種植牙釘的制造方法以及由該方法制得的種植牙釘與流程

本發明屬于牙科植入物領域，具體涉及種植牙釘及其制造方法。
背景技術：
：生物醫用金屬材料中，鈦及鈦合金材料具有良好的耐腐蝕性、機械性能和生物相容性，廣泛用作制造例如種植牙等硬組織植入體。在鈦及鈦合金表面制備多級微納結構，有利于植入體與人體骨組織形成良好的“骨結合”，從而改善植入效果，提高植入成功率。研究表明，生物醫用金屬材料的表面性質，如粗糙度、表面親水性和表面化學組成等是影響其與骨組織結合的重要因素(CriticalReviewsinOralBioloGY16100090&Medicine1996,7:329-345)。通常，表面帶有微米結構和納米結構的復合結構更有利于細胞的增殖和分化(Biomaterials2011,32:3395-3403)。親水性較好的表面更有利于細胞早期的粘附和鋪展(JBiomedMaterResA2006；76A:323-334)。因此，利用多步表面處理獲得合適的表面粗糙度和良好的潤濕性能夠顯著改善植入材料與骨組織的結合，使其與骨組織形成良好的骨性結合。除了粗糙度和親水性，表面化學組成也是影響生物金屬材料與骨結合的一個重要因素。鋅作為生命體必需的微量元素之一，對維持多種蛋白功能和結構起到至關重要的作用，對細胞增殖、分化、基因表達和骨整合均具有十分重要的作用。研究表明，鋅能刺激細胞增殖，促進細胞堿性磷酸酶活性，促進膠原蛋白合成，提高成骨相關基因的表達(BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications2011,412:273-278.)；鋅在體內可以有效促進骨長入(Biomaterials2014,35:6882-6897)。從而促進生物植入材料與骨組織形成良好的“骨結合”。鈣是人體骨骼的主要元素組成，能促進骨骼生長和成熟。因此，鋅或者鈣離子注入生物植入材料例如種植牙釘的表面可以有效改善植入材料的成骨活性。銀作為一種具有廣譜抗菌性的良好無機抗菌材料，早在公元前就已被人們用來預防感染。而銀的抗菌機理至今未被完全闡明，有文獻報道銀能通過與細菌內含有巰基的蛋白質反應，阻礙細菌正常的生命活動從而殺死細菌；也有研究表明銀能阻礙電子在細菌膜上的轉移，破壞細菌結構(NatMater2008,7:236-241)。另一方面，有研究表明嵌入材料表面的銀納米顆粒不但不會對成骨細胞造成毒性，反而具有一定的促進成骨細胞增殖的作用(Biomaterials2011,32:693-705)。因此，銀離子注入種植牙釘表面可以顯著提高生物植入材料的抗菌性能。此外，錳是一種對骨生長和發育具有重要作用的微量元素[JournaloftraceelementsinmedicineandbioloGY16100090:organoftheSocietyforMineralsandTraceElements2012,26:149-52.]，是體內碳水化合物的新陳代謝及骨內粘多糖的合成過程中的重要輔因子[Biologicaltraceelementresearch2008,124:28-34.]，在某些關乎新陳代謝的信號通路及細胞內部的穩態平衡中起著重要作用[TrendsinbiotechnoloGY161000902013,31:594-605.]。有研究表明，氧化錳材料還是一種無機抗菌劑，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等多種細菌有較為顯著的抑菌殺菌效果[AppliedmicrobioloGY16100090andbiotechnoloGY161000902012,95:213-22；CeramicsInternational2013,39:2239-46.]。因此，本發明在一些方面擬尋求一種方法在種植牙釘的鈦表面進行錳元素微量摻雜，以期在種植牙釘中利用的錳元素的各種有益性能。技術實現要素：本發明為了解決現有的種植牙釘的表面親水性(潤濕性)、和成骨活性不佳的問題，利用噴砂處理、酸處理、堿處理、等離子體浸沒離子注入和/或熱處理多種表面改性方法，在種植牙釘的表面制備多級微納結構，另外可以進一步地將生物活性元素例如鋅或者鈣注入到種植牙釘的表面。本發明提出了一種全新的提高種植牙釘潤濕性和成骨活性的表面改性方法，從而制造出能夠滿足種植牙釘的臨床應用需求。本發明在第一方面提供了一種制造種植牙釘的方法，所述方法包括如下步驟：(1)噴砂處理：對種植牙釘進行噴砂處理，從而使所述種植牙釘的表面粗糙化；(2)酸處理：對經噴砂處理的種植牙釘進行酸處理，從而使表面形成微米級孔洞；和(3)堿處理：對經酸處理后的種植牙釘進行堿處理，從而使表面形成納米纖維形成的網絡結構；(4)等離子體注入處理：利用等離子體浸沒離子注入方法對步驟(3)中得到的種植牙釘注入生物活性元素；和(5)熱處理：將步驟(4)得到的種植牙釘在高溫下處理以使表層氧化層發生相變從而提高其耐腐蝕性，然后冷卻。本發明在第二方面提供了由本發明第一方面所述的方法制得的種植牙釘。由本發明方法制得的種植牙釘具有改善的表面粗糙度、表面親水性和耐腐蝕性，適合于植入并且適合于細胞在植入后的粘附、鋪展、增殖和生長，因而具有改善的骨結合性，所注入的生物活性元素還帶來該元素所具有的相應有益效果，例如前文所述的鋅、鈣、銀和/或錳等元素所具有的有益的技術效果。例如，如果對所述種植牙釘進一步進行熱處理，可以使得所制得的種植牙釘具有如實施例中所展示的各種有益效果，這些有益效果例如所述種植牙釘的腐蝕性能有所提高，和有利于細胞例如小鼠成骨細胞(MC3T3-E1細胞)早期粘附、鋪展、增殖和生長，以及對例如大鼠骨髓間充質干細胞(rBMSC細胞)的分化和成骨相關基因的表達具有顯著促進作用；實施例的細胞粘附和增殖結果還證實，所制得的種植牙釘可以提高MC3T3-E1細胞的早期粘附和增殖；堿性磷酸酶活性實驗和基因表達實驗結果表明，經過本發明改性處理得到的種植牙釘可以促進rBMSCs細胞骨向分化和成骨相關基因(ALP，BMP2和OPN)的表達。本發明可用于改善種植牙釘的潤濕性和成骨活性。附圖說明圖1為經實施例1改性處理得到的種植牙釘表面形貌，其中(a)為低倍圖像，(b)為高倍圖像；圖2為經實施例2改性處理得到的種植牙釘表面形貌，其中(a)為低倍圖像，(b)為高倍圖像；圖3為經實施例3改性處理得到的種植牙釘表面形貌，其中(a)為低倍圖像，(b)為高倍圖像；圖4為改性處理得到的種植牙釘表面水接觸角值，其中，(a)為經實施例1改性處理得到的種植牙釘表面水接觸角值，(b)為經實施例3改性處理得到的種植牙釘表面水接觸角值；圖5為改性處理得到的種植牙釘表面XPS全譜，其中，(a)為經實施例3改性處理得到的種植牙釘表面XPS全譜，(b)為經實施例3改性處理得到的種植牙釘表面鋅元素的XPS高分辨譜；圖6為經實施例3改性處理得到的種植牙釘表面XRD圖譜；圖7為經本發明改性處理得到的種植牙釘腐蝕電位分析圖；圖8a為經實施例1和2改性處理得到的種植牙釘表面成骨細胞形貌(圖片由掃描電子顯微鏡拍攝)；圖8b為經實施例1和2改性處理得到的種植牙釘表面成骨細胞增殖結果；圖9a為經實施例2和3改性處理得到的種植牙釘表面成骨細胞形貌(圖片由掃描電子顯微鏡拍攝)；圖9b為經實施例2和3改性處理得到的種植牙釘表面成骨細胞增殖結果；圖10a為經本發明改性處理得到的種植牙釘表面成骨細胞粘附圖片；圖10b為經本發明改性處理得到的種植牙釘表面成骨細胞粘附定量結果；圖11為經本發明改性處理得到的種植牙釘表面骨髓間充質干細胞堿性磷酸酶活性實驗結果；圖12為經本發明改性處理得到的種植牙釘表面ALP的基因表達；圖13為經本發明改性處理得到的種植牙釘表面BMP2的基因表達；圖14為經本發明改性處理得到的種植牙釘表面OPN的基因表達；圖15a為經實施例10改性處理得到的種植牙釘表面MG63細胞增殖結果；圖15b為經實施例10改性處理得到的種植牙釘表面MG63細胞堿性磷酸酶活性實驗結果；圖15c為經實施例10改性處理得到的種植牙釘表面MG63細胞培養7天的基因表達結果；圖15d為經實施例10改性處理得到的種植牙釘表面MG63細胞培養14天的基因表達結果；圖16例示性地示出了根據本發明方法的一個具體實施方式的步驟和相應得到的表面形貌圖，其中一步表面處理為噴砂處理和酸處理(下文有時統稱噴砂酸蝕處理)；二步表面處理為堿處理；三步表面處理為等離子體注入處理；四步表面處理為熱處理；右側與各步相連的掃描電子顯微鏡拍攝照片為經相應表面處理步驟得到的表面形貌圖。具體實施方式如上所述，本發明在第一方面提供了一種制造種植牙釘的方法，所述方法包括如下步驟：(1)噴砂處理：對種植牙釘進行噴砂處理，從而使所述種植牙釘的表面粗糙化；(2)酸處理：對經噴砂處理的種植牙釘進行酸處理，從而使表面形成微米級孔洞；(3)堿處理：對經酸處理后的種植牙釘進行堿處理，從而使表面形成納米纖維形成的網絡結構；(4)等離子體注入處理：利用等離子體浸沒離子注入方法對步驟(3)中得到的種植牙釘注入生物活性元素；和(5)熱處理：將步驟(4)得到的種植牙釘在高溫下處理以使表層氧化層發生相變從而提高其耐腐蝕性，然后冷卻。在一些優選的實施方式中，所述鈦基種植牙釘為鈦或鈦合金種植牙釘。本發明對噴砂處理步驟中所使用的砂粒沒有特別的限制，但是優選為氧化鋁砂粒和氧化硅砂粒的混合砂，更優選的是采用粒徑為100～300μm(例如100、200或300微米)的氧化鋁砂粒和氧化硅砂粒的混合砂進行噴砂處理。本發明對噴砂壓力沒有特別的限制，但是在使用粒徑為100～300μm的氧化鋁砂粒和氧化硅砂粒的混合砂進行噴砂處理的情況下，優選的是在0.4～0.8MPa(例如0.4、0.5、0.6、0.7或0.8MPa)的壓力下對種植牙釘進行20～60分鐘(例如20、30、40、50或60分鐘)的噴砂處理。本發明對所述酸處理中所使用的酸沒有特別的限制，例如可以使用鹽酸和/或硫酸。在一個優選的實施方式中，所述酸處理可以通過如下方式進行：把經噴砂處理的種植牙釘浸泡于10～30重量％(例如10、20或30重量％)鹽酸和40～60重量％(40、50或60重量％)的硫酸的混酸中，在50～80℃(例如50、60、70或80℃)水浴條件下反應0.5～3小時(例如0.5、1、2或3小時)。本發明對所述堿處理中使用的堿沒有特別的限制，但是優選使用的堿金屬或者堿土金屬的堿，例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、氫氧化鎂，最優選的是使用氫氧化鈉。在一些優選的實施方式中，所述堿處理可以通過如下方式進行：把經噴砂處理和酸處理的種植牙釘浸泡于1～5mol/L(例如1、2、3、4或5mol/L)NaOH溶液中，室溫下反應2～4小時(例如2、3或4小時)。在一些優選的實施方式中，所述噴砂處理步驟(1)還可以進一步包括依次進行的清洗步驟和干燥步驟，更優選的是，所述清洗步驟通過依次在乙醇、去離子水和超純水中進行超聲清洗來進行。在一些優選的實施方式中，所述酸處理步驟(2)還可以進一步包括依次進行的清洗步驟和干燥步驟，更優選的是，所述清洗步驟通過依次在乙醇、去離子水和超純水中進行超聲清洗來進行。在一些優選的實施方式中，所述堿處理步驟(3)還可以進一步包括依次進行的清洗步驟和干燥步驟，更優選的是，所述清洗步驟僅包括使用超純水進行清洗。在一些優選的實施方式中，所述堿處理步驟(3)還可以包括在堿處理之后用超純水沖洗干凈后放入0.1～0.2mol/L(例如0.1、0.15或0.2mol/L)稀鹽酸中，室溫放置2～4小時(例如2、3或4小時)，以除去材料表面殘余的堿，取出種植牙釘，用超純水沖洗干凈后晾干。在一些優選的實施方式中，在步驟(4)中，本發明對注入元素沒有特別限制，只要是對所述種植牙釘具有有益的效果即可。但是在一些更優選的實施方式中，所述生物活性元素選自由鋅、鈣、錳和銀組成的組，進一步優選所述生物活性元素為鋅元素和/或鈣元素。本發明對等離子體浸沒離子注入所采用的具體工藝參數沒有特別的限制，只要能夠完成預期的生物活性元素離子注入即可。但是在一些優選的實施方式中，在注入的生物活性元素為鋅元素的情況下，所述等離子體注入處理的工藝參數優選如下所示：真空室溫度20～50℃(例如20、30、40或50℃)，真空度3.0×10-3～5.0×10-3Pa(例如為3、4或5×10-3Pa)，注入電壓-10～-20kV(例如-10、-15或-20kV)，頻率5～10Hz(例如為5、6、7、8、9或10Hz)，脈寬200～550μs(例如為200、300、400、500、550μs)，注入時間0.5～3.0小時(例如為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5或3.0小時)。在另外一些優選的實施方式中，在注入的生物活性元素為鈣元素的情況下，所述等離子體注入處理的工藝參數優選如下所示：真空室溫度20～50℃(例如20、30、40或50℃)，真空度3.0×10-3～5.0×10-3Pa(例如為3、4或5×10-3Pa)，注入電壓-10～-20kV(例如-10、-15或-20kV)，頻率5～7Hz(例如為5、6或7Hz)，脈寬300～550μs(例如為300、400、500、550μs)，注入時間1.0～3.0小時(例如為1.0、1.5、2.0、2.5或3.0小時)。在一些優選的實施方式中，在步驟(5)中將種植牙釘在溫度為300～500℃處理0.5～1.5小時，然后冷卻。在步驟(5)中，本發明對熱處理的處理溫度和處理時間沒有特別的限制，只要處理溫度和處理時間能夠導致表層氧化層發生相變從而提高其耐腐蝕性即可。在一些優選的實施方式中，所述高溫可以為300～500℃(例如300、400或500℃)，并且處理時間為0.5～1.5小時(例如0.5、1.0或1.5小時)。更優選的是，所述熱處理是在馬弗爐中進行，并且所述冷卻為隨爐自然冷卻。優選的是，所述種植牙釘可以為鈦或者鈦合金材質。本發明在第二方面提供了由本發明第一方面所述的方法制得的種植牙釘。所述種植牙釘可以具有改善的表面粗糙度、表面親水性(或者潤濕性)、和成骨性(即更加容易發生骨結合、更利于細胞的粘附和/或生長等)。下面結合附圖和實施例對本發明做進一步詳細說明，附圖和實施例僅用于說明本發明，而非限制本發明的內容。實施例實施例中以種植牙釘為例進行說明，但是本發明的保護范圍不應限于種植牙釘。實施例1(1)按30顆一批將純鈦TA3種植牙釘(購自浙江廣慈醫療器械有限公司)放入自動噴砂機中進行氧化鋁和氧化硅混合砂粒(體積比1：1，粒徑均為200微米)噴砂處理，壓力為0.6MPa，噴砂時間為40分鐘，從而使表面形成不規則的粗糙面，依次置于乙醇、去離子水、超純水中超聲清洗，然后干燥；(2)對進行噴砂處理后的種植牙釘進行18wt％鹽酸和48wt％硫酸的混酸(體積比1：1)處理，處理在65℃進行2小時，從而使表面形成微米級孔洞，依次置于乙醇、去離子水、超純水中超聲清洗，然后干燥。(3)把經過噴砂酸蝕處理的種植牙釘浸泡于5mol/LNaOH溶液中，室溫下反應4h；反應結束后取出種植牙釘，用超純水沖洗干凈后放入0.1mol/L稀鹽酸中，室溫放置2h；最后取出種植牙釘，用超純水沖洗干凈后晾干。圖1為經本實施例改性處理得到的種植牙釘表面形貌。由圖1可見：經本實施例改性處理后，種植牙釘表面形成了微米級“鋸齒狀”結構，并且將倍數放大可知，該微米級結構上形成了納米線狀纖維結構。由此可見，采用本發明的方法能夠成功地在種植牙釘表面制備了微納復合結構。經過噴砂酸蝕處理的種植牙釘接觸角較高，為75°左右。而經本實施例改性處理得到的具有微納復合結構的種植牙釘，其接觸角小于5°，達到超親水水平。由此可以看出，采用本發明的方法能夠顯著地提高了種植牙釘的潤濕性。實施例2使用實施例1中經過步驟(3)制得的種植牙釘進行等離子體注入處理步驟(4)，即，利用等離子體浸沒離子注入技術注入鋅元素，具體參數如表1所示；表1鋅離子注入參數靶脈沖弧注入電壓(kV)-15注入脈寬(μs)550550頻率(Hz)55注入時間(h)1.5真空度(Pa)3.5×10-3圖2為經本實施例改性處理得到的種植牙釘表面形貌。由圖可見：經本實施例改性處理后，種植牙釘表面的微納復合結構依然存在，經過離子注入后表面的納米線狀結構被輕微破壞。實施例3使用實施例1中經過步驟(3)制得的種植牙釘進行等離子體注入處理步驟(4)和熱處理步驟(5)。在等離子體注入處理如下步驟(4)中，利用等離子體浸沒離子注入技術注入鋅元素，具體參數如表2所示；表2鋅離子注入參數在熱處理步驟(5)中，將離子注入后的種植牙釘于馬弗爐中進行熱處理，處理溫度為450℃，時間為1h，隨爐冷卻，使種植牙釘表面的氧化鈦層轉化為銳鈦礦相。圖3為經本實施例改性處理得到的種植牙釘表面形貌。由圖3可見：經本實施例改性處理后，種植牙釘表面的微納復合結構依然存在，經過離子注入和熱處理后表面的納米線狀結構被破壞，形成纖維網絡結構。經本實施例改性處理得到的種植牙釘，其水接觸角約為20°，依舊保持良好的潤濕性。圖5中的圖(a)為經本實施例改性處理得到的種植牙釘表面XPS全譜。從圖可知：表面除了Ti、O、C三種元素外，還檢測到了Zn元素，說明離子注入成功地將鋅元素引入制備有微納復合結構的種植牙釘表面。圖5中的圖(b)為經本實施例改性處理得到的種植牙釘表鋅元素的高分辨譜。由圖可見：鋅元素在表面以ZnO(結合能為1020.9eV)的形式存在。圖6為經本實施例改性處理得到的種植牙釘表面XRD圖譜。從圖可知：經過鋅離子注入和熱處理后，表面形成了銳鈦礦相的氧化鈦。實施例4對經上述實施例改性處理得到的種植牙釘進行耐腐蝕性能測試：工作電極為測試樣品、對電極為石墨棒、參比電極為甘汞電極，利用電化學工作站，對材料的耐腐性能進行測試，測試電壓為-0.8V～0V。圖7為經上述實施例改性處理得到的種植牙釘腐蝕電位分析圖。其中：SLA表示經過噴砂酸蝕處理得到的樣品，SLAA表示經過噴砂酸蝕處理后進行堿處理得到的樣品，Zn-SLAA表示噴砂酸蝕處理后堿處理并進行鋅離子注入和熱處理得到的樣品。由圖可見：相比于樣品SLA，經過堿處理的樣品腐蝕電位向負方向移動，而種植牙釘Zn-SLAA腐蝕電位正向偏移，說明耐腐蝕性能得到了提高。實施例5對經實施例1和2改性處理得到的種植牙釘進行小鼠成骨細胞(MC3T3-E1)增殖實驗：樣品經75％酒精滅菌2h后，將密度為5×104個/mL的細胞懸浮液1mL接種于樣品表面，培養特定時間(1,4,7天)后，用PBS清洗樣品2遍，加入0.5mL含有5％阿爾瑪藍的無酚紅培養基進一步培養4h，取100μL測試570nm和600nm波長處的吸光度值并通過試劑說明書計算細胞增殖率。圖8a為經實施例1和2改性處理得到的種植牙釘表面培養細胞1，4和7天后通過掃描電子顯微鏡觀察的細胞形貌圖。其中：SLA表示經過噴砂酸蝕處理得到的樣品，SLAA表示經過噴砂酸蝕處理后進行堿處理得到的樣品，Zn-SLAA-1表示噴砂酸蝕處理后堿處理并進行鋅離子注入但未進行熱處理得到的樣品。由圖可見：培養1天后所有樣品表面的細胞增殖率未見顯著差異；培養4天后也未見顯著差異，但是相比第1天時可見絲狀偽足，說明細胞生長較好；培養7天后經實施例1改性處理得到的種植牙釘表面細胞增殖率高于未改性樣品，大量細胞基本覆蓋樣品表面，而經實施例2改性處理得到的樣品表面細胞增殖率略低于SLA，說明經過本發明改性后的種植牙釘表面能夠促進細胞增殖，但是未經熱處理對生物活性提高不明顯。圖8b所示的細胞增殖率結果與形貌結果一致。實施例6為了研究熱處理對種植牙釘表面細胞相容性的影響，對經實施例2和3改性處理得到的種植牙釘進行小鼠成骨細胞(MC3T3-E1)增殖實驗：樣品經75％酒精滅菌2h后，將密度為5×104個/mL的細胞懸浮液1mL接種于樣品表面，培養特定時間(1,4,7天)后，用PBS清洗樣品2遍，加入0.5mL含有5％阿爾瑪藍的無酚紅培養基進一步培養4h，取100μL測試570nm和600nm波長處的吸光度值并通過試劑說明書計算細胞增殖率。圖9a為經實施例2和3改性處理得到的種植牙釘表面培養細胞1，4和7天后通過掃描電子顯微鏡觀察的細胞形貌圖。其中：Zn-SLAA-1表示噴砂酸蝕處理后堿處理并進行鋅離子注入但未進行熱處理得到的樣品，Zn-SLAA表示噴砂酸蝕處理后堿處理并進行離子注入和熱處理得到的樣品。由圖可見：培養1天后兩種樣品表面的細胞增殖率未見顯著差異；培養4天后經實施例3改性處理得到的種植牙釘表面細胞增殖率高于實施例2改性處理得到的種植牙釘，可見絲狀偽足；培養7天后經過熱處理的種植牙釘表面細胞增殖率依然顯著高于未經熱處理的種植牙釘，大量細胞基本覆蓋樣品表面，說明經過熱處理得到的帶有銳鈦礦相TiO2的種植牙釘表面比未經熱處理的種植牙釘表面更有利于細胞增殖，證實經過熱處理可以顯著提高種植牙釘的生物活性。圖9b所示的細胞增殖率結果與形貌結果一致。實施例7對經上述實施例改性處理得到的種植牙釘進行小鼠成骨細胞(MC3T3-E1)早期粘附實驗：樣品經75％酒精滅菌2h后，將密度為5×104個/mL的細胞懸浮液1mL接種于樣品表面，培養24h后，用PBS清洗樣品2遍，4％多聚甲醛(PFA)固定10min后用曲通進行通透，DAPI染核，于熒光顯微鏡下觀察。圖10a為經上述實施例改性處理得到的種植牙釘細胞粘附圖，圖中被染色的是細胞核。其中：SLA表示經過噴砂酸蝕處理得到的樣品，SLAA表示經過噴砂酸蝕處理后進行堿處理得到的樣品，Zn-SLAA表示噴砂酸蝕處理后堿處理并進行鋅離子注入和熱處理得到的樣品。由圖可見：樣品Zn-SLAA和SLAA上的細胞數量明顯多于樣品SLA，尤其是SLAA表面，說明經本發明優選的改性方法處理得到的種植牙釘有利于細胞的粘附。圖10b為對上述圖片中細胞數進行計數后的結果。由圖10a可知：樣品表面的細胞數量以SLA，Zn-SLAA，SLAA的順序依次增加。從圖4可知，經過本發明優選的改性方法獲得的種植牙釘的表面的潤濕性得到了顯著的提高，樣品表面非常親水，因而有利于細胞的粘附。實施例8對經上述實施例改性處理得到的種植牙釘進行干細胞堿性磷酸酶活性(ALP)實驗，即樣品經75％酒精滅菌2h后，將密度為1.0×104個/mL(7天)和0.5×104個/mL(14天)的細胞懸液1mL接種于樣品表面，培養特定時間后，用PBS清洗樣品2遍，將樣品浸泡在裂解液中于4℃保存40min，然后將細胞從樣品表面洗脫并在磷酸對硝基苯酯中于37℃保存30min，測試其在405nm波長處的吸光度來表征堿性磷酸酶含量。利用BCA蛋白法檢測總蛋白量，通過公式計算，最后用μM/μg總蛋白來表征堿性磷酸酶活性。圖11為經上述實施例改性處理得到的種植牙釘表面第7天和第14天堿性磷酸酶活性結果。由圖可見：培養7天后，經過本發明優選的改性處理方法得到的種植牙釘(SLAA和Zn-SLAA)表面堿性磷酸酶活性表達顯著高于未經處理的樣品(SLA)，尤其是樣品SLAA；培養14天后，堿性磷酸酶在經過本發明優選的改性處理方法得到的種植牙釘表面表達依然高于SLA，說明經本發明改性處理得到的種植牙釘可以顯著促進干細胞的堿性磷酸酶活性。實施例9對經上述實施例改性處理得到的種植牙釘進行實時定量PCR(即RT-PCR)實驗，將密度為1.0×104個/mL(7天)和0.5×104個/mL(14天)的細胞懸液1mL接種于經過滅菌的樣品表面，培養7天和14天后，用TRIzol試劑裂解細胞，并從中提取RNA，將提取的RNA進行反轉錄，最后利用Lightcycle480(Roche)設備進行PCR實驗。圖12為經上述實施例改性處理得到的種植牙釘表面堿性磷酸酶活性(ALP)的基因表達結果。由圖12可見：培養7天后，經本發明的優選改性處理方法處理后的SLAA樣品表面ALP表達顯著高于樣品SLA，樣品Zn-SLAA表面ALP表達也高于SLA，但低于SLAA；培養14天后，經本發明改性處理的樣品表面ALP表達略低于SLA。圖13為經上述實施例改性處理得到的種植牙釘表面骨形態發生蛋白2(BMP2)的基因表達結果。由圖13可見：培養7天后，經本發明優選的改性處理方法處理后的SLAA樣品表面BMP2表達是樣品SLA的4.5倍左右，樣品Zn-SLAA表面BMP2表達也高于SLA；培養14天后，SLA和SLAA樣品表面的BMP2表達較為接近，但是樣品Zn-SLAA表面的BMP2表達明顯提高。圖14為經上述實施例改性處理得到的種植牙釘表面骨橋蛋白(OPN)的基因表達結果。由圖14可見：培養7天后，經本發明優選的改性處理方法處理后的樣品OPN表達要高于SLA樣品，尤其是SLAA樣品；培養14天后SLAA表面的OPN表達是SLA的11倍，Zn-SLAA表面OPN表達約為SLA的3.5倍。說明經本發明改性處理的種植牙釘可以顯著提高成骨相關基因的表達。實施例10根據實施例1所述的方法對種植牙釘進行噴砂酸蝕處理和堿處理，然后對改性得到的種植牙釘利用等離子體浸沒離子注入技術注入鈣元素，具體參數如表3所示。表3鈣離子注入參數靶脈沖弧注入電壓(kV)-15注入脈寬(μs)500500頻率(Hz)55注入時間(h)2.0真空度(Pa)3.0×10-3對經上述改性處理得到的種植牙釘進行人成骨肉瘤MG-63細胞增殖實驗：樣品經75％酒精滅菌2h后，將密度為1×104個/mL的細胞懸浮液1mL接種于樣品表面，培養特定時間(1,3,7和14天)后，用PBS清洗樣品2遍，加入0.2mL含有10％CCK-8的無酚紅培養基進一步培養2h，取100μL測試450nm波長處的吸光度值來表征細胞相對增殖率。對經上述改性處理得到的種植牙釘進行人成骨肉瘤MG-63細胞堿性磷酸酶活性(ALP)實驗，即樣品經75％酒精滅菌2h后，將密度為1.0×105個/mL的細胞懸液1mL接種于樣品表面，培養特定時間(7,14和21天)后，用PBS清洗樣品2遍，將樣品浸泡在裂解液中于4℃保存40min，然后將細胞從樣品表面洗脫并在磷酸對硝基苯酯中于37℃保存30min，測試其在405nm波長處的吸光度來表征堿性磷酸酶含量。利用BCA蛋白法檢測總蛋白量，通過公式計算，最后用nmol/min/mg總蛋白來表征堿性磷酸酶活性。對經上述改性處理得到的種植牙釘進行實時定量PCR(即RT-PCR)實驗，將密度為1.0×105個/mL的細胞懸液1mL接種于經過滅菌的樣品表面，培養7天和14天后，用TRIzol試劑裂解細胞，并從中提取RNA，將提取的RNA進行反轉錄，最后利用Lightcycle480(Roche)設備進行PCR實驗。圖15a為經實施例10改性處理得到的種植牙釘表面MG63細胞增殖結果。其中：Ti表示純鈦，SLA表示經過噴砂酸蝕處理得到的樣品，Ca-SLA表示經過噴砂酸蝕處理后進行鈣離子注入得到的樣品。由圖15a可見：培養1天和3天后所有樣品表面的細胞增殖率未見顯著差異；培養7天后SLA表面比Ti表面細胞增殖率低，而Ca-SLA表面細胞增殖率顯著高于Ti和SLA表面；培養14天后細胞增殖率按照Ti<SLA<Ca-SLA的順序依次遞增。圖15b為經實施例10改性處理得到的種植牙釘表面MG63細胞堿性磷酸酶活性實驗結果。由圖15b可見：培養7天后，經過噴砂酸蝕處理的鈦表面ALP表達顯著高于Ti表面，經過鈣離子注入后的Ca-SLA表面則具有最高的ALP表達；培養14天后，ALP的表達情況和第7天類似，依然按照Ti<SLA<Ca-SLA的順序有依次遞增；培養21天后，所呈現的規律和第7天類似，說明經過鈣離子注入改性處理得到的種植牙釘可以顯著促進MG63細胞的堿性磷酸酶活性。圖15c為經實施例10改性處理得到的種植牙釘表面MG63細胞培養7天的基因表達結果。由圖15c可見：培養7天后，成骨細胞特異性轉錄因子Osterix(OSX)、I型膠原(COL1A1)、骨涎蛋白(BSP)、堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣蛋白(OC)和骨橋蛋白(OPN)和Runx2等7種基因的表達在Ca-SLA表面上調最顯著，SLA表面基因表達均高于Ti表面。圖15d為經實施例10改性處理得到的種植牙釘表面MG63細胞培養14天的基因表達結果。由圖可知：OSX、COL1A1、BSP、ALP、OC、OPN和Runx2等7種基因的表達依然按照Ti<SLA<Ca-SLA的順序遞增，說明SLA和Ca-SLA表面均有利于MG63細胞基因的表達。當前第1頁1 2 3