本申請是申請號為201280034022.9、申請日為2012年5月3日、發明名稱為“由人巨細胞病毒感染的細胞制造致密體(db)”的發明專利申請的分案申請。
本發明涉及致密體(db)的制造和含有db的藥學組合物。
背景技術：
還被稱為人類皰疹病毒5的人巨細胞病毒(hcmv)為一種覆膜的雙股dna病毒，其屬于皰疹病毒。hcmv對于健康的成人是通常無害的。然而在妊娠中該病毒是特別危險的，并且可以對未出生的胎兒甚至是危及生命的。對于具有虛弱的免疫系統的人，也可能由被hcmv感染發展成嚴重的疾病。因此，特別有危險的是艾滋病患者、移植受者、干細胞移植后的白血病患者、以細胞抑制劑治療的患者等等。
對于具有虛弱的免疫系統的患者，在hcmv感染時使用病毒抑制劑，例如更昔洛韋、膦甲酸、西多福韋、并且也可能是阿昔洛韋。
此外，從多年前起已經致力于抗hcmv的痘苗或疫苗的發展。因此例如嘗試了，以削弱的或減毒的活痘苗引發所期望的免疫力。然而由此僅僅可以獲得有限的保護。
另外的方式在于，借助于所謂的致密體(db)實現接種疫苗。在這種情況下涉及由hcmv派生出的、在電子顯微鏡中可見的結構。db為在其被膜中膜圍繞的亞病毒顆粒，被膜由細胞脂質膜派生而出、嵌入病毒糖蛋白。這些病毒蛋白很有可能以天然的構象存在于病毒脂質膜中。類似于病毒顆粒，db在被感染的細胞的細胞質中形成并且最終由細胞排出。db的90％db蛋白質量由病毒編碼為所謂的pp65(ul83)蛋白組成。此外在db中，還可以探測到病毒蛋白pp150(ul32)、gh(ul75)、gm(ul100)以及gb(ul55)。因為db不含有病毒dna和病毒殼體，所以其是非感染性的。
在現有技術中描述了，db由于其高度近似于hcmv抗原特性的抗原特性，適合作為抗hcmv感染或在hcmv感染時作用的痘苗。這種痘苗被證明是特別有效的。因為db是非感染性的，所以風險方面和副作用與活痘苗的情況相比明顯較少受批評的。因此，含有db的、名稱為“vmp2001”的痘苗已經存在于臨床試驗中。以db接種疫苗的原則和優點例如在wo00/5372中進行了描述。
由于db在hcmv的正常侵染循環中：i)僅以微小的量形成并且因此僅以有限的量提供；并且ii)db制劑可能在一定情況下被感染性的hcmv污染，存在對以下方法的需求，即，通過該方法db的形成可以有針對性地提高并且防止通過感染性的hcmv而污染。
reefschlaeger等(2001,journalofantimicrobialchemotherapy(抗菌化學療法雜志)48,757-767)和buerger等(2001,journalofvirology(病毒學雜志)75,9077-9086)描述了一種名稱為bay38-4766的物質，其應當提升所形成的db的量。
hwang等(2007,journalofvirology81,11604-11611)和hwang等(2009,antimicrobialagentsandchemotherapy(抗微生物制劑與化學療法)53,5095-5101)描述了苯并咪唑基-d核糖核苷，其同樣能夠適用于所形成的db的量的提升。
然而，迄今所描述的用于db形成優化的所謂適用的物質都沒有在實踐中得以證明。
技術實現要素：
在這個背景下，本發明的任務在于：提供另外的物質，該物質作為在生產db時的添加物i)防止db制劑被感染性的hcmv污染；ii)在db生產的范疇下提升db的產率。
這個任務通過如下物質的用途解決，該物質選自以下物質：
本發明的另外的任務在于，提供一種用于制造db的新穎的方法。
這個另外的任務通過具有以下步驟的方法解決(1)提供在適當的介質中的被人巨細胞病毒(hcmv)感染的生物細胞，以及(2)以選自以上所列出的物質(a)到(d)的物質培養受感染的生物細胞。
發明人認識到，以上的鑒定證明的物質極其良好地適應于制造db。可以特別地注意到的是：被hcmv感染的生物細胞，例如原代成纖維細胞，在存在這些化合物的情況下在細胞質中富集高濃度的db并且釋放到介質中。在此，作為特別的優點表明的是，物質(a)到(d)防止完好的病毒顆粒在細胞核中組合，并且因此導致，沒有感染性的hcmv由已感染的細胞中排出。因此可以容易地由介質或已感染的細胞的裂解液分離db，而無需擔心被感染性的病毒顆粒污染。
根據本發明，這些允許hcmv的生物細胞是適用于使用在該方法中的。
根據本發明對于“適當的介質”理解為常見的細胞培養基。在此優選涉及根據各個使用的細胞種類所用的介質。適當的介質例如為：伊格爾(氏)最低限度必需介質(emem)+10％胎牛血清(fcs)+2mml-谷氨酰胺+1％青霉素/鏈霉素(pen/strep；青霉素g鈉10000μg/ml；0.85％硫酸鏈霉素)；emem+10％fcs+2mml-谷氨酰胺+1mm丙酮酸鈉(nap)+1％非必需氨基酸+1％pen/strep或者帶有100μg/ml慶大霉素的rpmi1640；5u/ml肝素；50μg/ml血管內皮細胞生長因子；15％人血清(對于hcmv呈血清陰性)和12μg/ml西普樂(cibrobay)，等等。
在此，根據本發明當生物細胞為原代細胞時是優選的，其優選地選自由以下所構成的組：人內皮細胞、人成纖維細胞、人樹突狀細胞、人上皮細胞和人巨噬細胞。
這種措施具有以下優點，即，使用這些允許hcmv并且因此特別適用于制造db的細胞。
此外，當利用物質在濃度約1nmol/l到約100μmol/l的介質中進行培養生物細胞時，是優選的。
這種措施具有以下優點，即，選擇這些根據發明人的認識導致特別良好的結果的濃度范圍。確切的濃度依賴于所使用的生物細胞以及感染用的hcmv株(stamm)。濃度可以由本領域技術人員通過簡單的滴定列沒有困難地在單個情況下測定。因此，發明人可以通過物質(a)和以hcmv株ad169感染的人包皮成纖維細胞(hff)在濃度為50nmol/l的情況下獲得最優的結果。在同樣的方式下對于物質(b)、(c)和(d)，5nmol/l、500nmol/l以及500nmol/l的濃度導致最優的結果。在通過出自人臍靜脈內皮細胞(huvec)(以hcmv株tb40/e感染)培養的情況下，對于物質(a)、(b)、(c)和(d)，300nmol/l、300nmol/l、3μmol/l以及30μmol/l的濃度導致最優的結果。在使用被hcmv的臨床分離物感染的hff的情況下(在共培養中帶有未感染的hff)，300nmol/l、300nmol/l、3μmol/l以及30μmol/l的濃度同樣導致良好的結果。
此外，當培養進行1天到14天的持續時間時是優選的，優選為3至10天，最優選的為5天。
這種措施具有以下優點，即，在培養時在所給出的時間范圍內得到足夠高的db量。
此外根據本發明，當在以所述物質培養生物細胞之后進行db的分離時，是優選的。
這種措施具有以下優點，即，db可以以能夠直接再處理的形式(例如疫苗配方)提供。db的分離根據本領域技術人員公知的方法進行。例如離心無細胞的介質并在此沉淀db。然后db可以容易地由上清液分出。
在這種背景下，本發明還涉及一種用來制造優選為疫苗的藥學組合物的方法，其具有以下步驟：(1)制造致密體(db)；(2)提供(bereitstellen)在步驟(1)中制造的db；以及(3)把在步驟(2)中提供的db配制到藥學上可接受的載體中，其中，在步驟(1)中的制造以根據之前所描述的、根據本發明的方法實現。
藥學上可接受的載體在現有技術中一般公知，這些載體例如包括：結合劑、崩解劑、填充劑、潤滑劑以及粉末、鹽和其他適用于藥品配方的物質；可參見rowee.等的handbookofpharmaceuticalexcipients,5thedition,pharmaceuticalpress(藥用輔料手冊，第5版，醫藥出版社)，2006；或者bauer等的lehrbuchderpharmazeutischentechnology,6.auflage,wissenschaftlicheverlagsgesellschaftstuttgartmbh(制藥技術教科書，第6版，斯圖加特科學出版有限責任公司),1999。以上公開出版物的內容引用成為本申請的組成部分。
此外在制造疫苗時，可以設置引起免疫反應增強的佐劑。佐劑可以為油-水混合物、脂多糖、氫氧化鋁等等。在現有技術中全面的描述了佐劑。
在這種背景下，本發明還涉及一種優選為疫苗的藥學組合物，其根據以上所描述的方法制造。
關于根據本發明的用來制造db的用途和根據本發明的用來制造db的方法所描述的特征、性質和優點，同樣適用于根據本發明的制造藥學組合物的方法以及適用于根據本發明的藥學組合物。
附圖說明
接著描述本發明的優選實施例，優選實施例是純為解釋性的并且不對本發明的范圍產生限制。在此，參照附圖：
圖1示出了以物質(a)、(b)、(c)和(d)培養的、并且在之前以hcmv感染的細胞的電子顯微鏡拍照，該細胞與未經處理的細胞(e)相比較在其細胞質中富集較大量的db(箭頭)。
具體實施方式
1.根據本發明的物質(a)到(d)
在wo2004/096778的72頁和73頁上的實施例14和15中詳盡描述了物質a的合成，物質a為(4s)-{8-氟-2-[4-(3-甲氧基苯基)-1-哌嗪基]-3-[2-甲氧基-5-(三氟甲基)苯基]-3,4-二氫-4-喹唑啉基}乙酸。
在wo2006/089664的39頁和40頁上的實施例2中詳盡描述了物質b的合成，物質b為n-{1-甲基-2-[(4-(5-甲基-吡啶-2-基)-哌嗪-1-基)羰基]-1h-咪唑-4-基}-n'-[4-(三氟甲氧基)苯基]脲。
在wo2007/090579的96頁和97頁上的實施例47中詳盡描述了物質c的合成，物質c為1-[6-氟-8-甲氧基-3-({[2-甲基-4-(三氟甲氧基)芐基]氨基}羰基)-4-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,4-二氫喹啉-7-基]哌啶-4-羧酸。
在wo2007/101573的49頁上的實施例1中詳盡描述了物質d的合成，物質d為n-{3-[({4-[5-(6-氨基吡啶-2-基)-1,2,4-惡二唑-3-基]苯基}磺酰基)氨基]-5-氟苯基}-1-氰基環丙烷甲酰胺。
上述文獻wo2004/096778、wo2006/089664、wo2007/090579和wo2007/101573的內容，特別是涉及到的鑒定證明性的合成描述，引用成為本公開的組成部分。
2.制造致密體(db)
2.1在以hcmv株ad169感染的成纖維細胞中的制造
人包皮成纖維細胞(“humanforeskinfibroblasts；hff”)在感染前一天以1×106細胞每瓶的量加入到5個t75細胞培養瓶中。提供hcmv株ad169作為冷凍的、不含細胞的病毒制劑，其從在晚期感染階段的細胞提取。根據本發明的物質(a)、(b)、(c)和(d)作為各50mmol/l的在dmso中的原液提供。
原液以1:1000稀釋到50μmol/l的最終濃度。溶液如下地進一步稀釋：a:1:1000(50nmol/l)在12mlmem中為12μml；
b:1:10000(5nmol/l)在12mlmem中為1.2μml；
c:1:100(500nmol/l)在12mlmem中為120μml；
d:1:100(500nmol/l)在12mlmem中為120μml。
hff細胞通過病毒制劑在m.o.i.(multiplicityofinfection；感染復數)為：≥≥1個tcid50(50％組織培養感染劑量)/細胞的(1:20稀釋)的條件下感染一個小時。接著病毒拋棄病毒上清液并且以在以下濃度下的根據本發明的物質培養受感染的細胞：
a:50nmol/l；
b:5nmol/l；
c:500nmol/l；
d:500nmol/l。
細胞被培養5天，其中，在第一天和第四天之后更新含有該物質的介質。在培養后，用電子顯微方法對受感染的細胞進行db形成的檢測。
結果在附圖1中示出。在此表明的是，所有以根據本發明的物質(a)、(b)、(c)和(d)處理的細胞都富集了高濃度的db(箭頭)，而未處理的細胞(e)在其細胞質中幾乎沒有富集db。db以箭頭標識。此外，在處理過的細胞的細胞質中沒有發現任何感染性病毒顆粒，而在未處理的細胞的細胞質中檢測到了相當大數量的相應顆粒。
2.2在以hcmv株tb40/e感染的內皮細胞中的制造
在另外的試驗中出自人臍靜脈內皮細胞(huvec)以由在晚期感染階段的細胞分離出hcmv株tb40/e感染。試驗設計與在2.1下所示出的相應，其中，以在以下濃度下的根據本發明的物質對細胞進行培養：
a:300nmol/l；
b:300nmol/l；
c:3μmol/l；
d:30000μmol/l。
在電子顯微方法檢測中，在受感染細胞的細胞質中同樣表現出了強烈的db富集，該受感染的細胞以根據本發明的物質(a)、(b)、(c)和(d)培養。在對照組(e)中僅可以確定少量的db。與在2.1中所描述的發現相似地，在經處理的細胞的細胞質中同樣沒有檢測到病毒。
2.3在以臨床hcmv分離物感染的人成纖維細胞中的制造，其中，感染的人成纖維細胞與沒有感染的人成纖維細胞共培養
如以上在2.1所描述的那樣，hff以臨床hcmv分離物(其由晚期感染階段的細胞分離)感染。感染的hff與未感染的hff在迷你托盤(minitrays)中(2000細胞/凹槽)共培養。制造三種不同的感染細胞/未感染細胞的比例：未稀釋；1:2稀釋；1:4稀釋。根據本發明的物質以以下濃度與細胞一起培養：
a:300nmol/l；
b:300nmol/l；
c:3μmol/l；
d:30μmol/l。
在37℃下培養5天之后，進行電子顯微檢測。在此表明的是，在存在最高份額的感染細胞的組中，確切地說“未稀釋”的組中，在以根據本發明的物質培養后的細胞在其細胞質中積累非常大量的db。以未感染的細胞稀釋得越嚴重，那么在細胞質中積累的db就越少。在沒有根據本發明的物質的對照組中，僅能夠確定非常少的db。此外，通過加入根據本發明的物質，還避免了感染性顆粒由細胞核中排出。
3.分離致密體
在現有技術中，例如pepperl等在(2000)journalofvirology(病毒學雜志)74,6132-6146中和irmiere,a.與w.gibson在(1993)virology(病毒學)130,118-133中，詳盡地描述了分離。以上所述的公開出版物的內容引用成為本申請的組成部分。
相應地，顆粒按照以下描述從受感染細胞的培養基純化：受感染的細胞在感染后6天由細胞培養容器底部刮去并且再次懸浮到介質中。懸浮液以低速離心，例如在1500g時在4°進行10分鐘。所獲得的無細胞的介質加入到酒石酸鉀-甘油梯度(在0.05ml三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽(trishcl)、ph7.4、0.1mnacl(tn緩沖液中；talbot與almeda，1997))上，并且在40000rpm的情況下，在使用beckman轉子sw41和sorvall超速離心機otd-50下，在低加速度和在“raking(粗篩)”模式下在4°進行15分鐘離心。含有db的帶在梯度中通過特有的散射光的特性而確定。該帶通過在使用32號規格針頭通過離心管壁的抽取而取出。在必要時，db可以通過再次的相應的沉淀或者更長的、直至平衡的離心過程(確切的說為18小時)，在使用相同的梯度/和離心條件的情況下進一步純化。
4.結論
發明者可以證明，通過物質(a)、(b)、(c)和(d)可以極其有效地制造高的db量，其例如在進行分離和純化之后可以作為疫苗使用。特別有利的是，借助于以上所列出的物質可以以高純度分離db。