本發明屬于生物醫學工程領域，具體涉及一種殼聚糖季銨鹽豬脫細胞真皮基質敷料及其制備方法。
背景技術：
皮膚是維持內環境穩定和阻止微生物入侵的屏障。皮膚創傷治療的最終目標是重建或恢復皮膚屏障，一個性能良好的創面敷料可暫時起到屏障作用，提供一個有利創面愈合的環境。理想的創面敷料應具有:①良好的粘附性、通透性，又具有類似正常皮膚的水分蒸發率;②能阻止細菌入侵和限制細菌在創面上定殖;③減輕疼痛;④具有良好的彈性和柔韌性，可隨體形覆蓋創面，適合于人體不同部位;⑤有效防止移植后引起的癱痕形成和創面收縮;⑥能誘導細胞生長，促使自體成纖維細胞在異種支架中生長;促進創面愈合，以達外觀平整的目的;⑦對組織無刺激性、無毒性、無抗原性、具有良好的生物相容性;⑧能耐受常用消毒方法處理，能在長期保存，并能大量生產。
脫細胞真皮基質去除了皮膚中的表皮層及含抗原成分的細胞僅保留真皮中含膠原網架的細胞外基質，具有抵抗原性、良好的生物學性能和力學性能,是一種理想的生物敷料。異種(豬)脫細胞真皮基質相比于異體脫細胞真皮基質具有來源廣泛,價廉質優等優點,并且在膠原含量、結構上與人體皮膚具有很高的組織同源性并且高度相似，已在臨床上取得廣泛應用。但豬脫細胞真皮基質沒有抗菌能力，作為敷料使用時容易受細菌感染而導致創面感染，又具有交叉感染的危險性等缺點，限制了其作為敷料在臨床上的應用。
技術實現要素：
本發明針解決豬脫細胞真皮基質作為敷料時容易受細菌感染的缺點，提供一種殼聚糖季銨鹽豬脫細胞真皮基質敷料及其制備方法。
為實現上述目的，本發明的技術方案如下：一種殼聚糖季銨鹽豬脫細胞真皮基質敷料，由豬脫細胞真皮基質與殼聚糖季銨鹽組成，所述的殼聚糖季銨鹽為殼聚糖經由縮水甘油基三乙基氯化銨或縮水甘油基三甲基氯化銨改性制得。
一種殼聚糖季銨鹽豬脫細胞真皮基質敷料的制備方法，所述制備方法具體步驟如下：
S1、殼聚糖季銨鹽的制備：（a）、將殼聚糖溶于冰乙酸溶液中，制成殼聚糖溶液，將所述殼聚糖溶液中加入NaOH溶液，使pH調節至大于9，將殼聚糖絮狀物析出；（b）、將所述殼聚糖絮狀物加入蒸餾水攪拌后以3000rpm的速度進行離心處理10分鐘獲取沉淀，再用蒸餾水將所述沉淀洗至中性；（c）、將步驟（b）所述沉淀置于圓底燒瓶中，加入異丙醇，加熱至75-80℃反應30-60min，然后加入縮水甘油基三乙基氯化銨或縮水甘油基三甲基氯化銨的水溶液，75-80℃反應6h，旋轉蒸發除去多余溶劑，加入乙醇/丙酮混合液，靜置10-30min，過濾，得殼聚糖季銨鹽；（d）、用蒸餾水將殼聚糖季銨鹽配制形成質量濃度為5%的殼聚糖季銨鹽溶液以備用；
S2、豬脫細胞真皮基質的處理：將豬脫細胞真皮基質置于乙醇中進行脫水處理，然后再置于-80℃冷凍干燥機中冷凍干燥，最后紫外照射滅菌3-6h；
S3、殼聚糖季銨鹽豬脫細胞真皮基質敷料的制備:將步驟（S2）處理所得的豬脫細胞真皮基質，浸泡于步驟（S1）所述殼聚糖季銨鹽溶液中，于室溫下邊攪拌邊超聲處理1-2h，攪拌速度為1500-2000rpm，然后在無菌環境下，將豬脫細胞真皮基質取出，然后用無水乙醇沖洗，置于-80℃冷凍干燥機中冷凍干燥，即得殼聚糖季銨鹽豬脫細胞真皮基質敷料。
優選的，步驟（S1）中所述的冰乙酸的濃度為1%（質量濃度），NaOH溶液的濃度為1mol/L，加入異丙醇的量為殼聚糖絮狀物的體積的3-5倍，乙醇/丙酮混合溶液由乙醇和丙酮按體積比1:1混合而成。
優選的，步驟（S1）中所述的縮水甘油基三乙基氯化銨或縮水甘油基三甲基氯化銨的加入量與殼聚糖的加入量的比例為按縮水甘油基三乙基氯化銨或縮水甘油基三甲基氯化銨中所含有的環氧基團物質的量（N1）與殼聚糖的氨基含量（N2）兩者之比為1:1或1:2。
優選的，步驟（2）中所述的豬脫細胞真皮基質的脫水處理步驟為：先將豬脫細胞真皮基質依次浸泡于75%、85%、95%的乙醇中各6h，然后置于無水乙醇中超聲處理60min。
優選的，步驟（3）中所述豬脫細胞真皮基質浸泡于殼聚糖季銨鹽溶液中的量為殼聚糖季銨鹽溶液與豬脫細胞真皮基質的體積比為50:1。
本發明的有益效果為：
（1）本發明的殼聚糖季銨鹽豬脫細胞真皮基質敷料完整地保留了細胞的形態結構和組成成分，具有抗原性低的特點，同時可誘導具有再生能力的成纖細胞及血管內皮細胞在其中生長。
（2）復合在豬脫細胞真皮基質上的殼聚糖季銨鹽具有緩釋效果，可以持續作用于再生細菌，能達到持續、高效抗菌的效果，能減少敷料的換藥次數，降低交叉感染的風險，同時減少了換藥時為患者帶來的痛苦。
（3）殼聚糖季銨鹽相比于傳統的抗菌劑不會產生耐藥性，具有持久的抗感染能力和良好的生物相容性，且殼聚糖季銨鹽具有促進創面愈合的作用。
（4）通過對豬脫細胞真皮基質進行多次的梯度脫水，超聲，冷凍干燥處理，使豬脫細胞真皮基質里殘留的可能引起免疫原性的水溶性物質去除，并且使脫細胞真皮基質原有的三維網狀結構更加疏松，使得殼聚糖季銨鹽能更好地復合到在其中。
（5）本發明中所制得的殼聚糖季銨鹽豬脫細胞真皮基質敷料，由于殼聚糖季銨鹽具有良好的溶解性，在使用時用無菌生理鹽水濕潤后會在敷料的表面形成水凝膠，敷料能更好地粘附在創面上，減少創面的水分流失，緩解痛楚。此外，由于殼聚糖季銨鹽具有良好的吸液性和具有一定的止血功能，本發明所制得的殼聚糖季銨鹽豬脫細胞真皮基質敷料能起到止血效果。
（6）相比于添加其他的抗菌劑（如納米銀、抗生素等），本發明采用的殼聚糖季銨鹽具有良好的生物安全性和長效的抗菌性能。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明的技術方案做進一步的說明。
實施例1
一種殼聚糖季銨鹽豬脫細胞真皮基質敷料的制備方法，所述制備方法具體步驟如下：
S1、殼聚糖季銨鹽的制備：將一定量的殼聚糖（氨基含量為n1）溶于質量濃度為1%的冰乙酸溶液中，制成殼聚糖溶液，再用1mol/L的NaOH溶液調節其pH至大于9，使殼聚糖絮狀物析出，加入蒸餾水攪拌1h后，3000rpm離心10 min，得到殼聚糖沉淀，然后加入蒸餾水浸沒沉淀攪拌1h，測試水的pH值，再用蒸餾水將沉淀洗至中性。將殼聚糖沉淀置于圓底燒瓶中，加入異丙醇（按異丙醇與殼聚糖沉淀體積比為5：1），加熱至80℃，反應60min，然后取含環氧基團物質的量為 n2（n1:n2=1:1）的縮水甘油基三乙基氯化銨溶于蒸餾水中，逐滴加入燒瓶中水溶液，80℃反應6h，旋轉蒸發除去多余溶劑，然后加入10倍體積的乙醇/丙酮混合液（乙醇與丙酮的體積比為1:1），靜置30min，抽濾，濾出沉淀物其置于 60℃真空干燥箱中干燥，即得殼聚糖季銨鹽，最后用蒸餾水將殼聚糖季銨鹽配制形成質量濃度為5%的殼聚糖季銨鹽溶液以備用；
S2、將豬脫細胞真皮基質浸泡于75%乙醇中6h；取出后置于85%乙醇中6h；取出后再置于95%乙醇中6h，再超聲處理10min，無菌操作下從浸泡液中取出，紫外照射3h滅菌；
S3、殼聚糖季銨鹽豬脫細胞真皮基質敷料的制備: 將步驟2中處理所得的豬脫細胞真皮基質浸泡于質量濃度為5%的殼聚糖季銨鹽溶液中超聲處理2h，重復3次，該過程中殼聚糖季銨鹽溶液與豬脫細胞真皮基質的體積比為50:1，完成后在4℃下低溫放置24h，取出浸泡后的豬脫細胞真皮基質，用PBS緩沖溶液沖洗數遍后，冷凍干燥即得殼聚糖季銨鹽豬脫細胞真皮基質敷料。
實施例2
一種殼聚糖季銨鹽豬脫細胞真皮基質敷料的制備方法，所述制備方法具體步驟如下：
S1、殼聚糖季銨鹽的制備：將一定量的殼聚糖（氨基含量為n1）溶于質量濃度為1%的冰乙酸溶液中，制成殼聚糖溶液，再用1mol/L的NaOH溶液調節其pH大于9，使殼聚糖絮狀物析出，加入蒸餾水攪拌1h后，3000rpm離心10 min，得到殼聚糖沉淀，然后加入蒸餾水浸沒沉淀攪拌1h，測試水的pH值，再用蒸餾水將沉淀洗至中性。將殼聚糖沉淀置于圓底燒瓶中，加入異丙醇（按異丙醇與殼聚糖沉淀體積比為5：1），加熱至75℃，反應30min，然后取含環氧基團物質的量為 n2（n1:n2=1:2）的縮水甘油基三甲基氯化銨溶于蒸餾水中，逐滴加入燒瓶中水溶液，75℃反應6h，旋轉蒸發除去多余溶劑，然后加入10倍體積的乙醇/丙酮混合液（乙醇與丙酮的體積比為1:1），靜置30min，抽濾，濾出沉淀物其置于 60℃真空干燥箱中干燥，即得殼聚糖季銨鹽，最后用蒸餾水將殼聚糖季銨鹽配制形成質量濃度為5%的殼聚糖季銨鹽溶液以備用；
S2、將豬脫細胞真皮基質浸泡于75%乙醇中12h；取出后置于85%乙醇中12h；取出后再置于95%乙醇中12h，再超聲處理10min，無菌操作下從浸泡液中取出，紫外照射3h滅菌；
S3、殼聚糖季銨鹽豬脫細胞真皮基質敷料的制備:將步驟2中處理所得的豬脫細胞真皮基質浸泡于質量濃度為5%的殼聚糖季銨鹽溶液中超聲處理2h，重復3次，該過程中殼聚糖季銨鹽溶液與豬脫細胞真皮基質的體積比為50:1，完成后在4℃下低溫放置24h，取出浸泡后的豬脫細胞真皮基質，用PBS緩沖溶液沖洗數遍后，冷凍干燥即得殼聚糖季銨鹽豬脫細胞真皮基質敷料。
實施例3：動物傷口愈合實驗
取雄性新西蘭兔，40只，每只2~3kg，隨機分為四組，每組10只。各兔子均按照臨床動物實驗燒傷標準模型制備方法均造成手術留下的深II度傷口，其中A組兔子先對傷口進行縫合然后使用干凈紗布進行包扎并每隔三天更換一次紗布，B組兔子先對傷口進行縫合然后使用豬脫細胞真皮基質為敷料包扎傷口，C、D組分別敷用本發明實施例1、2的殼聚糖季銨鹽豬脫細胞真皮基質敷料，并試驗過程無需更換敷料，直到C、D組的創面愈合便結束本次動物實驗。
表1 各組動物創面感染及愈合情況(%)
從上述試驗可知，僅僅使用干凈紗布進行包扎傷口，傷口感染率高，愈合速度慢，且愈合后留下明顯的傷痕；
而使用豬脫細胞真皮基質為敷料包扎傷口，雖然提高了傷口愈合時間與減少疤痕產生，但由于愈合過程中傷口容易出現感染，導致愈合速度慢；
分別敷用本發明實施例1、2的殼聚糖季銨鹽豬脫細胞真皮基質敷料的C、D兩組并未出現紅腫、膿液現象，傷口愈合速度快，并且傷口愈合后無疤痕產生，說明本發明具備有持續抗菌能力，且能誘導細胞生長，提高傷口愈合速度，有效減少疤痕產生。
應當指出的是，具體實施方式只是本發明比較有代表性的例子，顯然本發明的技術方案不限于上述實施例，還可以有很多變形。本領域的普通技術人員，以本發明所明確公開的或根據文件的書面描述毫無異議的得到的，均應認為是本專利所要保護的范圍。