生物種植體以及在基體上制備活性因子的方法與流程

本發明涉及生物領域，具體而言，涉及一種生物種植體以及在基體上制備活性因子的方法。

背景技術：

現有的生物種植體多為單一材料制成，例如鈦合金等，這些材料具有良好的生物相容性，但難以具有其他的特性，例如促進骨生長等。

若想要生物種植體具有這些特性，則需要對種植體進行表面改性，加入具有這些效果的成分。但現有技術中的表面改性方法會破壞種植體的原結構，否則改性效果不夠持久穩定。

技術實現要素：

本發明的主要目的在于提供一種生物種植體以及在基體上制備活性因子的方法，以解決現有技術中的難以使種植體具有活性因子的問題。

為了實現上述目的，根據本發明的一個方面，提供了一種生物種植體，包括基體和活性因子，活性因子通過黏合劑黏附在基體上，黏合劑包括聚多巴胺。

進一步地，活性因子包括用于促進成骨的脂聯素。

進一步地，基體具有用于促進骨質長入的微孔結構。

根據本發明的另一方面，提供了一種在基體上制備活性因子的方法，包括：使聚多巴胺生成在基體的表面；將帶有聚多巴胺的基體與活性因子接觸，使得活性因子通過聚多巴胺黏附在基體上。

進一步地，方法包括：將基體浸入包括多巴胺的堿性溶液中，以使聚多巴胺生成在基體的表面。

進一步地，方法包括：將基體浸泡在含有多巴胺的三羥甲基氨基甲烷的堿性溶液中；然后沖洗除去基體表面殘留的未牢固粘附的聚多巴胺顆粒；然后將含有聚多巴胺涂層的基體再浸泡入含有活性因子的溶液中，將活性因子接枝在基底表面。

進一步地，含有多巴胺的三羥甲基氨基甲烷的堿性溶液的濃度為3mg/ml至5mg/ml。

根據本發明的另一方面，還提供了一種在基體上制備活性因子的方法，包括：將多巴胺鹽酸鹽和活性因子溶解于堿性溶液，配置成混合溶液；將基體浸入混合溶液，并浸泡預定時間，使得活性因子通過聚多巴胺黏附在基體上。

進一步地，將多巴胺鹽酸鹽和活性因子溶解于三羥甲基氨基甲烷的堿性溶液，配置成混合溶液。

進一步地，混合溶液的濃度為3mg/ml至5mg/ml。

本發明的生物種植體采用含有聚多巴胺的黏合劑將活性因子黏附在基體上，聚多巴胺具有良好的粘合效果，能夠與基體材料表面形成較強的相互作用，并且聚多巴胺的基團還可以接枝活性因子，因此可以將活性因子穩定的黏附在基體的表面，并且不會破壞基體的結構。

附圖說明

構成本申請的一部分的說明書附圖用來提供對本發明的進一步理解，本發明的示意性實施例及其說明用于解釋本發明，并不構成對本發明的不當限定。在附圖中：

圖1示出了脂聯素促進間充質干細胞成骨向分化的試驗效果圖；

圖2示出了經脂聯素處理后間充質干細胞成骨相關基因表達試驗的柱狀圖。

具體實施方式

需要說明的是，在不沖突的情況下，本申請中的實施例及實施例中的特征可以相互組合。下面將參考附圖并結合實施例來詳細說明本發明。

根據本發明的一個方面，提供了一種生物種植體，包括基體和活性因子，活性因子通過黏合劑黏附在基體上，黏合劑包括聚多巴胺。

本發明的生物種植體采用含有聚多巴胺的黏合劑將活性因子黏附在基體上，聚多巴胺具有良好的粘合效果，能夠與基體材料表面形成較強的相互作用，并且聚多巴胺的基團還可以接枝活性因子，因此可以將活性因子穩定的黏附在基體的表面，并且不會破壞基體的結構。

本發明中的活性因子，也稱生長因子，活性生長因子，活性細胞因子，是一類通過與特異的、高親和的細胞膜受體結合，調節細胞生長與其他細胞功能等多效應的多肽類物質，多數由100個左右氨基酸組成。生長因子有多種，活性因子對不同種類細胞具有一定的專一性。

本發明的活性因子優選地為促進骨生長的活性因子。

海洋生物貽貝的足腺細胞能分泌出一種高強度粘液，在海水中凝固成足絲，貽貝依靠這些足絲緊密附著在其他物體的表面上。這種粘液的主要成分是貽貝黏附蛋白，以下簡稱maps，這種蛋白質可以在潮濕的環境中迅速固化，與基體材料表面形成較強的相互作用。

研究發現，貽貝的足絲與黏附基體的maps界面層中含有大量蛋白質組分mfp25，其氨基端序列中含有近30％的l2多巴胺和15％的賴氨酸殘基，這些基團是賦予maps特殊黏附性能的關鍵成分。因此作為l2多巴胺(以下簡稱pda)的鄰苯二酚基團和賴氨酸的氨基官能團，能夠很好地模擬蛋白質組分mfp25，即能夠具有良好的黏附性能。

pda不僅具有良好的粘附性能，并且其基團能夠接枝活性因子，例如含有氨基和巰基的活性分子，因此可以利用pda將活性因子穩定的黏附在基體的表面，并且不會破壞基體的結構。

pda的形成過程簡單且不需要有機溶劑，僅需將基體浸入含多巴胺(以下簡稱da)的堿性tris-hcl緩沖液或其他堿性溶液中，就可以在表面形成pda層，因此，pda能夠應用于材料的表面改性。其中tris-hcl緩沖液又稱三(羥甲基)氨基甲烷、氨丁三醇、緩血酸銨或三羥甲基氨基甲烷，其在25℃時的濃度為0.05mol/l。

優選地，活性因子包括用于促進成骨的脂聯素。

脂聯素(adiponectin，以下簡稱apn)是動物及人類脂肪細胞分泌的一種內源性生物活性多肽或蛋白質，由247個氨基酸組成，存在2種受體(adipor1和adipor2)，成骨細胞和破骨細胞均表達脂聯素受體。體外實驗證明，脂聯素激活adipor1/jnk、adipor1/p38信號通路誘導人成骨細胞的增殖及分化，促進其成骨功能。同時，脂聯素處理小鼠單核細胞后，可抑制nf-kappab道路的激活，進而抑制小鼠單核細胞向破骨細胞分化成熟。上述研究表明，脂聯素在骨代謝過程中起重要的調控作用，但它的半衰期短，局部應用時很快被稀釋和代謝。

圖1示出了脂聯素促進間充質干細胞成骨向分化的試驗效果，其中成骨向分化的間充質干細胞經由茜素紅染色，圖中左側培養皿未加入脂聯素，右側培養皿加入了脂聯素。可見經由脂聯素的作用，促進了間充質干細胞成骨向分化。

圖2通過柱狀圖形式示出了經脂聯素處理后間充質干細胞成骨相關基因表達試驗的結果，其中間充質干細胞被g脂聯素處理24小時以上。每組柱狀圖中的左側柱表示未加入脂聯素的控制組數據，中間柱表示經脂聯素處理后的數據，右側柱表示脂聯素的上調作用被appl1sirna所阻斷的對照組數據。可見經由脂聯素的作用，促進了間充質干細胞成骨向分化。圖中各英文簡稱的含義分別為：alp，堿性磷酸酶；bsp，骨唾液酸蛋白；con，骨鈣素；opn，骨橋蛋白；col1，ⅰ型膠原；appl1，銜接蛋白1。

可替換地，活性因子包括用于促進成骨的重組人骨形態發生蛋白-2，即rhbmp-2。

優選地，基體具有用于促進骨質長入的微孔結構。該微孔結構可以是骨小梁結構。

優選地，基體的材料可以為鈦、鈦合金、不銹鋼、陶瓷、鈣質、骨質、有機材料等多種材料。

本發明的生物種植體的一種優選實施例為采用3d打印技術制備表面具有微孔結構的鈦片，利用聚多巴胺的強力黏附特性及其特殊基團可接枝生物活性物質的特點，在種植體表面接枝脂聯素(apn)促成骨生長因子，誘導成骨。

根據本發明的另一個方面，還提供了一種在基體上制備活性因子的方法，包括：使聚多巴胺生成在基體的表面；將帶有聚多巴胺的基體與活性因子接觸，使得活性因子通過聚多巴胺黏附在基體上。

其中使聚多巴胺生成在基體的表面的方法可以為：將基體浸入包括多巴胺的堿性溶液中，以使聚多巴胺生成在基體的表面。

具體地，將鈦片浸泡在含有多巴胺的三羥甲基氨基甲烷的堿性溶液(tris-hcl溶液)中，37℃過夜，然后用蒸餾水沖洗除去表面殘留的未牢固粘附的聚多巴胺顆粒，然后將含有聚多巴胺涂層的基底再浸泡入含有活性因子的溶液中，將活性因子接枝在基底表面，最后一步也需要再簡單沖洗一下，除去物理吸附的活性分子。

在本發明的一個優選實施例中，在基體上制備活性因子的方法的步驟包括：

取鈦片，于60℃溫度下在10mol/l氫氧化鈉溶液中浸泡2小時，水沖洗，然后依次用去離子水、異丙醇、丙酮進行超聲清洗，每次15分鐘，干燥；

將上述鈦片浸泡在3-多巴胺鹽酸鹽的tris液中，37℃過夜，其中3-多巴胺鹽酸鹽的tris液為將3-多巴胺鹽酸鹽溶解于10mm的tris液(ph8.5)，配成的濃度為4mg/ml的混合溶液；

用去離子水反復沖洗3次，除去表面殘留的未牢固粘附的聚多巴胺顆粒；

將含有聚多巴胺涂層的鈦片再浸泡入含有脂聯素分子的溶液中，37℃過夜，將脂聯素接枝在含有聚多巴胺涂層的鈦片表面；

用去離子水將鈦片反復沖洗3次，除去物理吸附的脂聯素分子；

在氬氣流下將鈦片吹干，即得表面具有脂聯素的鈦片。

根據本發明的另一個方面，還提供了一種在基體上制備活性因子的方法，包括：將多巴胺鹽酸鹽和活性因子溶解于堿性溶液，配置成混合溶液；將基體浸入混合溶液，并浸泡預定時間，使得活性因子通過聚多巴胺黏附在基體上。

優選地，將多巴胺鹽酸鹽和活性因子溶解于三羥甲基氨基甲烷的堿性溶液，配置成混合溶液。

優選地，混合溶液，即含有多巴胺的三羥甲基氨基甲烷的堿性溶液的濃度為3mg/ml至5mg/ml。更優選地，混合溶液的濃度為4mg/ml。

優選地，上述三羥甲基氨基甲烷的堿性溶液為濃度為10mm的tris液，即每1升溶液中含有10毫摩爾的溶質。更優選地，該tris液的ph值范圍為8至9。

優選地，將基體浸入混合溶液，并浸泡超過10小時，使得活性因子通過聚多巴胺黏附在基體上。

優選地，在將基體浸入混合溶液前，需要對基體進行清潔。

針對鈦和鈦合金制的基體，清潔步驟包括采用堿性溶液浸泡和清洗。更優選地，清洗步驟包括采用醇和/或酮進行清洗，清洗時間大于10分鐘。

優選地，活性因子包括脂聯素。

在一個優選實施例中，首先將3-多巴胺鹽酸鹽和脂聯素溶解于10mm的tris液(ph8.5)，配成4mg/ml的混合溶液；并取鈦片，于60℃溫度下在10mol/l氫氧化鈉溶液中浸泡2小時，水沖洗，然后依次用去離子水、異丙醇、丙酮進行超聲清洗，每次15分鐘，干燥；最后將上步制備好的鈦片放入配制好的混合溶液中，在避光條件下浸泡12小時，然后取出，用去離子水反復沖洗3次，然后在氬氣流下吹干，即得表面具有活性因子涂層的鈦片。

以上所述僅為本發明的優選實施例而已，并不用于限制本發明，對于本領域的技術人員來說，本發明可以有各種更改和變化。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。