一種抗腸炎螺旋藻硒化藻膽蛋白多肽復(fù)合體及其制備與應(yīng)用的制作方法

本發(fā)明屬于食品生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種抗腸炎螺旋藻硒化藻膽蛋白多肽復(fù)合體及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

炎癥性腸病(Inflammation bowel disease，IBD)是一類腸道慢性復(fù)發(fā)性炎癥疾病，主要包括潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn’sDisease，CD)兩種類型，罹患此病嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，且與結(jié)腸癌發(fā)生高度相關(guān)。我國(guó)IBD發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，目前僅UC的發(fā)病率已超過(guò)6‰，達(dá)800萬(wàn)人，IBD患者總計(jì)超過(guò)1000萬(wàn)人，在歐美國(guó)家白人中發(fā)病率更高。IBD被WHO定為特殊的臨床疑難病癥，尚無(wú)根治手段。臨床治療主要依賴美沙拉嗪類、皮質(zhì)類固醇激素類、免疫抑制劑和氨基水楊酸等藥物，近年也開發(fā)了一些抗TNF-α單抗和α4整合素單抗藥物，但這些藥物療效普遍不理想，復(fù)發(fā)率高，副作用多。在疾病的慢性反復(fù)加重過(guò)程和預(yù)防復(fù)發(fā)方面的治療應(yīng)用受到限制。針對(duì)IBD炎癥，研發(fā)天然免疫和炎癥調(diào)節(jié)功能制品，進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)調(diào)理，輔助治療和改善IBD癥狀，具有巨大應(yīng)用前景。

IBD的確切病因至今不清楚，但炎癥反應(yīng)是其根本病理機(jī)制。腸黏膜上皮細(xì)胞的促炎細(xì)胞因子和趨化因子IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1等過(guò)表達(dá)，而炎癥抑制因子TGF-β、IL-10下調(diào)，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞粘膜浸潤(rùn)，破壞腸道粘膜免疫屏障，最終刺激誘發(fā)和維持IBD的慢性炎癥過(guò)程。盡管大量證據(jù)表明免疫調(diào)節(jié)異常在IBD的發(fā)病中起關(guān)鍵作用，但其中確切的分子信號(hào)機(jī)制還未闡明。利用葡聚糖硫酸鈉(dextran sulphate sodium，DSS)誘導(dǎo)動(dòng)物IBD模型很好地模擬了人類IBD疾病，被普遍應(yīng)用于IBD分子機(jī)制的研究和藥物療效的評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，免疫細(xì)胞激活并分泌炎癥因子主要受核因子NF-κB依賴的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控，在IBD炎癥腸道組織中NF-κB被持續(xù)激活，決定Th1和Th2細(xì)胞因子失衡，導(dǎo)致IL-1、IL-6和TNF-α持續(xù)高表達(dá)，造成炎癥的反復(fù)促進(jìn)和持續(xù)進(jìn)展。由此可見，NF-κB信號(hào)通路在IBD發(fā)生進(jìn)展中扮演著非常重要角色，我們針對(duì)這個(gè)信號(hào)通路開發(fā)免疫調(diào)節(jié)生物制劑具有切實(shí)的科學(xué)理論依據(jù)。

人體必需微量元素硒(selenium，Se)在體內(nèi)以硒代半胱氨酸(selenocysteine，Se-Cys)形式，通過(guò)構(gòu)成數(shù)十種重要硒蛋白(selenoprotein)或硒酶(selenoenzyme)的功能活性中心而發(fā)揮作用。已經(jīng)確認(rèn)的人體25種硒蛋白對(duì)機(jī)體調(diào)節(jié)氧化還原平衡、激素和代謝穩(wěn)態(tài)、先天和獲得性免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)均至關(guān)重要，從而參與腫瘤發(fā)生、心血管疾病和病毒感染等眾多疾病病理生理過(guò)程。已經(jīng)闡明的硒和硒蛋白抗炎癥作用機(jī)制提示，其對(duì)氧化還原信號(hào)和免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)與NF-κB信號(hào)通路和Th1/Th2細(xì)胞因子平衡有關(guān)。另外，腸炎和IBD持續(xù)進(jìn)展過(guò)程，造成低硒營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)，加重腸道炎癥和微生態(tài)紊亂，對(duì)IBD炎癥組織損傷修復(fù)極為不利。因此，合理利用硒的營(yíng)養(yǎng)，增強(qiáng)硒蛋白質(zhì)的功能，是拮抗和治療IBD炎癥的合理策略。

螺旋藻(Spirulina platensis，SP)被譽(yù)為“21世紀(jì)最佳食品”，富含優(yōu)質(zhì)蛋白，無(wú)任何毒副作用。我們長(zhǎng)期致力于微藻天然活性硒形態(tài)的研究，發(fā)現(xiàn)螺旋藻具有富集和轉(zhuǎn)化無(wú)機(jī)硒產(chǎn)生活性含硒蛋白的能力，是優(yōu)良的天然有機(jī)硒營(yíng)養(yǎng)源，并已成功研制富硒螺旋藻(Se enriched Spirulina platensis，Se-SP)及活性含硒藻藍(lán)蛋白多肽。藻膽蛋白復(fù)合體(phycobilin complex，PBC)是SP中最為豐富的蛋白質(zhì)家族，含有藻藍(lán)蛋白(phycocyanin，PC)、別藻藍(lán)蛋白(allophycocyanin，APC)、藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)、至少8個(gè)藻膽色素分子及連接多肽等生物活性成分，具有抗氧化、抗凝血和降血脂等作用。我們發(fā)現(xiàn)PBC是Se-SP中活性硒元素的富集組分，在此基礎(chǔ)上，本專利研制出螺旋藻硒化藻膽蛋白多肽復(fù)合體(SePBP)，開發(fā)利用藻膽蛋白和硒的雙重功效，實(shí)現(xiàn)這一新型純天然含硒生物功能制品輔助治療腸炎的新用途。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種抗腸炎螺旋藻硒化藻膽蛋白多肽復(fù)合體。本發(fā)明在富硒螺旋藻養(yǎng)殖技術(shù)基礎(chǔ)上，制備了螺旋藻硒化藻膽蛋白多肽復(fù)合體(SePBP)這一新型生物功能制品，開展SePBP功能食品、營(yíng)養(yǎng)保健品、復(fù)方藥物成分或候選藥物等轉(zhuǎn)化應(yīng)用，提升富硒螺旋藻產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新性和附加值。

本發(fā)明的另一目的在于提供抗腸炎SePBP的制備方法。

本發(fā)明的再一目的是提供抗腸炎SePBP的應(yīng)用。利用DSS誘導(dǎo)建立的小鼠炎癥性腸病動(dòng)物模型，觀察經(jīng)口補(bǔ)充SePBP后對(duì)模型小鼠體重和腸炎臨床癥狀的影響，并檢測(cè)SePBP對(duì)IBD小鼠血液生化、炎癥指標(biāo)和腸道組織炎癥病理變化的治療作用，為SePBP輔助治療腸炎和其它炎癥相關(guān)疾病提供科學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種抗腸炎螺旋藻硒化藻膽蛋白多肽復(fù)合體，該復(fù)合體中藻膽蛋白純度不低于85％，有機(jī)硒含量為500～700μg/g，不含無(wú)機(jī)硒。

所述的抗腸炎螺旋藻硒化藻膽蛋白多肽復(fù)合體的制備方法，包括如下步驟：取富硒螺旋藻(Se enriched Spirulina platensis，Se-SP)藻泥，利用低溫低滲破碎、壓榨過(guò)濾和絮凝分離，得到抗腸炎螺旋藻硒化藻膽蛋白多肽復(fù)合體(SePBP)。

具體包括如下步驟：

取富硒螺旋藻(Se enriched Spirulina platensis，Se-SP)藻泥，加水冰浴攪拌2～5分鐘，置速凍室1～2小時(shí)后，取出待融化冰水混合物時(shí)再攪拌至徹底融化，如此反復(fù)凍-融3～5次，壓榨擠出水溶性組份，微孔濾膜抽濾，加入食用劑絮凝膠分離，得到抗腸炎螺旋藻硒化藻膽蛋白多肽復(fù)合體(SePBP)。

所述的抗腸炎螺旋藻硒化藻膽蛋白多肽復(fù)合體可作為功能食品、營(yíng)養(yǎng)保健品、復(fù)方藥物成分或候選藥物等生物功能制品。該生物功能制品主要適用于輔助治療腸炎和炎癥性腸病，也可用于高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病和其它炎癥相關(guān)疾病的輔助預(yù)防治療。

SePBP拮抗腸炎作用和抗炎癥效果的檢測(cè)：利用DSS誘導(dǎo)建立的小鼠腸炎模型，觀察經(jīng)口補(bǔ)充SePBP后對(duì)模型小鼠體重和臨床癥狀的影響，并檢測(cè)SePBP對(duì)IBD小鼠血液生化、炎癥指標(biāo)和腸道組織炎癥病理變化的治療作用。并進(jìn)一步探究SePBP發(fā)揮抗炎癥作用的機(jī)制。

目前技術(shù)研發(fā)進(jìn)度：研制的螺旋藻硒化藻膽蛋白多肽復(fù)合體是一種安全無(wú)毒新型天然硒-活性蛋白復(fù)合體生物制品，有機(jī)硒含量符合國(guó)家食品安全標(biāo)準(zhǔn)，可直接轉(zhuǎn)化應(yīng)用為功能食品和營(yíng)養(yǎng)保健品；同時(shí)，已完成其成藥性實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)和急性毒性試驗(yàn)，正在進(jìn)行臨床前實(shí)驗(yàn)申報(bào)和復(fù)方藥物成分或候選藥物研發(fā)。

本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：

(1)率先從富硒螺旋藻中分離制備螺旋藻硒化藻膽蛋白多肽復(fù)合體(SePBP)。采用純物理方法制備SePBP，避免化學(xué)試劑潛在安全風(fēng)險(xiǎn)；實(shí)現(xiàn)富硒螺旋藻中硒化藻膽蛋白多肽復(fù)合體的提取率不低于90％；SePBP中藻膽蛋白純度不低于85％；SePBP是一種全新的天然硒-活性蛋白復(fù)合體，每克SePBP中有機(jī)硒含量為500～700微克，不含有其它無(wú)機(jī)硒形態(tài)。優(yōu)于已報(bào)道的其它富硒生物制品。

(2)首次發(fā)現(xiàn)螺旋藻硒化藻膽蛋白多肽復(fù)合體具有良好緩解腸炎癥狀和抗炎癥效果。在小鼠實(shí)驗(yàn)性腸炎模型中，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充SePBP(給硒量為50～100μg/kg體重)對(duì)腸炎癥狀具有明顯療效，并可顯著降低小鼠血漿中IL-6，TNF-α和MCP-1等炎癥因子的水平；證明SePBP主要通過(guò)抑制NF-κB介導(dǎo)的炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，發(fā)揮其抗炎癥作用。提示SePBP不僅適用于輔助治療腸炎和炎癥性腸病，而且也可用于高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病和其它炎癥相關(guān)疾病的輔助預(yù)防治療。

附圖說(shuō)明

圖1是螺旋藻硒化藻膽蛋白多肽復(fù)合體(SePBP)分離提取光譜鑒定(A)、等電聚焦(IEF)電泳純度鑒定(B)和硒含量檢測(cè)(C)。

圖2是慢性腸炎模型組的體重變化情況。

圖3是慢性腸炎模型組的DAI變化情況。

圖4是小鼠結(jié)腸組織切片圖；其中，A為空白組；B為DSS處理組；C為DSS+SePBP(低硒量：15μg/kg)處理組；D為DSS+SePBP(中硒量：50μg/kg)處理組；E為DSS+SePBP(高硒量：100μg/kg)處理組。

圖5是慢性腸炎模型組血清中的IL-6，MCP-1和TNF-α變化情況；其中，(A)為慢性腸炎模型組血清中的IL-6變化情況；(B)為慢性腸炎模型組血清中的MCP-1變化情況；(C)為慢性腸炎模型組血清中的TNF-α變化情況。

其中，Control表示空白組；DSS表示DSS處理組；DSS+SePBP(L)表示DSS+SePBP(低硒量：15μg/kg)處理組；DSS+SePBP(M)表示DSS+SePBP(中硒量：50μg/kg)處理組；DSS+SePBP(H)表示DSS+SePBP(高硒量：100μg/kg)處理組。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

實(shí)施例1

(1)螺旋藻硒化藻膽蛋白多肽復(fù)合體(SePBP)分離制備：取富硒螺旋藻(Se enriched Spirulina platensis，Se-SP)(所述的富硒螺旋藻是指在鈍頂螺旋藻在硒添加濃度為300μg/mL條件下培養(yǎng)得到的；該富硒螺旋藻在文獻(xiàn)“鈍頂螺旋藻富集轉(zhuǎn)化硒及硒在藻體中的分布.植物生理學(xué)通訊,2001,37:12-14”中公開)藻泥1kg，加2L超純水或飲用純凈水，冰浴攪拌2～5分鐘，置速凍室1～2小時(shí)后，取出冰水混合物攪拌至徹底融化，如此反復(fù)凍融3～5次，壓榨擠出水溶性組份，微孔濾膜抽濾，加入食用級(jí)絮凝劑(愛森牌陽(yáng)離子型飲用水絮凝劑，購(gòu)自上海東?；び邢薰?，分離出SePBP。如圖1所示，本發(fā)明的方法可實(shí)現(xiàn)富硒螺旋藻中硒化藻膽蛋白多肽復(fù)合體的提取率不低于90％，高質(zhì)量SePBP中藻膽蛋白純度不低于85％，每克SePBP中有機(jī)硒含量為500～700微克，不含無(wú)機(jī)硒。

(2)新型硒-活性蛋白復(fù)合體SePBP拮抗腸炎作用和抗炎癥效果：小鼠分組實(shí)驗(yàn)，在暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院國(guó)家許可動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。取雄性C57BL/6小鼠40只，隨機(jī)分為5組，每組8只，分別為(1)空白對(duì)照組、(2)腸炎模型組、(3)～(5)實(shí)驗(yàn)劑量組。分籠正常飼喂1周后，(2)～(5)組小鼠按標(biāo)準(zhǔn)方法用含2％DSS飲用水誘導(dǎo)小鼠腸炎模型持續(xù)35天，同時(shí)(3)～(5)組小鼠經(jīng)口補(bǔ)充不同劑量的SePBP(按給硒量分別為15、50和100μg/kg體重)。每天對(duì)各組小鼠體重、腹瀉、便血和其它癥狀進(jìn)行詳細(xì)記錄，檢測(cè)糞便潛血實(shí)驗(yàn)(結(jié)果見圖2和3)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束處死小鼠，取各組小鼠血液、結(jié)腸組織和其它組織，進(jìn)行炎癥指標(biāo)和腸道組織炎癥病理變化的分析檢測(cè)(結(jié)果見圖4和5)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充SePBP(給硒量為50～100μg/kg體重)對(duì)DSS誘導(dǎo)的小鼠慢性IBD具有明顯療效，可顯著降低小鼠血漿中IL-6，TNF-αand MCP-1等炎癥因子的水平。進(jìn)一步研究顯示SePBP主要通過(guò)抑制NF-κB介導(dǎo)的炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，發(fā)揮其抗炎癥作用。

(3)新型硒-活性蛋白復(fù)合體SePBP轉(zhuǎn)化應(yīng)用預(yù)測(cè)：將該發(fā)明專利轉(zhuǎn)化成輔助治療IBD的功能食品或保健品制劑，產(chǎn)生較大規(guī)模的社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益。按我國(guó)現(xiàn)有1000萬(wàn)慢性腸炎患者，初期據(jù)保守1％市場(chǎng)占有率推測(cè)，若每人每天使用該制劑20元，使用療程3個(gè)月，該產(chǎn)品可創(chuàng)造1.8億產(chǎn)值，按20％計(jì)利稅，年利稅可達(dá)3600萬(wàn)元。還將帶動(dòng)富硒螺旋藻養(yǎng)殖、精細(xì)加工、蛋白質(zhì)工程及附屬產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)鏈的發(fā)展。產(chǎn)品使用方便，安全無(wú)毒，可減輕患病痛苦，提高生活質(zhì)量，經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)較少。產(chǎn)品具有良好成藥性。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。