對TNFα的反應。

本發明的目的是通過下列技術方案實現的：

一種藥物組合物，該藥物組合物的活性成分包含千層紙素和腫瘤壞死因子。

所述的藥物組合物的活性成分含有下列濃度比例的組分：

千層紙素10～50μM：腫瘤壞死因子10～20ng/mL。

所述的藥物組合物在制備治療白血病的藥物中的應用。

所述的白血病為急性髓系白血病。

本發明的有益效果：

本發明通過實驗證明了千層紙素與TNFα聯用能夠增強TNFα抑制人白血病細胞株NB4、細胞株U937-MDR以及細胞株HL-60-resistant的活力，也能增強TNFα抑制人AML原代細胞的活力，延長人AML原代細胞接種小鼠的生存期，可用于制備治療白血病的藥物，具有較好的臨床應用前景。

附圖說明

圖1：千層紙素增強TNFα對AML細胞活力的抑制。

圖2：千層紙素增強TNFα對AML細胞活力的抑制。

圖3：TNFα聯用千層紙素延長人AML原代細胞接種小鼠的生存期。

具體實施方式：

以下通過實施例對本發明作進一步的闡述。

實施例1

本研究主要是將黃酮類抗腫瘤化合物與抗腫瘤藥物腫瘤壞死因子TNFα聯合，用于治療急性髓系白血病(AML)。通過體內外研究發現，千層紙素能夠與TNFα聯合增效。

1、實驗材料

1.1試劑

(1)千層紙素(oroxylin A)購自江蘇省腫瘤發生與干預重點實驗室(中國藥科大學)，使用前用二甲亞砜(DMSO)將藥物粉末配制為0.5M的濃度的母液，臨用前用細胞培養液配成所需濃度。全反式維甲酸(ATRA)購自美國Sigma公司，溶解于DMSO配制成濃度為20mM的母液。

(2)重組人腫瘤壞死因子α(TNFα)購自Prospec-Tany TechnoGene股份有限公司。使用前先用無菌水將粉末配置成1.0mg/ml濃度的母液，再用0.1％BSA將其稀釋為1μg/ml的儲備液，-20℃分裝保存。臨用前用細胞培養液配成所需濃度。

(3)細胞培養試劑

①培養液：RPMI-1640培養基，購自美國GIBCO公司。取RPMI-1640粉末10.39g溶于1000ml滅菌三蒸水中，并加入2.0g NaHCO₃，用1M鹽酸調pH值至7.0，圓筒式過濾器過濾除菌、分裝，4℃冰箱保存。使用前加入100U/ml的青霉素和100U/ml的鏈霉素。

②胎牛血清：美國GIBCO公司產品。經56℃水浴滅活30min，分裝并保存于-20℃低溫冰箱中。

③PBS緩沖液：稱取NaCl 8.0g、KCl 0.20g、Na₂HPO₄·H₂O 1.56g、KH₂PO4 2.0g，溶于1000ml三蒸水中，高壓滅菌，4℃冰箱保存。

(4)淋巴細胞分離液，南京晶美公司產品。

(5)MTT貯液(5mg/ml溶于PBS)：美國Sigma公司產品。取MTT粉末1.0g溶于20ml PBS溶液中，避光超聲溶解。

(6)細胞分化檢測相關試劑

人抗鼠CD11b-PE，anti-CD14-FITC抗體購自Miltenyi公司。

牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)購自瑞士Roche公司。

(7)全反式維甲酸(ATRA)購自美國Sigma公司，溶解于DMSO配制成濃度為20mM的母液。

(8)千層紙素(oroxylin A)購自江蘇省腫瘤發生與干預重點實驗室(中國藥科大學)，做成靜脈注射劑。

(9)重組人腫瘤壞死因子α(TNFα)(500,000IU/ml)購自上海維科生物醫藥有限公司。小鼠靜脈注射(3,000IU/kg)。

1.2實驗儀器

(1)YJ-875型醫用凈化工作臺：蘇州凈化設備廠生產。

(2)3111型水套式CO2培養箱：美國Thermo electron公司產品。

(3)電子天平：北京賽多利斯儀器系統有限公司產品。

(4)ELX800酶聯免疫檢測儀：美國Bio-tek公司產品。

(5)QIUJING血細胞計數板：中國上海求精生化試劑儀器有限公司產品。

(5)Olympus相機：日本Olympus公司產品。

(6)LD4-2普通離心機：北京醫用離心機廠產品。

(7)5417R型臺式冷凍高速離心機：德國Eppendorf公司產品。

(8)THZ-312型臺式恒溫振蕩器：上海精宏試驗設備有限公司產品。

1.3細胞株

人白血病細胞株NB4購自上海中國科學院細胞所，細胞株U937-MDR和HL-60-resistant由阿爾伯特.愛因斯坦醫學院的Robert E.Gallagher教授實驗室構建，通過廣州吉妮歐生物科技有限公司購買。人AML原代細胞購買于江蘇省人民醫院血液科。所有細胞均用含100U/ml青霉素、100mg/ml鏈霉素和10％胎牛血清的RPMI1640培養液培養。

NB4為急性早幼粒細胞白血病(APL)細胞株，U937-MDR為U937多藥耐藥株，HL-60-resisitant為HL-60的全反式維甲酸ATRA耐藥株。分化誘導劑全反式維甲酸(ATRA)對NB4有效，作為陽性對照；U937和HL-60都是非急性早幼粒細胞白血病的急性髓系白血病(AML)，都無法響應全反式維甲酸(ATRA)的治療。

1.4實驗動物

品系：NOD/SCID小鼠；

周齡：6-8周；

體重：18-22g；

飼養條件：顆粒飼料；SPF空調房間，溫度18-24℃，相對濕度70％。

購自中國科學院上海實驗動物中心。

2、實驗方法

2.1淋巴細胞分離液分離人白血病細胞

人外周血中各種細胞的密度不同，人紅細胞密度為1.093，粒細胞為1.092，淋巴細胞為1.074±0.001。密度梯度離心法的原理主要根據各類血細胞比重的差異，利用比重介于某兩類細胞之間的細胞分離液對血液離心，使一定比重的血細胞按相應的密度梯度分布于不同的獨立帶，從而達到分離的目的。將無菌的10ml離心管中加入2ml淋巴細胞分離液。將2ml肝素抗凝管(或枸櫞酸鈉)中的靜脈血與等量無血清培養基充分混勻后，用移液器沿管壁緩慢滴加于分層液面上，注意保持清楚的界面。2000rpm離心20min。離心后管內分為三層在上、中層界面處有一以單個核細胞為主的白色云霧狹窄帶。單個核細胞包括淋巴細胞和單核細胞。用毛細管或吸頭插到云霧層，吸取單個核細胞。然后置于另一離心管中。加入5倍體積的無血清培養基液洗滌，上下顛倒數次混勻，1500rpm離心15min。棄上清，再重復洗滌細胞1次。末次離心后，棄上清，盡可能將上清吸凈。加入1ml含有10％小牛血清的RPMI1640，重懸細胞。細胞分離好后立即使用。離心示意圖如下：

2.2MTT實驗

活細胞內的線粒體脫氫酶能將MTT還原為藍紫色的結晶甲臜，其溶解液顏色的深淺與細胞的活力大小呈正比。將實驗所需處于對數生長期的細胞按一定的濃度接種于96孔酶標板內。細胞接種濃度一般在0.5～2×10⁴個/孔，每孔內體積為50μl。并加入50μl終濃度20μM的千層紙素預處理24h。接著加入100μl不同終濃度(10，20ng/mL)的TNFα繼續置于孵箱內培養至96h后，每孔加入20μl MTT溶液。繼續孵育4h后將每孔的上清液吸凈。每孔加入100μl DMSO，放于微型振蕩器上振動5min使結晶溶解。待結晶完全溶解后將其放于酶標儀上檢測，檢測波長為570nm。將檢測后的吸光值整理后按下面的公式計算藥物對細胞的生長抑制率。

2.3流式表面抗原檢測

隨著細胞發生分化，細胞膜表面蛋白抗原也相應發生改變，這些與分化有關的蛋白稱為分化抗原。可以通過檢測細胞表面分化抗原來較為精確地判斷細胞是否發生分化。其中，CD11b是髓系分化成熟的標志抗原。TNFα聯用千層紙素或ATRA作用于人細胞系及人AML原代細胞孵育96h后收集細胞并計數，將各組細胞調至同一密度(5×10⁵個/ml)，用含0.5％BSA的PBS緩沖液封閉細胞表面的非特異性結合位點，離心后重懸，加入抗體，使PE標記的CD11b及FITC標記的CD14抗體與待測細胞表面的CD抗原結合，再用免疫熒光流式細胞計量術(FCM)計數熒光標記的陽性細胞，與未加抗體的經同樣處理方式處理的細胞作對照，并作同型對照。

2.3人AML原代細胞NOD/SCID小鼠模型建立方法

(1)取AML病人新鮮血液樣本，用淋巴細胞分離液分離出單個核細胞，無血清培養基RPMI 1640重懸待用。

(2)動物輻照。將NOD/SCID小鼠進行X射線輻照，輻照量為2.4Gy。

(3)輻照后24小時內進行接種，將原代細胞離心后重懸為最終密度為1×10⁷個/ml，用空針抽吸，每次抽吸前將細胞混勻，以0.1ml(1×10⁶個)接種于NOD/SCID小鼠尾靜脈。

(4)試驗設空白組，陰性對照組，單藥組和聯用組。空白組，陰性對照組給生理鹽水，單藥組給予80mg/kg的千層紙素或3,000IU/kg的TNFα(按人臨床使用劑量與小鼠進行換算)，千層紙素腹腔注射隔天給藥，TNFα尾靜脈注射給藥，每周周三到周六給藥，給共給藥30天。

(5)給藥期間，觀察各組小鼠的生存狀態。記錄小鼠死亡情況。

(6)整理結果，出具報告。

3、實驗結果

(1)TNFα聯用千層紙素對AML細胞株細胞活力的影響

通過MTT測定不同濃度的TNFα(10，20ng/mL)和20μM千層紙素各自單用或兩者聯用4天后，NB4，U937-MDR和HL-60-resistant細胞活力的變化。實驗結果顯示(圖1A)，與單獨用藥組相比，TNFα聯用千層紙素顯著地抑制三種細胞的活力。同樣，在人AML原代細胞中，TNFα聯用千層紙素也能夠顯著抑制細胞活力(圖1B)。

(2)TNFα聯用千層紙素對AML細胞株分化相關表面抗原的影響

如圖2所示，與單獨用藥組相比，TNFα聯用千層紙素給藥后，NB4，U937-MDR和HL-60-resistant細胞表面CD11b和CD14兩種表面抗原均明顯增加，差異均有統計學意義。說明，TNFα聯用千層紙素能夠誘導這三種白血病細胞向成熟的方向變化，且具有單核系分化特征。同時，TNFα聯用千層紙素給藥后，人原代AML細胞表面CD11b和CD14兩種表面抗原也發生明顯增加，分化能力顯著提高。

(3)TNFα聯用千層紙素在體內對人AML細胞接種NOD/SCID小鼠模型的影響

如圖3所示，與陰性對照組相比，TNFα聯用千層紙素能夠顯著延長接種人AML原代細胞的NOD/SCID小鼠的生存期。