一種鹽酸小檗堿靶向納米制劑及其制備方法和應用與流程

本發明涉及生物制藥技術領域，尤其涉及一種鹽酸小檗堿靶向納米制劑及其制備方法和應用。

背景技術：

鹽酸小檗堿(Berberine hydrochloride，BH)是一種天然生物堿，已知的藥理活性包括抗炎、抗膽堿能、抗菌、抗高血壓、抗氧化應激和抗包括鼻咽癌在內的多種類型腫瘤。

鹽酸小檗堿作為抗腫瘤制劑應用于臨床治療各種晚期癌癥的研究受到越來越多關注，但鹽酸小檗堿為季胺鹽類生物堿，穩定性差，藥物劑型及給藥方式大多以片劑、靜脈滴注為主，易被胃腸道中的黏蛋白吸附而影響吸收，生物利用度低，難以達到其發揮藥理作用的有效濃度；劑量增大又易引起過敏性休克、藥疹等不良反應，臨床應用受到很大限制。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種鹽酸小檗堿靶向納米制劑及其制備方法和應用。本發明的納米制劑提升了鹽酸小檗堿的穩定性和生物利用度，給藥劑量、毒副作用低，對腫瘤組織的靶向性高，緩控釋性好。

本發明提供了一種鹽酸小檗堿靶向納米制劑，包括偶聯葉酸的殼聚糖或其衍生物納米粒子，包覆在所述納米粒子表面的鹽酸小檗堿。

優選的是，所述偶聯葉酸的殼聚糖或其衍生物納米粒子與鹽酸小檗堿的質量比為1：(0.8～3)。

優選的是，所述納米粒子的粒徑為200～450nm。

優選的是，所述殼聚糖或其衍生物包括殼聚糖、殼聚糖季銨鹽和羧甲基殼聚糖中的一種。

本發明還提供了上述技術方案所述納米制劑的制備方法，包括以下步驟：

1)將鹽酸小檗堿溶解于無水乙醇中，得到鹽酸小檗堿無水乙醇溶液；

2)將葉酸活性酯與殼聚糖或其衍生物在溶液體系中進行偶聯反應，冷凍干燥后得到葉酸-殼聚糖凍干粉；

3)將所述步驟2)得到的葉酸-殼聚糖凍干粉溶于醋酸溶液，得到葉酸-殼聚糖溶液；

將所述葉酸-殼聚糖溶液與所述步驟1)中鹽酸小檗堿無水乙醇溶液混合，向得到的混合溶液中滴加三聚磷酸鈉溶液，進行交聯反應25～40min，得到鹽酸小檗堿靶向納米制劑；

所述步驟1)和步驟2)之間沒有時間順序限制。

優選的是，所述步驟1)中鹽酸小檗堿無水乙醇溶液的濃度為0.3～1g/L；

所述步驟3)中葉酸-殼聚糖溶液的濃度為0.2～1.2g/L。

優選的是，所述步驟3)中鹽酸小檗堿無水乙醇溶液與三聚磷酸鈉溶液的體積比為1：(0.5～5)。

優選的是，所述步驟3)中的三聚磷酸鈉溶液的濃度為0.3～0.8g/L。

本發明還提供了上述技術方案所述納米制劑或上述技術方案所述制備方法制備得到的納米制劑在制備靶向腫瘤藥物中的應用。

優選的是，所述藥物為靶向治療鼻咽癌的腫瘤藥物。

本發明提供了一種鹽酸小檗堿靶向納米制劑，包括偶聯葉酸的殼聚糖或其衍生物納米粒子，包覆在所述納米粒子表面的鹽酸小檗堿。通過將鹽酸小檗堿包覆在所述納米粒子上，得到的納米制劑臨床穩定性高，能夠實現對腫瘤組織的靶向性和緩控釋性，生物利用度高，且給藥劑量、毒副作用低。實施例結果也表明：本申請制備得到的鹽酸小檗堿靶向納米制劑形態圓整、大小均一；包封率和載藥量分別達到(89.82±2.91)％和(9.16±1.01)％(n＝3)；體內釋放效果高，24h內累積釋放分別為(90.92±5.21)％；鹽酸小檗堿靶向納米制劑對細胞的抑制作用強、細胞凋亡率高。

附圖說明

圖1是本發明鹽酸小檗堿靶向納米制劑的合成原理圖；

圖2是本發明實施例1提供的葉酸-殼聚糖偶聯產物、殼聚糖和葉酸的紅外光譜圖；

圖3是本發明實施例4提供的鹽酸小檗堿靶向納米制劑的透射電鏡圖；

圖4是本發明實施例4提供的鹽酸小檗堿靶向納米制劑的平均粒徑分布；

圖5是本發明實施例4提供的鹽酸小檗堿靶向納米制劑的Zeta電位圖；

圖6是本發明實施例6提供的鹽酸小檗堿靶向納米制劑的體外釋放結果圖；

圖7是本發明實施例7提供的MTT法測定24h和48h時鹽酸小檗堿靶向納米制劑對CNE-1的增殖抑制作用圖；

圖8是本發明實施例8提供的鹽酸小檗堿靶向納米制劑對CNE-1細胞遷移能力的影響結果圖；

圖9是本發明實施例9提供的鹽酸小檗堿靶向納米制劑誘導的CNE-1細胞凋亡圖。

具體實施方式

本發明提供了一種鹽酸小檗堿靶向納米制劑，包括偶聯葉酸的殼聚糖或其衍生物納米粒子，包覆在所述納米粒子表面的鹽酸小檗堿。

在本發明中，所述偶聯葉酸的殼聚糖或其衍生物納米粒子與鹽酸小檗堿的質量比優選為1：(0.8～3)，更優選為1：1。

在本發明中，所述納米粒子的粒徑優選為200～450nm，更優選為250～300nm，最優選為268nm。

在本發明中，所述殼聚糖或其衍生物包括殼聚糖、殼聚糖季銨鹽和羧甲基殼聚糖中的一種。本發明對所述殼聚糖、殼聚糖季銨鹽和羧甲基殼聚糖的來源沒有特殊的限定，采用本領域技術人員熟知的殼聚糖、殼聚糖季銨鹽和羧甲基殼聚糖的市售產品即可。

在本發明中，所述包覆層的厚度優選為100～300nm，更優選為150nm。所述包覆過程為鹽酸小檗堿在三聚磷酸鈉的交聯作用下與偶聯葉酸的殼聚糖或其衍生物納米粒子交聯，得到鹽酸小檗堿靶向納米制劑。

本發明還提供了上述技術方案所述納米制劑的制備方法，包括以下步驟：

1)將鹽酸小檗堿溶解于無水乙醇中，得到鹽酸小檗堿無水乙醇溶液；

2)將葉酸活性酯與殼聚糖或其衍生物在溶液體系中進行偶聯反應，冷凍干燥后得到葉酸-殼聚糖凍干粉；

3)將所述步驟2)得到的葉酸-殼聚糖凍干粉溶于醋酸溶液，得到葉酸-殼聚糖溶液；

將所述葉酸-殼聚糖溶液與所述步驟1)中鹽酸小檗堿無水乙醇溶液混合，向得到的混合溶液中滴加三聚磷酸鈉溶液，進行交聯反應25～40min，得到鹽酸小檗堿靶向納米制劑；

所述步驟1)和步驟2)之間沒有時間順序限制。

所述鹽酸小檗堿靶向納米制劑的合成原理圖如圖1所示，其中FA-CTS表示葉酸-殼聚糖偶聯產物，BH/FA-CTS-NPs表示鹽酸小檗堿靶向納米制劑，TPP為三聚磷酸鈉。

本發明將鹽酸小檗堿溶解于無水乙醇中，得到鹽酸小檗堿無水乙醇溶液。在本發明中，所述溶解方式包括超聲溶解或攪拌溶解，為了使鹽酸小檗堿完全分散溶解。本發明對所述超聲和攪拌的條件沒有特殊的限定，能夠使鹽酸小檗堿完全溶解即可。本發明對所述鹽酸小檗堿的來源沒有特殊的限定，采用本領域技術人員熟知的鹽酸小檗堿的市售產品即可，如購自北京華清美恒天然產物技術開發有限公司的鹽酸小檗堿。在本發明中，所述鹽酸小檗堿無水乙醇溶液的濃度優選為0.3～1g/L，更優選為0.5g/L。

本發明將葉酸活性酯與殼聚糖或其衍生物在溶液體系中進行偶聯反應，冷凍干燥后得到葉酸-殼聚糖凍干粉。在本發明中，所述葉酸活性酯與殼聚糖的用量比優選為(0.9～2.5)：1，更優選為1:1。本發明對所述葉酸活性酯的來源沒有特殊的限定，采用本領域技術人員熟知的葉酸活性酯的制備方法即可，具體優選為：如將三乙胺加入DMSO中混合，加入葉酸避光攪拌過夜，得到葉酸溶液；將DCC和NHS溶解在DMSO中，與上述葉酸溶液混合后避光攪拌過夜；隨后加入冰乙酸，繼續反應3～6h后，除去多余DCC，靜置冷藏0.5～1.5h，抽濾并收集濾液得到葉酸活性酯。

在本發明中，所述三乙胺與DMSO的體積比優選為1：(8～12)，更優選為1：10；所述葉酸與DMSO的質量體積比優選為1：(0.8～1.5)mg/mL，更優選為1：1mg/mL；所述DCC與DMSO的質量體積比優選為(2～3)：1mg/mL，更優選為2.5：1mg/mL；所述NHS與DMSO的質量體積比優選為(1～2)：1mg/mL，更優選為1.25：1mg/mL；所述混有DCC和NHS的DMSO溶液與葉酸溶液的體積比優選為(1～3)：1，更優選為1：1；所述冰乙酸的添加量為3～6％，更優選為5％。

本發明對葉酸活性酯和殼聚糖或其衍生物的偶聯反應沒有特殊的限定，采用本領域技術人員熟知的葉酸活性酯與殼聚糖上的氨基反應，制得葉酸偶聯殼聚糖即可，具體優選為：如將殼聚糖或其衍生物溶于醋酸，調節溶液pH值至5.5～6.8，更優選為6.0，得到殼聚糖溶液；將葉酸活性酯溶于DMSO，得到葉酸活性酯溶液；將殼聚糖溶液滴加到葉酸活性酯溶液中進行偶聯反應，得到葉酸-殼聚糖偶聯產物。

在本發明中，所述殼聚糖溶液的濃度優選為1.5～4mg/mL，更優選為2mg/mL，所述葉酸活性酯的濃度優選為3～6mg/mL，更優選為5mg/mL，所述偶聯反應優選在避光條件下進行，攪拌轉速優選為750～900r/min，更優選為800r/min，反應溫度優選為10～25℃，更優選為20℃。

所述偶聯反應后，本發明將得到葉酸-殼聚糖偶聯產物進行冷凍干燥，得到葉酸-殼聚糖凍干粉。本發明冷凍干燥前優選將葉酸-殼聚糖的pH調為8.5～9.2，更優選為9.0。本發明對所述冷凍干燥條件沒有特殊的限制，采用本領域技術人員熟知的冷凍干燥條件即可。

得到葉酸-殼聚糖凍干粉后，本發明將所述葉酸-殼聚糖凍干粉溶于醋酸溶液，得到葉酸-殼聚糖溶液。在本發明中，所述醋酸的作用為使葉酸-殼聚糖凍干粉充分溶解，所述醋酸溶液的濃度優選為0.5～12％，更優選為1％。在本發明中，所述所述葉酸-殼聚糖溶液的濃度優選為0.2～1.2g/L，更優選為1g/L。

得到葉酸-殼聚糖溶液和鹽酸小檗堿無水乙醇溶液后，本發明將兩溶液混合，向得到的混合溶液中滴加三聚磷酸鈉溶液，進行交聯反應25～40min，得到鹽酸小檗堿靶向納米制劑。在本發明中，所述交聯反應過程優選在攪拌的條件下進行，交聯反應時間更優選為30min。所述交聯反應的溫度優選為10～25℃，更優選為15℃。本發明所述三聚磷酸鈉主要起交聯作用。

在本發明中，所述三聚磷酸鈉溶液的濃度優選為0.3～0.8g/L，更優選為0.5g/L。

在本發明中，所述步驟3)中鹽酸小檗堿無水乙醇溶液與三聚磷酸鈉溶液的體積比優選為1：(0.5～2)，更優選為1：1。

本發明還提供了上述技術方案所述納米制劑和上述技術方案所述制備方法制備得到的納米制劑在制備靶向腫瘤藥物中的應用。

在本發明中，所述藥物優選為靶向治療鼻咽癌的腫瘤藥物。

下面結合實施例，對本發明提供的鹽酸小檗堿靶向納米制劑及其制備方法和應用進行詳細的描述，但是不能將它們理解為對本申請保護范圍的限定。

實施例1

葉酸活性酯的制備

取1mL三乙胺加入12mL DMSO中混合均勻，加入0.8mg葉酸避光攪拌過夜。次日，將30mg DCC和10mg NHS溶解在10mL DMSO中，兩溶液混合后暗處攪拌過夜。隨后加入6％冰乙酸，繼續反應5h以除去多余DCC，靜置冷藏1h，抽濾并收集濾液所得即為葉酸活性酯。

葉酸殼聚糖凍干粉的制備

稱取75mg殼聚糖溶于50mL 1％的醋酸溶液中，逐滴滴加4.0mol/L的NaOH將溶液的pH調到6.2。磁力攪拌下緩慢加入得到的葉酸活性酯的DMSO溶液，室溫下避光攪拌過夜，得到葉酸-殼聚糖偶聯產物。反應結束后用4mol/L的NaOH溶液調節pH至8.5，離心并用蒸餾水洗滌數遍，冷凍干燥，得到淡黃色固體粉末即為葉酸-殼聚糖凍干粉。

鹽酸小檗堿靶向納米制劑的制備

將葉酸-殼聚糖凍干粉溶于1.5％醋酸溶液中得0.8g/L葉酸-殼聚糖溶液。稱取1mg鹽酸小檗堿溶于1ml無水乙醇中，超聲至完全溶解，得鹽酸小檗堿無水乙醇溶液。將兩者混合，室溫持續攪拌下，緩慢加入三聚磷酸鈉溶液，攪拌25min，得到鹽酸小檗堿靶向納米制劑。

利用傅里葉變換紅外光譜儀，將冷凍干燥的葉酸-殼聚糖偶聯產物置于室溫下KBr壓片。同樣分別制備葉酸和殼聚糖樣品作對比。葉酸-殼聚糖偶聯產物、葉酸和殼聚糖的紅外光譜圖如圖2所示。葉酸-殼聚糖偶聯產物是以殼聚糖分子鏈上質子化的氨基與葉酸分子結構上脫質子化的羧基之間利用靜電作用結合在一起。圖中葉酸-殼聚糖偶聯產物曲線上1 605、1 462cm^-1出現類似芳環骨架伸縮導致的振動峰波，說明葉酸與殼聚糖偶聯成功。葉酸的1 706cm^-1羰基峰(-COOH)消失可以說明殼聚糖中的氨基與葉酸分子的羧基是靜電作用相互結合在一起。

實施例2

葉酸活性酯的制備

取1mL三乙胺加入8mL DMSO中混合均勻，加入8mg葉酸避光攪拌過夜。次日，將16mg DCC和12mg NHS溶解在8mL DMSO中，兩溶液混合后暗處攪拌過夜。隨后加入3％冰乙酸，繼續反應3h以除去多余DCC，靜置冷藏1.5h，抽濾并收集濾液所得即為葉酸活性酯。

葉酸殼聚糖凍干粉的制備

稱取150mg殼聚糖溶于50mL 5％的醋酸溶液中，逐滴滴加6.0mol/L的NaOH將溶液的pH調到5.8。磁力攪拌下緩慢加入得到的葉酸活性酯的DMSO溶液，室溫下避光攪拌過夜，得到葉酸-殼聚糖偶聯產物。反應結束后用6mol/L的NaOH溶液調節pH至9.2，離心并用蒸餾水洗滌數遍，冷凍干燥，得到淡黃色固體粉末即為葉酸-殼聚糖凍干粉。

鹽酸小檗堿靶向納米制劑的制備

將葉酸-殼聚糖凍干粉溶于5％醋酸溶液中得1.2g/L葉酸-殼聚糖溶液。稱取0.6mg鹽酸小檗堿溶于1ml無水乙醇中，超聲至完全溶解，得鹽酸小檗堿無水乙醇溶液。將兩者混合，室溫持續攪拌下，緩慢加入三聚磷酸鈉溶液，攪拌40min，得到鹽酸小檗堿靶向納米制劑。

實施例3

葉酸活性酯的制備

取1mL三乙胺加入10mL DMSO中混合均勻，加入10mg葉酸避光攪拌過夜。次日，將25mg DCC和12.5mg NHS溶解在10mL DMSO中，兩溶液混合后暗處攪拌過夜。隨后加入5％冰乙酸，繼續反應4h以除去多余DCC，靜置冷藏0.5h，抽濾并收集濾液所得即為葉酸活性酯。

葉酸殼聚糖凍干粉的制備

稱取100mg殼聚糖溶于50mL 10％的醋酸溶液中，逐滴滴加10.0mol/L的NaOH將溶液的pH調到6.0。磁力攪拌下緩慢加入得到的葉酸活性酯的DMSO溶液，室溫下避光攪拌過夜，得到葉酸-殼聚糖偶聯產物。反應結束后用10mol/L的NaOH溶液調節pH至9.0，離心并用蒸餾水洗滌數遍，冷凍干燥，得到淡黃色固體粉末即為葉酸-殼聚糖凍干粉。

鹽酸小檗堿靶向納米制劑的制備

將葉酸-殼聚糖凍干粉溶于1％醋酸溶液中得1g/L葉酸-殼聚糖溶液。稱取0.5mg鹽酸小檗堿溶于1ml無水乙醇中，超聲至完全溶解，得鹽酸小檗堿無水乙醇溶液。將兩者混合，室溫持續攪拌下，緩慢加入三聚磷酸鈉溶液，攪拌30min，得到鹽酸小檗堿靶向納米制劑。

殼聚糖代替葉酸-殼聚糖偶聯產物后，同樣的方法制備鹽酸小檗堿-殼聚糖納米制劑。

實施例4

鹽酸小檗堿靶向納米制劑的形態學特征及粒徑分布

將實施例3制備得到鹽酸小檗堿靶向納米制劑進行形態學和粒徑分布研究。室溫下透射電鏡(TEM)觀察其形態，使用激光粒度分析儀測定其平均粒徑、Zeta電位和粒徑分散指數(PDI)。所制得的鹽酸小檗堿靶向納米制劑形態圓整、大小均一，為球類粒子(鹽酸小檗堿靶向納米制劑的透射電鏡圖如圖3所示)，平均粒徑為(282.4±4.5)nm(n＝6)(鹽酸小檗堿靶向納米制劑的平均粒徑分布如圖4所示)，Zeta電位為(-17.3±1.2)mV(n＝6)(鹽酸小檗堿靶向納米制劑的Zeta電位圖如圖5所示)，PDI為0.043±0.016(n＝6)，粒度分布均勻呈單峰。

表1正交試驗設計及結果

表2方差分析

F_0.05(2,2)＝19.00 F_0.01(2,2)＝99.00

實施例5

實施例3制得的鹽酸小檗堿靶向納米制劑包封率、載藥量的測定

鹽酸小檗堿特征吸收波長的選擇

稱取鹽酸小檗堿對照品適量，蒸餾水溶解后紫外分光光度儀在200～800nm進行掃描，得最大吸收波長在421nm處。

標準曲線的繪制

用蒸餾水配制0.5g/L的鹽酸小檗堿標準溶液儲備液。分別精密移取上述儲備液0.2、0.6、0.8、1.0、1.4、1.8mL，移入50mL量瓶中定容，即得質量濃度為2.0、6.0、8.0、10.0、14.0、18.0mg/L的標準溶液供試液。在421nm波長處分別測定不同質量濃度鹽酸小檗堿供試液的吸光度(A)值，以A值對質量濃度進行線性回歸，回歸方程為A＝0.013 8C+0.015 2(R²＝0.9996，n＝3)，當鹽酸小檗堿質量濃度在2.21～19.31μg/mL時，線性關系良好。

鹽酸小檗堿載藥納米粒的包封率、載藥量的測定

將制備的鹽酸小檗堿靶向納米制劑水分散體系，在5000r/min超速離心20min。收集上清，定容至50mL量瓶中，通過紫外可見光光度計測定421nm下的吸光度(A)值，帶入標準曲線計算游離鹽酸小檗堿的量。鹽酸小檗堿包封率與載藥量分別按下式計算，結果包封率和載藥量分別為(89.82±2.91)％和(9.16±1.01)％(n＝3)。

包封率＝(鹽酸小檗堿總量－游離鹽酸小檗堿的量)/鹽酸小檗堿總量

載藥量＝(鹽酸小檗堿總量－游離鹽酸小檗堿的量)/納米粒子的量

實施例6

實施例3制得的鹽酸小檗堿靶向納米制劑中鹽酸小檗堿的體外釋放

取鹽酸小檗堿靶向納米制劑懸液于透析袋中，采用轉籃法測鹽酸小檗堿的體外釋放。轉速50r/min，溫度(37.0±0.5)℃。釋放介質：PBS緩沖液(pH 7.4)。間歇收集釋放液2mL，同時補充等量的釋放介質。將收集的釋放液稀釋，其中鹽酸小檗堿的定量測定方法見實施例5。A值均以未載藥微球同樣條件下的釋放介質為參比。鹽酸小檗堿靶向納米制劑的體外釋放(n＝3)結果見圖6，可以看出鹽酸小檗堿靶向納米制劑中鹽酸小檗堿有很好的緩控釋作用。鹽酸小檗堿在最初的幾小時內有一個快速釋放，0.5h內累積釋放分別為(32.91±3.91)％，5h內累積釋放為(80.32±3.24)％，吸附于納米粒表面的藥物釋放有利于藥物的快速起效；中期的5h至24h間接近勻速釋放，24h內累積釋放分別為(90.92±5.21)％，說明包裹在納米粒內部的鹽酸小檗堿通過納米粒中孔隙的擴散；24h后釋放非常緩慢，25h后釋放基本結束。

為了進一步探討鹽酸小檗堿納米粒體外釋放機制，采用Higuchi方程擬合其體外釋放曲線后發現，鹽酸小檗堿靶向納米制劑的體外釋放標準曲線為Y＝0.653 5X+47.169，R²＝0.3786，表明鹽酸小檗堿從固體骨架劑載藥體系中非勻速釋放，遵循單位面積的釋放量與時間的平方根成直線關系，具有較好的緩釋效果，符合水不溶性骨架的釋藥性能，適合應用于緩控釋藥物制劑

實施例7

MTT法測定實施例3制得的鹽酸小檗堿靶向納米制劑對CNE-1細胞的抑制率

細胞培養

人鼻咽癌CNE-1細胞株培養于含10％胎牛血清的DMEM培養基中，置于5％CO₂細胞培養箱中，恒溫37℃培養。每1～2d換液1次，使用0.25％胰蛋白酶消化傳代，取對數生長期的細胞進行實驗。

MTT法測定鹽酸小檗堿靶向納米制劑對CNE-1細胞的抑制率

取處于對數生長期的CNE-1，胰酶消化后進行細胞計數并將細胞的濃度調整為1×10⁵個/mL，用新鮮培養液制備成單細胞懸液，按照每孔100μL接種于96孔板中，放置于37℃、含5％CO₂的二氧化碳培養箱中培養24h觀察細胞貼壁情況，棄去原培養液，加入不同物質。

分組如下：

未處理組，只接種細胞；

空白對照孔，只加DMSO、MTT培養液，不接種細胞。

實驗組1，接種細胞并每孔加入含鹽酸小檗堿濃度為5、10、20、40μmol/L的鹽酸小檗堿混懸液50μL、培養液50μL，每組設3個復孔；

實驗組2，接種細胞并加入含鹽酸小檗堿濃度為5、10、20、40μmol/L的鹽酸小檗堿-殼聚糖納米制劑50μL、培養液50μL，每組設3個復孔；

實驗組3，接種細胞并加入含鹽酸小檗堿濃度為5、10、20、40μmol/L的實施例3制得的鹽酸小檗堿靶向納米制劑50μL、培養液50μL，每組設3個復孔。

同樣條件培養24、48h，取出培養板，每孔加入10μL新鮮配制含5mg/mL MTT，繼續培養4h，棄上清液終止培養，每孔加150μL DMSO溶解，水平搖床上振蕩混勻，空白對照空調零，酶標儀測定波長為490nm時吸光度(A)值，用下面公式計算藥物對各細胞的抑制率。MTT法測定24h和48h時鹽酸小檗堿靶向納米制劑對CNE-1的增殖抑制作用結果見圖7。

細胞增殖抑制率＝(對照組平均A值－給藥組平均A值)/對照組平均A值

由結果可知，各組鹽酸小檗堿制劑在不同時間作用于CNE-1細胞后，細胞的生長均受到不同程度明顯的抑制作用，隨著制劑濃度增大，作用時間延長，細胞的生長抑制作用也更為明顯，可以看出鹽酸小檗堿制劑對CNE-1細胞的生長抑制作用具有較明顯的量效和時效關系；不同鹽酸小檗堿制劑對細胞抑制作用也具有明顯差異，鹽酸小檗堿靶向納米制劑對細胞的抑制作用強于鹽酸小檗堿-殼聚糖納米制劑和鹽酸小檗堿原料藥組，說明FA可以與腫瘤細胞表面的FA受體特異性結合并增強鹽酸小檗堿對CNE-1細胞的靶向性。

實施例8

實施例3制得的鹽酸小檗堿靶向納米制劑對CNE-1細胞遷移能力影響調整細胞濃度為1×10⁷個/mL，吸1mL細胞懸液接種于6孔板，加入DMEM培養6h，待細胞呈單層貼壁生長狀態時，用10μL Eppendorf Tip在細胞板上劃痕，培養液洗細胞3次，依次加入含鹽酸小檗堿濃度為20μmol/L的鹽酸小檗堿溶液、鹽酸小檗堿-殼聚糖納米制劑、鹽酸小檗堿靶向納米制劑及0.05％DMSO(對照)組，另設未處理組，每組設3個復孔，放入37℃、5％CO₂培養箱中培養24h后，取樣并拍照，用Image-Pro Plus 6.0軟件測量劃痕的距離，計算平均值與標準差。以DMSO組為對照，進行組間比較。細胞的遷移能力以遷移率表示，鹽酸小檗堿靶向納米制劑對CNE-1細胞遷移能力的影響結果見圖8。

實驗結果顯示，未處理組、對照組以及20μmol/L的鹽酸小檗堿溶液、鹽酸小檗堿-殼聚糖納米制劑、鹽酸小檗堿/FA-CTS-NPs處理組在0h時，劃痕距離大體相同。24h后，未處理組與對照組劃痕距離明顯縮短，兩者相比，差異無統計學意義(P＞0.05)。而各20μmol/L的鹽酸小檗堿制劑處理組劃痕距離增寬，與未處理組和DMSO組相比遷移率明顯降低，差異均有統計學意義(P＜0.05)。各鹽酸小檗堿制劑組間相比較劃痕距離差異也具有統計學意義(P＜0.05)。

實施例9

實施例3制得的鹽酸小檗堿靶向納米制劑對CNE-1細胞凋亡的影響

分別收集含鹽酸小檗堿濃度為20μmol/L的鹽酸小檗堿、鹽酸小檗堿-殼聚糖納米制劑、鹽酸小檗堿靶向納米制劑作用24h的CNE-1細胞，用胰酶消化，1 000r/min離心5min，4℃預冷的PBS洗2次，1 000r/min離心5min，棄上清收集細胞。另設未處理和DMSO(對照)組。

加入250mL的Binding Buffer重懸細胞，取100μL的細胞懸液于5mL流式管中，加入5μL Annexin V/FITC混勻后室溫避光孵育5min。滴一滴上述細胞懸液于載玻片，蓋玻片蓋上細胞并將蓋玻片倒置后，于熒光顯微鏡下觀察，鹽酸小檗堿靶向納米制劑誘導的CNE-1細胞凋亡結果如圖9所示。結果顯示，各加藥組的細胞凋亡率比未處理組和對照組明顯增高(P＜0.05)。在第24小時，未處理組與對照組細胞凋亡數量較少，兩者相比，差異無統計學

意義(P＞0.05)，而各鹽酸小檗堿制劑處理組凋亡細胞數量與對照組和DMSO組相比明顯增加，差異均有統計學意義(P＜0.05)。各鹽酸小檗堿制劑組間相比較凋亡細胞數量差異也具有統計學意義(P＜0.05)。且細胞凋亡率的程度與MTT結果一致，證明了實驗的可靠性。

以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。