表面具有微納米結(jié)構(gòu)的生物陶瓷支架及其制備方法和應(yīng)用與流程

本發(fā)明涉及多巴胺誘導(dǎo)的Ca₇Si₂P₂O₁₆生物陶瓷支架及其在骨修復(fù)與光熱治療骨腫瘤中的用途，屬生物材料領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

目前臨床上骨癌的治療方法是手術(shù)和放化療相結(jié)合。但是手術(shù)會(huì)造成大塊的骨缺損，同時(shí)有腫瘤細(xì)胞殘余[1]。放療和化療存在抗藥性以及毒副作用大等問(wèn)題。因此，制備一種兼具治療骨腫瘤和修復(fù)骨缺損的生物材料具有很重要的現(xiàn)實(shí)意義。光熱療法因其毒副作用小，具有靶向治療的特點(diǎn)受到越來(lái)越多的關(guān)注[2-3]。但是大多數(shù)光熱劑面臨不可降解或者潛在毒性等長(zhǎng)期安全性問(wèn)題[4-6]。

參考文獻(xiàn)

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技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的提供一種兼具治療骨腫瘤和修復(fù)骨缺損的生物材料。

一方面，本發(fā)明提供了一種表面具有微納米結(jié)構(gòu)的生物陶瓷支架，包括Ca₇Si₂P₂O₁₆生物陶瓷支架和形成于所述Ca₇Si₂P₂O₁₆生物陶瓷表面的具有微納米結(jié)構(gòu)的聚多巴胺/Ca-P納米層。所述聚多巴胺/Ca-P納米層尺寸在微納米級(jí)別，表面具有片狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的納米層，尺寸在50-150nm。所述聚多巴胺/Ca-P納米層中含有Ca元素,P元素,C元素，Si元素，O元素。

本發(fā)明在Ca₇Si₂P₂O₁₆生物陶瓷支架表明形成具有微納米結(jié)構(gòu)的聚多巴胺/Ca-P納米層，其中聚多巴胺具有優(yōu)良的光熱性能(多巴胺已聚合成為聚多巴胺，其光熱性能不受影響)。本發(fā)明利用多巴胺的光熱性能，實(shí)現(xiàn)光熱抗腫瘤的作用。而在所述Ca₇Si₂P₂O₁₆生物陶瓷支架表面形成的聚多巴胺/Ca-P納米層具有微納米結(jié)構(gòu)，能夠促進(jìn)骨間充質(zhì)干細(xì)胞在支架表面的粘附、增殖及分化，進(jìn)而促進(jìn)體內(nèi)成骨。從而使得本發(fā)明制備的表面具有微納米結(jié)構(gòu)的生物陶瓷支架(或稱多巴胺誘導(dǎo)的生物陶瓷支架)兼具骨修復(fù)及治療骨腫瘤的雙功能。

較佳地，所述聚多巴胺/Ca-P納米層的厚度為500～800nm。在所述聚多巴胺/Ca-P納米層和基底材料之間還包括過(guò)渡層，厚度為3～5μm。

較佳地，所述聚多巴胺/Ca-P納米層是由多巴胺在Ca₇Si₂P₂O₁₆生物陶瓷表面自組裝而成。

較佳地，所述Ca₇Si₂P₂O₁₆生物陶瓷是三維打印陶瓷支架。

較佳地，所述表面具有微納米結(jié)構(gòu)的生物陶瓷支架在功率為0.26～0.50W/cm²的近紅外光照射下的光熱溫度在40～100℃之間。

另一方面，本發(fā)明提供了一種表面具有微納米結(jié)構(gòu)的生物陶瓷支架的制備方法，，將Ca₇Si₂P₂O₁₆生物陶瓷支架浸入濃度為2～6mg/L的多巴胺溶液中，控制多巴胺溶液的pH為8.4～8.6，在20～60℃下浸泡1～3天。

本發(fā)明將Ca₇Si₂P₂O₁₆生物陶瓷支架浸入多巴胺的濃度為2～6mg/L的多巴胺溶液(例如多巴胺-Tris-HCl溶液)中，通過(guò)調(diào)節(jié)多巴胺溶液的pH為8.4～8.6、反應(yīng)溫度以及反應(yīng)時(shí)間，利用多巴胺的自聚合反應(yīng)在Ca₇Si₂P₂O₁₆生物陶瓷支架表面誘導(dǎo)出一層均勻的微納米結(jié)構(gòu)的聚多巴胺/CaP納米層。聚多巴胺/Ca-P納米層形成的機(jī)理是1)生物陶瓷中的Ca,P在溶液中降解，2)多巴胺在陶瓷表面聚合形成聚多巴胺，3)在形成聚多巴胺的同時(shí)，Ca,P濃度達(dá)到飽和后，聚多巴胺膜中的OH^-and NH^-提供成核位點(diǎn)，促進(jìn)Ca-P礦化。

較佳地，Ca₇Si₂P₂O₁₆生物陶瓷支架通過(guò)如下方法制備方法：

將Ca₇Si₂P₂O₁₆生物陶瓷粉體、聚醚F127和海藻酸鈉均勻混合，利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)軟件構(gòu)造生物陶瓷支架陶瓷素坯的結(jié)構(gòu)模型，三維打印所述生物陶瓷支架陶瓷素坯；

將所得生物陶瓷支架陶瓷素坯在1300～1450℃下燒結(jié)2～6小時(shí)，得到所述Ca₇Si₂P₂O₁₆生物陶瓷支架。

又，較佳地，所述Ca₇Si₂P₂O₁₆生物陶瓷粉體、聚醚F127和海藻酸鈉的質(zhì)量比為1:(0.04～0.06)：(0.4～0.6)。

較佳地，將所得多巴胺誘導(dǎo)的Ca₇Si₂P₂O₁₆生物陶瓷支架在功率為0.26～0.50W/cm²的近紅外光進(jìn)行照射處理，使得所述多巴胺誘導(dǎo)的Ca₇Si₂P₂O₁₆生物陶瓷支架的光熱溫度在40～100℃之間。

再一方面，本發(fā)明還提供了一種表面具有微納米結(jié)構(gòu)的生物陶瓷支架在制備治療骨腫瘤與修復(fù)骨缺損的材料中的應(yīng)用。

本發(fā)明制備的多巴胺誘導(dǎo)的生物陶瓷支架(DOPA-BC)具有良好的光熱性能，無(wú)論在干燥狀態(tài)下，還是浸泡在PBS中，都能實(shí)現(xiàn)超低功率下的快速升溫。通過(guò)改變多巴胺的濃度，激光功率可以對(duì)其最終達(dá)到的溫度進(jìn)行調(diào)控。而純生物陶瓷(BC)光照后溫度幾乎不變。在近紅外光照射后，DOPA-BC支架上的骨腫瘤死亡率達(dá)到～88.2％，乳腺癌細(xì)胞死亡率達(dá)到～80.4％。在裸鼠皮下腫瘤組織植入DOPA-BC支架后，光照導(dǎo)致的高溫，能有效抑制腫瘤生長(zhǎng)，且促進(jìn)腫瘤組織cleaved-PARP基因(細(xì)胞凋亡的標(biāo)記蛋白)的表達(dá)，抑制腫瘤組織Bcl-2基因(抑制腫瘤凋亡)的表達(dá)。同時(shí)多巴胺誘導(dǎo)的生物陶瓷支架生物相容性保持良好，兔子的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在支架表面鋪展、粘附良好。多巴胺誘導(dǎo)后，其表面的微納米結(jié)構(gòu)能顯著促進(jìn)兔子體內(nèi)成骨，同時(shí)驗(yàn)證了短期的光熱治療并不會(huì)阻礙長(zhǎng)期的骨修復(fù)效果。因此，制備的多巴胺誘導(dǎo)的生物陶瓷可修復(fù)骨腫瘤切除手術(shù)造成的大塊骨缺損，同時(shí)利用光熱療法，可有效殺死殘余骨腫瘤細(xì)胞，具有修復(fù)與治療的雙功能性。

附圖說(shuō)明

圖1中從左到右為實(shí)施例2制備的純生物陶瓷支架(BC)、以及實(shí)施例2制備的多巴胺誘導(dǎo)的Ca₇Si₂P₂O₁₆生物陶瓷支架的照片；

圖2為實(shí)施例2制備的純生物陶瓷支架(b)和實(shí)施例2制備的多巴胺誘導(dǎo)的Ca₇Si₂P₂O₁₆生物陶瓷支架(c)的光學(xué)顯微照片；

圖3為實(shí)施例2制備的純生物陶瓷支架表面的SEM圖；

圖4為實(shí)施例2制備的多巴胺誘導(dǎo)的Ca₇Si₂P₂O₁₆生物陶瓷支架表面的SEM圖；

圖5為不同濃度多巴胺誘導(dǎo)的Ca₇Si₂P₂O₁₆生物陶瓷支架在空氣(a)和PBS(磷酸緩沖鹽溶液)(b)中的光熱曲線，以及實(shí)施例2制備的多巴胺誘導(dǎo)的Ca₇Si₂P₂O₁₆生物陶瓷支架在激光功率0.26-0.50W/cm²的近紅外光照射下，調(diào)控光熱呈階梯式變化圖(c)；

圖6為實(shí)施例2制備的純生物陶瓷支架在不光照(a)和光照(c)情況下、以及實(shí)施例2制備的多巴胺誘導(dǎo)的Ca₇Si₂P₂O₁₆生物陶瓷支架(DOPA-BC)在不經(jīng)近紅外光照射(b)和近紅外光照射(d)情況下的骨腫瘤細(xì)胞(Saos2)的Live/Dead染色共聚焦成像圖，其中(e)和(f)分別為培養(yǎng)在支架上和爬片(指的是細(xì)胞爬片：將玻片浸在細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)，細(xì)胞在玻片上生長(zhǎng))上的骨腫瘤細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞在上述四種情況下的細(xì)胞存活率；

圖7為實(shí)施例2制備的純生物陶瓷支架和實(shí)施例2制備的多巴胺誘導(dǎo)的Ca₇Si₂P₂O₁₆生物陶瓷支架的植入裸鼠皮下腫瘤部位在光照和不光照條件下的裸鼠腫瘤體積隨治療天數(shù)的變化；

圖8為實(shí)施例2制備的純生物陶瓷支架和實(shí)施例2制備的多巴胺誘導(dǎo)的Ca₇Si₂P₂O₁₆生物陶瓷支架植入裸鼠皮下腫瘤部位在光照和不光照條件下的熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)；

圖9為實(shí)施例2制備的純生物陶瓷支架和實(shí)施例2制備的多巴胺誘導(dǎo)的Ca₇Si₂P₂O₁₆生物陶瓷支架植入裸鼠皮下腫瘤部位在光照和不光照條件下的治療15天后的腫瘤稱重統(tǒng)計(jì)；

圖10為實(shí)施例2制備的純生物陶瓷支架和實(shí)施例2制備的多巴胺誘導(dǎo)的Ca₇Si₂P₂O₁₆生物陶瓷支架植入裸鼠皮下腫瘤部位在光照和不光照條件下的腫瘤組織中PCNA的定量檢測(cè)圖；

圖11為實(shí)施例2制備的純生物陶瓷支架和實(shí)施例2制備的多巴胺誘導(dǎo)的Ca₇Si₂P₂O₁₆生物陶瓷支架植入裸鼠皮下腫瘤部位在光照和不光照條件下PARP降解產(chǎn)物(cleaved-PARP)的定量檢測(cè)圖；

圖12為實(shí)施例2制備的純生物陶瓷支架和實(shí)施例2制備的多巴胺誘導(dǎo)的Ca₇Si₂P₂O₁₆生物陶瓷支架植入裸鼠皮下腫瘤部位在光照和不光照條件下Bcl-2基因的定量檢測(cè)圖；

圖13為兔子骨間充質(zhì)干細(xì)胞在實(shí)施例2制備的純生物陶瓷支架上(a)和實(shí)施例2制備的多巴胺誘導(dǎo)的生物陶瓷支架(b)上培養(yǎng)1天后的熒光共聚焦圖，以及在兔子股骨大塊缺損中植入實(shí)施例2制備的純生物陶瓷支架(c)以及實(shí)施例2制備的DOPA-BC支架(d)后，進(jìn)行短期光照，植入8周后的組織學(xué)分析圖；

圖14為實(shí)施例2制備的純生物陶瓷支架Ca₇Si₂P₂O₁₆(a)和多巴胺誘導(dǎo)的表面具有聚多巴胺/Ca-P納米層(b)的生物陶瓷支架的EDS能譜；

圖15為實(shí)施例2制備多巴胺誘導(dǎo)的生物陶瓷支架的斷面SEM圖(a)及EDS線掃描圖(b)。

具體實(shí)施方式

以下通過(guò)下述實(shí)施方式進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，應(yīng)理解，下述實(shí)施方式僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。

本發(fā)明采用生物陶瓷(Nagel：Ca₇Si₂P₂O₁₆)為原材料，利用三維打印技術(shù)，制備純生物活性陶瓷支架。高溫?zé)Y(jié)后，將其浸泡在多巴胺溶液中，在生物支架表面形成了一層自組裝的均勻的聚多巴胺/Ca-P納米層，表面均勻的納米結(jié)構(gòu)層和純生物陶瓷支架基底之間還有一個(gè)過(guò)渡層，如圖15中(a)所示。從基底材料到表面納米層，Si含量逐漸降低，P和Ca含量在過(guò)渡層中含量先降低，在表面微納米層中含量又升高。C的含量在表面納米層有所增加，如圖15中(b)所示。

本發(fā)明制備出的功能化支架具有良好的生物活性、成骨性和抗腫瘤性。以下示例性地說(shuō)明本發(fā)明提供的多巴胺誘導(dǎo)的Ca₇Si₂P₂O₁₆生物陶瓷支架的制備方法。

Ca₇Si₂P₂O₁₆生物陶瓷支架的制備。具體來(lái)說(shuō)，將Ca₇Si₂P₂O₁₆生物陶瓷粉體(Nagel陶瓷粉)：海藻酸鈉:F127以質(zhì)量比為1:(0.04～0.06)：(0.4～0.6)進(jìn)行混合，利用軟件設(shè)計(jì)程序(主要包括設(shè)計(jì)支架具體參數(shù)，調(diào)控支架的形狀、尺寸等)，進(jìn)行三維打印。將打印好的支架素坯在1300-1450℃煅燒2～6小時(shí)，得到Ca₇Si₂P₂O₁₆生物陶瓷支架(Nagel生物陶瓷支架)。

多巴胺-Tris-HCl溶液的制備。將多巴胺溶解在Tris-HCl溶液中，攪拌至全部溶解，配成濃度為2-6mg/mL的多巴胺-Tris-HCl溶液。

將Nagel生物陶瓷支架浸泡在多巴胺-Tris-HCl溶液中，控制多巴胺-Tris-HCl溶液的pH為8.4～8.6，在20～60℃下浸泡1～3天。其中多巴胺-Tris-HCl溶液中的多巴胺濃度為2-6mg/mL，多巴胺濃度過(guò)低，不利于表面微納米結(jié)構(gòu)的生成。通過(guò)控制多巴胺溶液的濃度和/或浸泡時(shí)間可以控制Nagel生物陶瓷支架表面生成的聚多巴胺的含量和納米層的結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明通過(guò)光學(xué)顯微鏡和SEM對(duì)功能化支架進(jìn)行表征。表面的微納米結(jié)構(gòu)，具體表現(xiàn)為片狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的納米層，尺寸在50-150nm。

對(duì)本發(fā)明通過(guò)對(duì)陶瓷支架的體外、體內(nèi)抗腫瘤效果以及體外細(xì)胞相容性和體內(nèi)成骨活性的評(píng)價(jià)來(lái)確定制備的多巴胺誘導(dǎo)的表面具有微納米結(jié)構(gòu)的生物陶瓷(多巴胺誘導(dǎo)的Ca₇Si₂P₂O₁₆生物陶瓷支架)是否能夠成為兼具治療骨腫瘤和修復(fù)骨缺損的雙功能植入材料。

雙功能支架的光熱性能

本發(fā)明制備的多巴胺誘導(dǎo)的Ca₇Si₂P₂O₁₆生物陶瓷支架具有良好的光熱性能，無(wú)論在空氣(參見(jiàn)圖5中(a))中，還是在PBS(參見(jiàn)圖5中(b))中，都能實(shí)現(xiàn)超低功率下的快速升溫。本發(fā)明通過(guò)改變多巴胺的濃度和激光功率可以對(duì)多巴胺誘導(dǎo)的Ca₇Si₂P₂O₁₆生物陶瓷支架最終達(dá)到的溫度進(jìn)行調(diào)控。在0.26-0.50W/cm²的近紅外光照射下照射5-20分鐘后，本發(fā)明制備的多巴胺誘導(dǎo)的Ca₇Si₂P₂O₁₆生物陶瓷支架的光熱溫度能有效控制在40～100℃之間。此外，通過(guò)改變激光功率，多巴胺誘導(dǎo)的支架溫度可以實(shí)現(xiàn)階梯狀變化，如圖5中(c)。

表面具有納米結(jié)構(gòu)的生物陶瓷支架體外抗腫瘤

基于多巴胺優(yōu)良的光熱性能，進(jìn)一步驗(yàn)證了其體外光熱抗腫瘤效果。在0.38-0.42W/cm²超低功率的近紅外光照射下照射10-20min。支架的光熱溫度能控制在45～54℃左右，通過(guò)Live/Dead染色定性分析，可以看到，培養(yǎng)在DOPA-BC支架上的腫瘤細(xì)胞，無(wú)論是骨腫瘤細(xì)胞還是乳腺癌細(xì)胞，在近紅外光照射后，腫瘤都大面積呈現(xiàn)紅色熒光，說(shuō)明其死亡(如圖6中(d))。而在DOPA-BC、BC支架不光照組、BC支架光照組的細(xì)胞都呈現(xiàn)綠色熒光，說(shuō)明細(xì)胞狀態(tài)良好(如圖6中(a)、(b)、(c))。利用MTT對(duì)腫瘤細(xì)胞存活率定量分析，可以看到，無(wú)論直接培養(yǎng)在DOPA-BC支架上(參見(jiàn)圖6中(e))，還是直接培養(yǎng)在爬片上后慢慢加入DOPA-BC支架(參見(jiàn)圖6中(f))，在近紅外光照射后，兩種腫瘤細(xì)胞都顯著死亡，支架上的骨腫瘤死亡率達(dá)到～88.2％，乳腺癌細(xì)胞死亡率達(dá)到～80.4％。說(shuō)明DOPA-BC支架光照后，對(duì)支架上的細(xì)胞以及支架周圍的細(xì)胞都有殺傷作用。

多巴胺誘導(dǎo)的表面具有納米結(jié)構(gòu)的生物陶瓷支架裸鼠體內(nèi)抗腫瘤

在裸鼠皮下腫瘤部位(在皮下注射的乳腺癌腫瘤細(xì)胞，形成了皮下乳腺癌腫瘤)分別植入BC及DOPA-BC支架，再細(xì)分為光照組(純BC+NIR激光、DOPA-BC+NIR激光)和不光照組(純BC、DOPA-BC)，具體參見(jiàn)圖7-12。植入DOPA-BC支架在功率為0.42-0.50W/cm²的近紅外光的光照后，腫瘤部位溫度迅速提高到50℃左右。植入DOPA-BC支架光照治療后，裸鼠腫瘤體積隨天數(shù)的增加明顯減小(參見(jiàn)圖7)；光照治療15天后，DOPA-BC光照治療組腫瘤熒光強(qiáng)度顯著低于其他三組(參見(jiàn)圖8)；腫瘤體積和重量也顯著低于其他三組(參見(jiàn)圖7和圖9)。說(shuō)明DOPA-BC支架光照后，確實(shí)能有效抑制腫瘤生長(zhǎng)；

腫瘤組織的H&E染色結(jié)果顯示植入DOPA-BC支架在功率為0.42-0.50W/cm²的近紅外光的光照后，腫瘤細(xì)胞核大量消失，腫瘤細(xì)胞的形態(tài)被改變。進(jìn)一步探索體內(nèi)光熱抗腫瘤的機(jī)理，組織學(xué)形態(tài)分析中發(fā)現(xiàn)PCNA基因(在細(xì)胞增殖的啟動(dòng)上起重要作用)在植入DOPA-BC支架光照組的表達(dá)明顯受到抑制(參見(jiàn)圖10)。定性的Western blotting和定量檢測(cè)結(jié)果都顯示，植入DOPA-BC支架后，光照導(dǎo)致的高溫，促進(jìn)腫瘤組織cleaved-PARP基因(細(xì)胞凋亡的標(biāo)記蛋白)的表達(dá)(參見(jiàn)圖11)，抑制腫瘤組織Bcl-2基因(抑制腫瘤凋亡)的表達(dá)(參見(jiàn)圖12)。本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明DOPA-BC的光熱性能導(dǎo)致的高溫，不僅促進(jìn)了腫瘤組織細(xì)胞凋亡的基因的表達(dá)，同時(shí)抑制腫瘤增殖基因的表達(dá)。

多巴胺誘導(dǎo)的表面具有納米結(jié)構(gòu)的生物陶瓷支架裸鼠體內(nèi)體外骨修復(fù)能力

在BC支架和DOPA-BC支架上培養(yǎng)兔子的骨間充質(zhì)干細(xì)胞5天后，參見(jiàn)圖13中(a)和(b)，兩種支架上細(xì)胞的增殖沒(méi)有顯著差異，兩種支架上細(xì)胞都粘附的很好，細(xì)胞鋪展的很好，說(shuō)明BC，DOPA-BC支架都有良好的生物相容性。在兔子骨缺損中植入BC和DOPA-BC支架后，在功率為0.42-0.50W/cm²的近紅外光下進(jìn)行短時(shí)間光照10min，植入DOPA-BC支架組溫度達(dá)到50℃。植入8周后，在組織形態(tài)測(cè)量學(xué)的分析下，結(jié)果顯示植入形成的新骨顯著比植入純BC支架組多，參見(jiàn)圖13中(c)和(d)。說(shuō)明多巴胺誘導(dǎo)有顯著促進(jìn)體內(nèi)成骨，且短期的光熱治療并沒(méi)有阻礙長(zhǎng)期的骨修復(fù)效果。

下面進(jìn)一步例舉實(shí)施例以詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。同樣應(yīng)理解，以下實(shí)施例只用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容作出的一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。下述示例具體的工藝參數(shù)等也僅是合適范圍中的一個(gè)示例，即本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過(guò)本文的說(shuō)明做合適的范圍內(nèi)選擇，而并非要限定于下文示例的具體數(shù)值。

實(shí)施例1

將純Nagel粉體3g，與0.165g海藻酸鈉，1.65g F127充分混合后充分混合后，利用三維打印技術(shù)制備支架素坯；

將打印支架素坯在1350℃煅燒3小時(shí)，得到純Nagel陶瓷；

將純Nagel支架浸泡在濃度為2mg/mL多巴胺-Tris-HCl溶液中3天，浸泡溫度為20℃；

在0.42W/cm²超低功率的近紅外光照射下照射10min，測(cè)量腫瘤細(xì)胞死亡率，然后進(jìn)行生物活性，成骨性和體內(nèi)抗腫瘤性的評(píng)價(jià)，同發(fā)明內(nèi)容中的性能評(píng)價(jià)。

實(shí)施例2

純Nagel粉體3g，與0.15g海藻酸鈉，1.5g F127充分混合后，利用三維打印技術(shù)制備支架素坯；

將打印支架素坯在1400℃煅燒3小時(shí)，得到純的Nagel陶瓷；

將純Nagel支架浸泡在濃度為4mg/mL多巴胺-Tris-HCl溶液中3天，浸泡溫度為40℃；

在0.38W/cm²超低功率的近紅外光照射下照射10min，測(cè)量腫瘤細(xì)胞死亡率，然后進(jìn)行生物活性，成骨性和體內(nèi)抗腫瘤性的評(píng)價(jià)，同發(fā)明內(nèi)容中的性能評(píng)價(jià)。本實(shí)施例制備的多巴胺誘導(dǎo)的Ca₇Si₂P₂O₁₆生物陶瓷支架表面的聚多巴胺/Ca-P納米層的厚度為618nm。

實(shí)施例3

純Nagel粉體3g，與0.135g海藻酸鈉，1.35g F127充分混合后，利用三維打印技術(shù)制備支架素坯；

將打印支架素坯在1450℃煅燒3小時(shí)，得到純的Nagel陶瓷；

將純Nagel支架浸泡在濃度為6mg/mL多巴胺-Tris-HCl溶液中3天，浸泡溫度為60℃；

在0.38W/cm²超低功率的近紅外光照射下照射15min，測(cè)量腫瘤細(xì)胞死亡率，然后進(jìn)行生物活性，成骨性和體內(nèi)抗腫瘤性的評(píng)價(jià)，同發(fā)明內(nèi)容中的性能評(píng)價(jià)。

圖1中從左到右為實(shí)施例2制備的純生物陶瓷支架(BC)、以及實(shí)施例1-3制備的多巴胺誘導(dǎo)的Ca₇Si₂P₂O₁₆生物陶瓷支架的照片，從圖1中可知隨著多巴胺濃度的增加，支架的顏色由淺棕色變?yōu)樯钭厣?，說(shuō)明Ca₇Si₂P₂O₁₆生物陶瓷支架表面多巴胺的含量增多。

圖2為實(shí)施例2制備的純生物陶瓷支架(b)和實(shí)施例2制備的多巴胺誘導(dǎo)的Ca₇Si₂P₂O₁₆生物陶瓷支架(c)的光學(xué)顯微照片，從圖2中可知三維打印的生物陶瓷支架及多巴胺誘導(dǎo)的生物陶瓷支架具有較均勻的孔道結(jié)構(gòu)。

圖3為實(shí)施例2制備的純生物陶瓷支架表面的SEM圖，從圖3中可知純生物陶瓷表面是光滑的。

圖4為實(shí)施例2制備的多巴胺誘導(dǎo)的Ca₇Si₂P₂O₁₆生物陶瓷支架表面的SEM圖，從圖4中可知聚多巴胺/Ca-P納米層表具有均勻的微納米結(jié)構(gòu)。

圖5中(a)和(b)分別為實(shí)施例1-3制備的多巴胺誘導(dǎo)的Ca₇Si₂P₂O₁₆生物陶瓷支架在空氣和PBS中的光熱曲線，可以看出多巴胺誘導(dǎo)的生物陶瓷支架具有良好的光熱性能，無(wú)論在空氣中，還是在PBS中，都能實(shí)現(xiàn)快速升溫。通過(guò)改變多巴胺的濃度、激光功率可以對(duì)其最終達(dá)到的溫度進(jìn)行調(diào)控，在0.26-0.50W/cm²的近紅外光照射下，多巴胺誘導(dǎo)后支架的光熱溫度能有效控制在40-100℃之間。圖5中(c)為實(shí)施例2制備的多巴胺誘導(dǎo)的Ca₇Si₂P₂O₁₆生物陶瓷支架在激光功率為0.26-0.50W/cm²的近紅外光照射下光熱溫度隨時(shí)間的變化圖，圖中光熱溫度穩(wěn)定值分別對(duì)應(yīng)的光熱溫度為40℃、45℃、50℃、55℃。因此可以看出通過(guò)改變激光功率，多巴胺誘導(dǎo)的支架溫度可以實(shí)現(xiàn)階梯狀變化。

圖6為實(shí)施例2制備的純生物陶瓷支架在不光照(a)和光照(c)情況下、以及實(shí)施例2制備的多巴胺誘導(dǎo)的Ca₇Si₂P₂O₁₆生物陶瓷支架(DOPA-BC)在不經(jīng)近紅外光照射(b)和近紅外光照射(d)情況下的骨腫瘤細(xì)胞(Saos2)的Live/Dead染色共聚焦成像圖，其中(e)和(f)分別為培養(yǎng)在支架上和爬片的骨腫瘤細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞在上述四種情況下的細(xì)胞存活率，可以看出DOPA-BC支架光照后，對(duì)支架上的細(xì)胞以及支架周圍的細(xì)胞都有殺傷作用。

圖7-9為實(shí)施例2制備的純生物陶瓷支架和實(shí)施例2制備的多巴胺誘導(dǎo)的Ca₇Si₂P₂O₁₆生物陶瓷支架的植入裸鼠皮下腫瘤部位在光照和不光照條件下的裸鼠腫瘤體積隨治療天數(shù)的變化、熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)、治療15天后的腫瘤稱重統(tǒng)計(jì)，可知DOPA-BC支架光照后，確實(shí)能有效抑制腫瘤生長(zhǎng)。

圖10-12為實(shí)施例2制備的純生物陶瓷支架和實(shí)施例2制備的多巴胺誘導(dǎo)的Ca₇Si₂P₂O₁₆生物陶瓷支架植入裸鼠皮下腫瘤部位在光照和不光照條件下的腫瘤組織中PCNA、cleaved-PARP、Bcl-2(f)三種基因的定量檢測(cè)，可以看出DOPA-BC的光熱性能導(dǎo)致的高溫，不僅促進(jìn)了腫瘤組織細(xì)胞凋亡的基因的表達(dá)，同時(shí)抑制腫瘤增殖基因的表達(dá)。

圖13為兔子骨間充質(zhì)干細(xì)胞在實(shí)施例2制備的純生物陶瓷支架上(a)和實(shí)施例2制備的多巴胺誘導(dǎo)的生物陶瓷支架(b)上培養(yǎng)1天后的熒光共聚焦圖，以及在兔子股骨大塊缺損中植入實(shí)施例2制備的純生物陶瓷支架(c)以及實(shí)施例2制備的DOPA-BC支架(d)后，進(jìn)行短期光照，植入8周后的組織學(xué)分析圖，可知多巴胺誘導(dǎo)有顯著促進(jìn)體內(nèi)成骨，且短期的光熱治療并沒(méi)有阻礙長(zhǎng)期的骨修復(fù)效果。

圖14為實(shí)施例2制備的純生物陶瓷支架Ca₇Si₂P₂O₁₆(a)和多巴胺誘導(dǎo)的表面具有聚多巴胺/Ca-P納米層(b)的生物陶瓷支架的EDS能譜，從圖14中可知多巴胺誘導(dǎo)后，支架表面的Ca,P,C元素含量增加，Si，O元素含量降低。