一種氨基酸修飾的金屬富勒烯水溶性納米顆粒及其制備方法與應用與流程

本發明涉及一種氨基酸修飾的金屬富勒烯水溶性納米顆粒及其制備方法與應用，屬于納米材料領域。

背景技術：

自1985年Kroto等人發現C₆₀以來，富勒烯極大地推動了納米科技的發展。隨著富勒烯工業生產的迅速發展以及基于富勒烯材料的納米技術大量涌現，人們對于富勒烯及其衍生物效應給予了極大的關注。富勒烯和內嵌金屬富勒烯由于其獨特的結構和化學物理性質，在生物醫學領域有非常廣泛的應用。現有的研究結果表明，富勒烯/金屬富勒烯具有抗病毒作用、抗氧化活性和細胞保護作用、抗菌活性、藥物/基因輸運載體、磁共振成像和抑制腫瘤生長等多方面的特性。但是由于富勒烯自身在水中難以溶解，這在很大程度上制約了其在生物領域的應用。目前主要通過親水性高分子材料，如PEG、PVP等包覆或在碳籠表面修飾親水性基團，如羥基、氨基等增加其在水中的溶解度。

目前，在金屬富勒烯碳籠表面修飾氨基酸可以在碳籠上引入羧基等官能團，作為后續生物應用的中間體，而且據報道其本身也是一種良好磁共振成像造影劑。目前在碳籠表面修飾氨基酸的方法主要是用富勒烯的甲苯溶液與氨基酸的堿性水溶液進行反應，反應過程中用到有機溶劑不符合簡單經濟、綠色環保的主旨。因此，開發一種綠色環保、簡單易行的制備氨基酸修飾的富勒烯水溶性納米顆粒具有重要的意義。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種氨基酸修飾的金屬富勒烯水溶性納米顆粒及其制備方法與應用，本發明納米顆粒能溶于水，其制備方法簡單、綠色環保。

本發明提供的氨基酸修飾的金屬富勒烯水溶性納米顆粒，它的結構通式為metallofullerene-(OH)_x(Amino Acid)_y；

其中，metallofullerene為金屬富勒烯；

0≤x<50；0≤y<20；

Amino Acid為水溶性氨基酸。

上述結構通式表示羥基和水溶性氨基酸均連接于金屬富勒烯上。

上述的納米顆粒中，所述金屬富勒烯包括；M@C_2n、M₂@C_2n、MA@C_2n、M₃N@C_2n、M₂C₂@C_2n、M₂S@C_2n、M₂O@C_2n和M_mA_3-mN@C_2n中的至少一種；其中，M、A均為金屬元素，所述M、A均選自Sc、Y和鑭系金屬元素中的至少一種，30≤n≤60，0≤m≤3，且n、m均為整數；

所述水溶性氨基酸為丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、精氨酸、賴氨酸和天門氨酸中的至少一種。

本發明中，鑭系金屬元素為鑭(La)、鈰(Ce)、鐠(Pr)、釹(Nd)、钷(Pm)、釤(Sm)、銪(Eu)、釓(Gd)、鋱(Tb)、鏑(Dy)、鈥(Ho)、鉺(Er)、銩(Tm)、鐿(Yb)、镥(Lu)；

所述稀土金屬具體可為Gd，所述金屬富勒烯具體可為Gd@C₈₂、Gd₃N@C₈₀。

上述的納米顆粒中，所述納米顆粒的水合粒徑可為1～1000nm，具體可為10～300nm。

本發明還提供了上述的納米顆粒的制備方法，包括如下步驟：將所述水溶性氨基酸的堿溶液與所述金屬富勒烯混合，進行親核加成反應，即得到所述氨基酸修飾的金屬富勒烯水溶性納米顆粒。

本發明中，所述金屬富勒烯是用高效液相色譜結合富勒烯/內嵌金屬富勒烯專用色譜柱Buckyprep/Buckyprep-M純化得到的。

本發明制備方法同樣適用于空心富勒烯，即將所述金屬富勒烯用空心富勒烯替換進行反應；所述空心富勒烯包括C₆₀或C₇₀。

上述的制備方法中，所述水溶性氨基酸的堿溶液中堿的質量分數可為10～50％，具體可為14％或10～30％；所述水溶氨基酸與所述堿的摩爾比可為1：1～10，具體可為1：2或1：1～8；所述水溶性氨基酸的堿溶液使用的堿溶液具體可為氫氧化鈉溶液和/或氫氧化鉀溶液；

所述水溶性氨基酸與所述金屬富勒烯的摩爾比可為1～1000：1，具體可為1000：1或50～1000：1。

上述的制備方法中，所述親核加成反應的溫度可為50～100℃，具體可為50℃；所述親核加成反應的時間可為1～48h，具體可為1.5h、2h、4h、24h、1.5～24h或1～30h。

上述的制備方法中，在所述親核加成反應之后還包括過濾除去雜質的步驟。

本發明中，所述過濾除去雜質具體包括：先過濾除去未反應的所述金屬富勒烯固體顆粒，然后用透析袋透析除去未反應的所述水溶性氨基酸，再用微孔濾膜過濾；具體使用Mw＝3500透析袋透析除去小分子雜質(具體為水溶性氨基酸和堿)、220nm微孔濾膜過濾。

本發明制備的水溶性富勒烯納米顆粒，表面修飾的羧基殘基便于進一步與生物配體偶聯，為后續生物應用提供了更多的可能。

本發明具有以下優點：

1、本發明通過固液法制備的metallofullerene-(OH)_x(Amino Acid)_y；0≤x<50；0≤y<20具有水溶性。

2、本發明不需有機溶劑的介入，無需分離中間產物，無需無水無氧等條件，具有制備方法簡單經濟、綠色環保等優點。

3、本發明巧妙利用氨基酸中氨基的親核性，經過一步反應大量制得氨基酸修飾的金屬富勒烯水溶性納米顆粒。本發明制備方法同樣適用于C₆₀、C₇₀等空心富勒烯，Y₃N@C₈₀、Lu₃N@C₈₀等內嵌富勒烯；以及賴氨酸、甘氨酸、精氨酸、絲氨酸、天門冬氨酸等水溶性氨基酸，因而，具有一定普適性和便于實現規模化生產等優點。

4、本發明制備的metallofullerene-(OH)_x(Amino Acid)_y金屬富勒烯納米顆粒具有粒徑分布小、窄等特點。

附圖說明

圖1為本發明實施例1Gd@C₈₂(OH)₁₃(NHCH₂CH₂COOH)₆熱重分析熱重及微商熱重曲線。

圖2為本發明實施例1Gd@C₈₂(OH)₁₃(NHCH₂CH₂COOH)₆的紅外光譜圖。

圖3為本發明實施例1Gd@C₈₂(OH)₁₃(NHCH₂CH₂COOH)₆的紫外-可見吸收譜圖。

圖4為本發明實施例1所制備的金屬富勒烯Gd@C₈₂納米顆粒Gd@C₈₂(OH)₁₃(NHCH₂CH₂COOH)₆在pH＝7時平均水合半徑。

圖5為本發明實施例1所制備的金屬富勒烯Gd@C₈₂納米顆粒Gd@C₈₂(OH)₁₃(NHCH₂CH₂COOH)₆在pH＝7時Zeta電位。

圖6為本發明實施例1所制備的金屬富勒烯Gd@C82納米顆粒在0.5T磁場下用反轉-恢復序列測得的縱向弛豫時間的倒數1/T1對不同Gd濃度作圖。

圖7為本發明實施例2和3所制備的金屬富勒烯Gd@C₈₂不同氨基酸納米顆粒在pH＝7時平均水合半徑。

圖8為本發明實施例4所制備的空心富勒烯C₇₀納米顆粒C₇₀(OH)₁₃(NHCH₂CH₂COOH)₆的熱重及微商熱重曲線。

圖9為本發明實施例4所制備的空心富勒烯C₇₀納米顆粒C₇₀(OH)₁₃(NHCH₂CH₂COOH)₆在pH＝7時平均水合半徑。

圖10為本發明實施例5所制備的空心富勒烯C₆₀的β-丙氨酸納米顆粒在pH＝7時平均水合半徑。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。

下述實施例中，金屬富勒烯(M@C_2n)是用高效液相色譜結合富勒烯/內嵌金屬富勒烯專用色譜柱Buckyprep/Buckyprep-M純化得到的。

實施例1、

把約10mg Gd@C₈₂固體加入10ml單口瓶中，加入6mlNaOH質量分數為14％的β-丙氨酸堿溶液(氨基酸與氫氧化鈉的摩爾比具體為1：2；β-丙氨酸與Gd@C₈₂的摩爾比為1000：1)，50℃下劇烈攪拌1.5h，黑色固體逐漸溶解生成棕黑色溶液。過濾除去未反應的少量固體粉末，濾液使用Mw＝3500透析袋透析除去小分子雜質，使用220nm微孔濾膜過濾后得到的棕黑色溶液即為本發明的氨基酸修飾的金屬富勒烯水溶性納米顆粒Gd@C₈₂(OH)₁₃(NHCH₂CH₂COOH)₆。

表1β-丙氨酸修飾的金屬富勒烯水溶性納米顆粒元素分析結果

對本發明β-丙氨酸修飾的金屬富勒烯水溶性納米顆粒進行元素分析所得碳、氮、氫元素比，如表1所示。由表1可知，根據熱重曲線分析可以得出原固體粉末中含10.9％的水，經過計算約為13個H₂O分子(如圖1)，再結合元素分析，進一步推測得到該物質的平均分子式為Gd@C₈₂(OH)₁₃(NHCH₂CH₂COOH)₆。

圖2為紅外光譜在3300cm^-1左右的強的吸收峰歸屬為O-H的伸縮振動，在1740和1630cm^-1處中等的吸收峰歸屬為C＝O的伸縮振動、N-H的彎曲振動，在1568，1400和1300cm^-1處的強峰分別為C＝C的伸縮振動、)O-H的彎曲振動以及C-O、C-N的伸縮振動峰。由圖2可知，本發明β-丙氨酸修飾的金屬富勒烯水溶性納米顆粒中含有上述的親水基團，即本發明是水溶性。

由圖3可知，本發明Gd@C₈₂(OH)₁₃(NHCH₂CH₂COOH)₆在400nm波長以內有強吸收。

由圖4可知，本發明Gd@C₈₂(OH)₁₃(NHCH₂CH₂COOH)₆在pH＝7的水中平均粒徑為127.7±0.5nm。

由圖5可知，本發明Gd@C₈₂(OH)₁₃(NHCH₂CH₂COOH)₆在pH＝7的水中Zeta電位為-44.7mV。

由圖6可知，本發明Gd@C₈₂(OH)₁₃(NHCH₂CH₂COOH)₆在0.5T磁場下縱向弛豫率r₁為65.53mM^-1s^-1，是臨床使用Gd－DTPA的10倍以上。

實施例2、

用經過提純的10mg Gd@C₈₂固體與6mL NaOH質量分數為14％的L-賴氨酸堿溶液(L-賴氨酸與NaOH的摩爾比為1:2)混合，50℃下劇烈攪拌2h，黑色固體逐漸溶解生成棕黑色溶液，其余條件同本發明實施例1。

實施例3、

用經過提純的10mg Gd@C₈₂固體與6mL NaOH質量分數為14％的L-絲氨酸堿溶液(L-絲氨酸與NaOH的摩爾比為1:2)混合，50℃下劇烈攪拌4h，黑色固體逐漸溶解生成棕紅色溶液，其余條件同本發明實施例1。

如圖7所示，為Gd@C₈₂不同氨基酸納米顆粒在pH＝7的水中的粒徑分布曲線。由圖7和表2可知，賴氨酸反應產物的平均粒徑最小，分布最寬；絲氨酸反應產物的平均粒徑最大，分布最窄。

表2 Gd@C₈₂不同氨基酸納米顆粒在pH＝7的水中的平均粒徑及Z電勢

實施例4、

用經過提純的10mg C₇₀固體與6ml NaOH質量分數為14％的β-丙氨酸堿溶液(β-丙氨酸與NaOH的摩爾比為1:2)混合，50℃下劇烈攪拌24h，黑色固體逐漸溶解生成棕紅色溶液，其余條件同本發明實施例1。

表3 C₇₀(OH)₁₃(NHCH₂CH₂COOH)₆元素分析結果

由圖8和表3可知，由熱重曲線分析推測出原固體粉末中含11.0％的水，經過計算約為14個H₂O分子(如圖8)，經推算，該納米顆粒的平均分子式為C₇₀(OH)₁₃(NHCH₂CH₂COOH)₆。

由圖9說明C₇₀(OH)₁₃(NHCH₂CH₂COOH)₆在pH＝7的水中平均粒徑為139.8±0.8nm。

實施例5、

用經過提純的10mg C₆₀固體與6mlNaOH質量分數為14％的β-丙氨酸堿溶液(β-丙氨酸與NaOH的摩爾比為1:2)混合，50℃下劇烈攪拌24h，黑色固體逐漸溶解生成棕紅色溶液，其余條件同本發明實施例1。

由圖10說明空心富勒烯C₆₀的β-丙氨酸納米顆粒在pH＝7時平均水合半徑為139.8±1.0nm。