本發明屬于醫藥生物
技術領域：
，具體涉及一種三葉青提取物在制備腫瘤免疫治療藥物及人γδT細胞增殖劑中的應用。
背景技術：
：近年來，腫瘤的生物治療已經成為腫瘤治療領域研究的熱點。γδT細胞是一類獨立的淋巴細胞群，主要分布于人黏膜和上皮組織內，具有較強的抗腫瘤作用，主要以主要組織相容性復合物(majorhistocompatibilitycomplex，MHC)非限制性方式識別腫瘤，通過顆粒酶B(granzymeB)和穿孔素(perforin)等途徑殺傷腫瘤細胞，并與其它固有免疫細胞和適應性免疫細胞相互作用，輔助發揮抗腫瘤作用。人γδT細胞已經成為腫瘤患者過繼免疫治療一個新的候選效應細胞。由此可見，有效擴增人外周血細胞，以滿足γδT細胞生物學功能研究和臨床過繼免疫治療的需要，提高γδT增殖率和功能是十分重要和必要的。而γδT細胞表面的CD107aPb分子，與γδT細胞活化以后脫顆粒過程相關，其比值可以直接反應該效應細胞具有的特異性殺傷活性。本研究用LDH釋放法檢測的殺傷活性也驗證了穿孔素、顆粒酶和CD107a比例增高與殺傷活性相關。同時，γδT細胞還能與其它固有免疫細胞和適應性免疫細胞相互作用，協同發揮抗腫瘤作用。目前γδT細胞已經成為腫瘤患者過繼免疫治療的重要效應細胞。由此可見，為滿足生物學功能研究和臨床過繼細胞免疫治療需要，擴增出高效和較多數量的γδT細胞是許多學者共同研究的課題。三葉青為葡萄科崖爬藤屬，為植物三葉崖爬藤(TetrastigmahemsleyanumDielsetGilg)的干燥塊根，又名金絲吊葫蘆等，是我國的特有植物，主要分布于中國東南地區民間的常用藥物。三葉青的有效成分主要為含黃酮類化學成份，其性涼，味辛、苦，無毒，具有清熱解毒、活血止痛、祛風化痰、活血止痛等功效，常用于高熱驚厥，小兒感冒發熱、喉癢腫痛、咳嗽、肺炎、肝炎、腸炎、痢疾等疾病。現代藥理研究表明，三葉青提取物具有較好的抗腫瘤、抗炎、鎮痛及解熱作用等。據文獻報道，三葉青總黃酮對腫瘤細胞具有抑制細胞增殖和誘導凋亡的作用。一些運用三葉青為主藥用于腫瘤臨床，發現在抑制腫瘤生長,延緩病人的生命，改善生命征象方面有獨特的效果。三葉青植物主要分布于長江以南各地，是民間常用的中草藥，在感冒發熱、喉癢腫痛、咳嗽、肺炎、肝炎、腸炎、痢疾等疾病中只需較低的藥量即可達到明顯的臨床療效，而目前國內外許多研究認為，高濃度三葉青提取物中的有效成分能抑制腫瘤細胞增殖，對腫瘤細胞出現抑制時的用量大多在10mg/ml左右。這一結果與臨床實際用量明顯不符。因此，對三葉青中有效成分的研發和對三葉青進一步的臨床應用具有重要的意義。本研究前期對三葉青的成分進行提取分離和鑒定分析，發現不同部位的三葉青提取物，只要很低的劑量即能明顯促進人γδT細胞增殖，提高γδT細胞的殺瘤活性。技術實現要素：本發明的目的是為了解決現有技術的不足，而提供一種三葉青提取物的新的醫藥用途，可為腫瘤免疫治療藥物研發提供實驗參考。本發明采用如下技術方案：三葉青提取物在制備腫瘤免疫治療藥物中的應用。更進一步地，上述提高自身抗腫瘤免疫細胞的藥物為乳腺癌免疫治療藥物、胃癌免疫治療藥物或肝癌免疫治療藥物。三葉青提取物在制備人γδT細胞增殖劑中的應用：由健康人外周血中分離單個核細胞，用含200U/mlrhIL-2的γδT培養基誘導培養γδT細胞。使用不同濃度的三葉青提取物作用γδT細胞24h、48h和72h后，用CCK-8法測定不同濃度三葉青提取物組γδT細胞增殖能力；采用流式細胞術檢測各組γδT細胞穿孔素、顆粒酶B和CD107a的表達；用LDH法檢測經三葉青提取物誘導培養的γδT細胞對三株腫瘤細胞的殺傷活性。三葉青提取物能夠顯著促進人γδT細胞的增殖，提高其穿孔素、CD107a和顆粒酶B的表達，具有一定的劑量依賴性；經三葉青提取物處理后的γδT細胞，能明顯提高γδT細胞和殺瘤活性，具有一定的劑量依賴性。高濃度三葉青提取物能抑制腫瘤細胞生長。與現有技術相比，本發明的有益效果：第一：本發明首次發現，低濃度三葉青提取物即能夠顯著促進人γδT細胞的增殖；第二：低濃度三葉青提取物能促進γδT細胞穿孔素、顆粒酶B和CD107a的表達；明顯提高γδT細胞的殺傷活性；第三：本發明首次發現三葉青不同提取成分對γδT細胞的增殖有明顯差異。附圖說明圖1為培養前外周血單個核細胞中γδTCR表達率；圖2為培養10天后細胞中γδTCR表達率；圖3為三葉青提取液Th-t對γδT細胞生長曲線圖；圖4為三葉青提取液Th-p對γδT細胞生長曲線圖；圖5為三葉青提取液Th-a對γδT細胞生長曲線圖；圖6為三葉青提取液Th-b對γδT細胞生長曲線圖；圖7為三葉青提取液Th-w對γδT細胞生長曲線圖；圖8為三葉青提取液Th-w2對γδT細胞生長曲線圖；圖9為三葉青提取液Th-bml對γδT細胞生長曲線圖；圖10為三葉青總提取物(TH-t)對三株腫瘤細胞株的抑制作用；圖11為三葉青提取物誘導前γδT細胞對顆粒酶B表達的影響；圖12為三葉青提取物誘導前γδT細胞對其穿孔素表達的影響；圖13為三葉青提取物誘導前γδT細胞對CD107a表達的影響；圖14為0.15μg/ml三葉青總提取物(TH-t)誘導后對γδT細胞顆粒酶B表達的影響；圖15為0.15μg/ml三葉青總提取物(TH-t)誘導后對γδT細胞穿孔素表達的影響；圖16為0.15μg/ml三葉青總提取物(TH-t)誘導后對γδT細胞CD107a表達的影響；圖17為三葉青總提取物誘導的γδT細胞對腫瘤細胞的殺傷活性影響。具體實施方式下面結合實施例對本發明作進一步的詳細描述。本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發明，而不應視為限定本發明的范圍。實施例1：三葉青藥材提取分離實驗情況1、材料與方法1.1、材料三葉青干燥塊根購于寧波市鄞州醫藥藥材公司；80％大孔吸附樹脂樹色譜儀；Yanaco顯微熔點測定儀(溫度計未校正)；VarianMAT-212型質譜儀；Bruker-speckospinAC-600P型核磁共振儀。薄層色譜硅膠板與柱色譜硅膠(100～200目、200～300目)均為山東煙臺江友硅膠開發公司生產；SephadexLH-20(20～80μm)為Pharmacia公司生產；ODSC18反相硅膠為Merck公司生產；提取用乙醇；石油醚、乙酸乙酯、正丁醇為藥用級，水為蒸餾水，其余試劑均為分析純。1.2、方法1.2.1、提取液分組：根據提取時所選用的制劑將提取液分為9組，分別命名為：TH-t、TH-p、TH-a、TH-b、TH-w、TH-w1、TH-w2、TH-w3和TH-w41.2.2、各組三葉青提取物的提取方法三葉青提取物提取參照文獻[楊陽.甘西鼠尾草及頭花蓼化學成分研究.第二軍醫大學碩士學位論文.上海：第二軍醫大學，2009]分離純化得到，經高效液相色譜(HPLC)檢查。1.2.2.1、TH-t部分：取三葉青干燥藥材200g，加5倍體積80％乙醇水溶液浸泡24h后，加熱回流提取，共3次，每次40min，合并提取液，過濾，減壓回收蒸干，得總提取物TH-t21.6g，得率10.8％。1.2.2.2、TH-p部分：取此總提取，加水混懸，分別采用10倍體積的石油醚(水飽和)進行分步萃取。分別得到石油醚部位TH-p0.15g，得率0.075％。1.2.2.3、TH-a部分：乙酸乙酯部位TH-a0.58g，得率0.29％1.2.2.4、TH-b部分：正丁醇部位TH-b2g，得率1％1.2.2.5、TH-w部分：以及水部位TH-w18.9g，得率9.45％1.2.2.6、TH-w1部分：取水部位進行大孔吸附樹脂色譜，先使用純水進行洗脫，除去糖分，再使用10％、30％、60％、95％乙醇水溶液分別依次洗脫。其中，10％乙醇水洗脫溶液減壓回收蒸干后得到水部位脫糖流分TH-w10.14g,得率0.07％1.2.2.7TH-w2部分：取水部位進行大孔吸附樹脂色譜，先使用純水進行洗脫，除去糖分，再使用10％、30％、60％、95％乙醇水溶液分別依次洗脫。其中，30％乙醇水洗脫溶液蒸干后得到水部位脫糖流分TH-w10.3g,得率0.15％1.2.2.8、TH-w3部分：將上述經有機溶劑提取后的三葉青藥材用水煮后減壓回收蒸干，獲得脫水物2.1克。1.2.2.9、TH-w4部分：將上述經有機溶劑提取后的三葉青藥材用減壓回收蒸干脫水，再使用10％、30％、60％、95％乙醇水溶液分別依次脫糖，其中，獲得了10％乙醇水部位脫糖流分。2、結果如下表所示：表1不同提取方法提取三葉青的結果編號部位分組質量實際重量得率180％乙醇總提物(乙醇DMS0)TH-t21.5g0.55g10.8％2石油醚部位(DMS0)TH-p0.15g0.05g0.075％3乙酸乙酯部位(DMS0)TH-a0.58g0.58g0.29％4正丁醇部位(H2O醇)TH-b2g1.4g1％5水部位(H2O)TH-w18.9g0.04g9.45％6水部位脫糖流分(H2O)TH-w10.15g0.15g0.07％7水部位脫糖后流分(H2O)TH-w22.060.3g8水煮物(去糖)TH-w30.6g9水煮物(含糖)TH-w42.1g實施例2：三葉青提取物對γδT細胞增殖的影響實驗1、材料與方法1.1、實驗材料無血清培養基(浙江博納生物科技有限公司產品)；四甲基偶氮唑藍(methlthiazolyltetrazolium,MTT)和二甲基亞砜(dimethylsμlfoxideDMSO)(Sigma公司)；淋巴細胞分離液(中國科學院血液病研究所)；IL-2、IL-15和IL-21(廈門特寶生物公司)；INF-γ購于Abender公司；胰蛋白酶、RPMl1640、小牛血清(均購自GIBCO公司)；人AB血清(徐州市血站)；FITC和PE標記的CD3、FITC標記的γδTCR、PE標記的穿孔素(pore-formingprotein,PFP)、顆粒酶B(GranzymeB，GrB)、APC標記的CD107a(聯科生物有限公司)；乳酸脫氫酶(Lactatedehydrogenase,LDH)試劑盒(日本世諾臨床診斷制品株式會社)；Encore自動生化分析儀(北京希亞克技術有限公司；熒光倒置顯微鏡TE2000-S(日本Nikon公司)；流式細胞儀(美國BD公司)；流式細胞儀分析軟件CellQuest，每個標本分析細胞數≥l×104。1.2、γδT細胞培養及鑒定取健康獻血者外周抗凝血10ml，淋巴細胞分離液分離單個核細胞，用含200U/mlrhIL-2的γδT培養基調整細胞密度為3.5×105/mL，接種于6孔細胞培養板中，毎孔5ml，于37℃、5％CO2培養箱培養，每2天半量換液1次，并調整細胞密度為5×105/mL，收集培養7天的γδT細胞，加入FITC標記的γδTCR抗體進行細胞表面標志檢測。1.3、CCK8法檢測不同三葉青提取物對人γδT細胞生長的影響取培養7天的γδT細胞配成5×104/mL的細胞懸液，加入96孔細胞培養板，200μl/孔。實驗組：共設11個濃度組，分別加入5×104/mL的γδT細胞，180μl/孔。然后加入不同濃度的三葉青提取物(終濃度分別為0.000625、0.0025、0.01、0.039、0.155、0.62、2.44、9.76、39、156μg/ml)每組設5個復孔，同時設末加藥物空白對照組：于細胞培養箱中培養24h、48h、72h。培養結束前4個小時每孔加入CCK820μl，繼續孵育4h后于酶標儀450nm處檢測各孔吸光值(OD)，并記錄結果。增殖率(％)＝(實驗OD值)—(對照OD值)/(對照OD值)×100％。2、統計方法采用SPSS13.0軟件進行統計學處理，計量資料使用均數±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析(One-wayANOVA)，檢驗水準α＝0.05，P≤0.05有統計學意義。3、結果3.1、γδT細胞鑒定培養前外周血中CD3-CD56+的γδT細胞為3.12％。收集培養10d時的γδT細胞，用流式細胞儀檢測其細胞表型，結果顯示，γδT細胞高達90.46％，見圖1和圖2。3.2、各階段三葉青提取物對γδT細胞生長影響各提取階段三葉青提取物對γδT細胞生長影響有較大差異，在藥物濃度相同條件下，以水煮脫糖部位(Th-w3)時促γδT細胞生長活性最強；總提取物(Th-t)、石油醚部位(Th-p)和水部位脫糖流分次之，與對照組比較均有統計學差異(p＜0.05)。其他結果均有一定的促γδT細胞增殖作用。提取物Th-w4部分對γδT細胞生長無明顯影響。各三葉青提取物對γδT細胞生長均有時間依賴性，藥物誘導時間越長，促進細胞增殖越明顯，組與組之間比較均有統計學差異(p＜0.05)。結果見圖3-9。實施例3：三葉青提取物對三種腫瘤細胞株的抑制試驗1、材料與方法1.1、實驗材料無血清培養基(浙江博納生物科技有限公司產品)；四甲基偶氮唑藍(methlthiazolyltetrazolium,MTT)和二甲基亞砜(dimethylsμlfoxideDMSO)(Sigma公司)；淋巴細胞分離液(中國科學院血液病研究所)；乳酸脫氫酶(Lactatedehydrogenase,LDH)試劑盒(日本世諾臨床診斷制品株式會社)；Encore自動生化分析儀(北京希亞克技術有限公司；熒光倒置顯微鏡TE2000-S(日本Nikon公司)；流式細胞儀(美國BD公司)；流式細胞儀分析軟件CellQuest，每個標本分析細胞數≥l×104。1.2、三葉青提取物對三種腫瘤細胞株生長的影響取對數生長期的乳腺癌MCF-7、胃癌SGC-7901和肝癌HepG2細胞分別配成3×107/L的細胞懸液加入96孔板，每孔180μl，每組設5個復孔，同時設陰性對照組；將培養板放入37℃、50mL/LCO2培養箱培養24h后，實驗組分別加入不同種類和濃度的三葉青提取物(濃度分別為0.25、1、4、16、31.5、125、500、2000μg/ml)，同時設不加藥的對照組。于37℃、50mL/LCO2培養箱中培養72h；在培養結束前4小時加入MTT20μl/孔，繼續培養4h后棄去上清，加入DMSO150μl，使甲贊完全溶解，于酶標儀495nm處檢測各孔吸光值(OD)記錄結果。細胞抑制率IR(％)＝(對照OD值)—(實驗OD值)/(對照OD)×100％。相同實驗重復3次，取平均值。2、統計方法采用SPSS13.0軟件進行統計學處理，計量資料使用均數±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析(One-wayANOVA)，檢驗水準α＝0.05，P≤0.05有統計學意義。3、結果將乳腺癌MCF-7、胃癌SGC-7901和肝癌HepG2細胞分別用不同提取段和不同濃度的三葉青提取物進行誘導培養，經誘導72小時后，高濃度的三葉青提取物對三種腫瘤細胞均有抑制作用，隨著藥物濃度的增加抑制越明顯。但是，各濃度組對腫瘤細胞抑制深度均在156μg/ml以上，低于10μg/ml時各組均無抑制現象。三葉青總提取物對三株腫瘤細胞的抑制率見圖10。實施例4：三葉青提取物對γδT細胞上穿孔素、CD107a和顆粒酶B的表達和殺傷活性影響實驗1、材料與方法1.1、實驗材料無血清培養基(浙江博納生物科技有限公司產品)；四甲基偶氮唑藍(methlthiazolyltetrazolium,MTT)和二甲基亞砜(dimethylsμlfoxideDMSO)(Sigma公司)；淋巴細胞分離液(中國科學院血液病研究所)；IL-2(廈門特寶生物公司)；INF-γ購于Abender公司；胰蛋白酶、RPMl1640、小牛血清(均購自GIBCO公司)；人AB血清(徐州市血站)；FITC和PE標記的CD3、FITC標記的γδTCR、PE標記的穿孔素(pore-formingprotein,PFP)、顆粒酶B(GranzymeB，GrB)、APC標記的CD107a(聯科生物有限公司)；乳酸脫氫酶(Lactatedehydrogenase,LDH)試劑盒(日本世諾臨床診斷制品株式會社)；Encore自動生化分析儀(北京希亞克技術有限公司；熒光倒置顯微鏡TE2000-S(日本Nikon公司)；流式細胞儀(美國BD公司)；流式細胞儀分析軟件CellQuest，每個標本分析細胞數≥l×104。1.2、γδT細胞培養及鑒定人外周血γδT細胞的培養及鑒定取健康獻血者外周抗凝血10ml，淋巴細胞分離液分離單個核細胞，用含200U/mlrhIL-2的γδT培養基調整細胞密度為3.5×105/mL，接種于6孔細胞培養板中，毎孔5ml，于37℃、5％CO2培養箱培養，每2天半量換液1次，并調整細胞密度為5×104/mL，收集培養7天的γδT細胞，加入FITC標記的γδTCR抗體進行細胞表面標志檢測。1.3、LDH釋放法檢測三葉青提取物作用后的γδT細胞對三株腫瘤細胞的殺傷活性取經不同濃度(終濃度分別39、9.76、2.44、0.62、0.155、0.039、0.01和0.0025μg/ml)三葉青提取物誘導48h后的γδT細胞配成2×109/L，作為效應細胞；對數生長期的胃癌SGC-7901、肝癌HepG2和乳腺癌MCF-7細胞分別配成2×108/L，作為靶細胞；將效靶細胞各取0.5ml等量混合(效靶細胞比例＝10:1)，同時設置不加三葉青提取物為對照組。置37℃、5％CO2培養箱中孵育6h后，輕輕混勻，重懸細胞，1500r/min離心10min，收集上清液。LDH試劑盒按說明書要求操作，340nm波長下Encore自動生化分析儀測定LDH的活性單位(U/L)。每檢測樣本設3個復管，重復3遍，取平均值。γδT細胞的殺傷活性＝(測定管LDH單位－效應細胞自然釋放LDH管)/(靶細胞最大釋放LDH管－靶細胞自然釋放LDH管)×100％。1.4、流式細胞儀檢測γδT細胞上穿孔素和顆粒酶B和CD107a的表達將培養成功的γδT細胞配成濃度為1.0×105/ml的細胞懸液，接種于6孔培養板，每孔3ml，然后加入終濃度分別為0μg/ml、39、9.76、2.44、0.62、0.15、0.039、0.01和0.0025的三葉青提取物，每組3個復孔。于37℃、5％CO2培養箱中培養48h。收集細胞并用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，每管加入anti-γδTCR-FITC抗體20μl，避光孵育30min。加入100μl固定液室溫避光孵育15min，PBS洗滌1次。每管加100μl破膜液，100μlanti-Perforin抗體及anti-granzymeB-PE抗體和APC標記的CD107a抗體，室溫避光孵育15min，PBS洗滌后，重懸于0.5ml的PBS溶液中，分別用流式細胞術檢測穿孔素、顆粒酶B和CD107a的表達。2、統計方法采用SPSS13.0軟件進行統計學處理，計量資料使用均數±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析(One-wayANOVA)，檢驗水準α＝0.05，P≤0.05有統計學意義。3、結果3.1、三葉青提取物對γδT細胞中顆粒酶B、穿孔素表達的影響結果與0μg/ml對照組相比，39、9.76、2.44、0.62、0.15、0.039、0.01和0.0025μg/ml的三葉青提取物作用γδT細胞48h后，其穿孔素和顆粒酶B陽性表達均明顯升高。三葉青總提取物濃度在0.15μg/ml(TH-t)時誘導的γδT細胞顆粒酶、穿孔素和CD107a表達率達到最高值，分別為76.90％±2.31％和30.5％±1.29％和81.4％，而濃度超過10μg/ml時穿孔素、顆粒酶B和CD107a陽性表達率有所下降，結果見圖11-16。3.2、實驗結果顯示，濃度為2.44～0.01μg/ml三葉青總提取物(TH-t)作用72h后的γδT細胞細胞，對胃癌SGC-7901、肝癌HepG2和乳腺癌MCF-7細胞的殺傷活性顯著高于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)。在0.155μg/ml時殺傷活性達最高(分別為53.6％、72.5％和79.7％)，與對照組(分別為31.1％、38.4％和41.3％)比較差異有統計學意義(P＜0.05)。三葉青濃度高于2.44μg/ml時，殺傷活性隨濃度增高逐漸降低，當濃度為39mg/L時，可抑制γδT細胞對3株腫瘤細胞的殺傷活性(P＜0.05)，結果見圖17。本行業的技術人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發明的原理，在不脫離本發明精神和范圍的前提下，本發明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發明范圍內。本發明要求保護范圍由所附的權利要求書及其等效物界定。當前第1頁1 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