一種去氫駱駝蓬堿長循環磁納米脂質體的制備方法與流程

本發明涉及一種磁納米脂質體的制備方法，具體涉及一種去氫駱駝蓬堿長循環磁納米脂質體的制備方法。
背景技術：
：去氫駱駝蓬堿(Harmine,HM)是一種β-咔啉類生物堿，從蒺藜科植物駱駝蓬的種子中提取得到的，它源自新疆維吾爾族特有抗腫瘤藥用植物多裂駱駝蓬草的種籽提取物。駱駝蓬為多年生草本植物，在新疆作為民族藥使用已有很長的歷史，資源豐富、蘊藏量大。HM的藥理作用十分廣泛，對中樞系統、心血管系統、肌肉、離子通道均具有抑制作用。近年來研究發現HM具有抑制細胞免疫和體液免疫、防輻射、抗包蟲、抑制單胺氧化酶、抗腫瘤、抗炎鎮痛止癢、抗銀屑病等作用。并且也發現去氫駱駝蓬堿口服后易透過血腦屏障，在腦中濃度高于血漿中濃度，進入腦內后代謝也很快，90min后腦內血藥濃度僅是峰濃度的10％。其進入腦內后，能與腦內包括單胺氧化酶受體、5－羥色胺受體等多種受體結合，并能提高腦內谷氨酸鹽濃度，從而對帕金森病、阿爾茨海默病、抑郁有效。目前，抗腫瘤作用受到廣大研究人員的關注，但是HM存在嚴重的中樞神經毒副作用，例如可引起震顫，驚厥，興奮中樞，繼而產生抑制作用，甚至導致死亡，限制了其臨床應用。為了降低HM的毒副作用，藥劑研究者們進行了多方面的劑型研究，但至今為止HM還無國家正式批準的抗腫瘤制劑。技術實現要素：本發明所要解決的技術問題是，提供一種去氫駱駝蓬堿長循環磁納米脂質體的制備方法。本發明解決其技術問題所采用的技術方案是，一種去氫駱駝蓬堿長循環磁納米脂質體的制備方法，將大豆卵磷脂、二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG-2000)、膽固醇及去氫駱駝蓬堿置于圓底燒瓶中，其中，大豆卵磷脂∶二棕櫚酰磷脂酰膽堿∶膽固醇∶二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000按照5～12∶5～12∶5～10∶1～2(優選大豆卵磷脂∶二棕櫚酰磷脂酰膽堿∶膽固醇∶二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000為10∶10∶5∶1或5∶5∶10∶1)；溶于體積比為1∶2乙醚和氯仿混合溶劑中形成溶液,將上述溶液旋轉蒸發形成薄膜后，加入含磁納米粒水溶液，水化，即成；或者上述溶液與水相體積3:1比例加入含磁納米粒水溶液，冰浴超聲乳化1～2h后，旋轉蒸發成膠態，加水水化，即成；其中，所述去氫駱駝蓬堿加入量為大豆卵磷脂、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、膽固醇的總重量的1/5～1/20；所述含磁納米粒水溶液中含有的磁納米粒的量為大豆卵磷脂、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、膽固醇的總重量的28.6％～15.4％。進一步，還包括配體事先連接在二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000的分子上再進行去氫駱駝蓬堿長循環磁納米脂質體的制備，或配體直接連接在去氫駱駝蓬堿長循環磁納米脂質體上。進一步，所述配體選用乳鐵蛋白或RGD肽等配體。進一步，所述磁納米粒選用粒徑在10～50nm的超小超順磁納米粒(USPIO)，這種磁納米粒可以自制也可以購買。本發明進一步解決其技術問題所采用的技術方案是，一種去氫駱駝蓬堿長循環磁納米脂質體在制備治療腦癌的藥物中的應用，所述去氫駱駝蓬堿長循環磁納米脂質體是由權利要求1～5制備得到的。本發明通過旋轉蒸發法或逆相蒸發法將磁納米粒(USPIO)包裹入脂質體內，同時在脂質體表面連接聚乙二醇長鏈以達到長循環作用，還可以在脂質體表面偶聯配體或抗體(可事先通過化學鍵偶聯到脂質成分二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000的分子表面，再進行去氫駱駝蓬堿長循環磁納米脂質體的制備，也可以通過磁納米脂質體制成后，再通過化學偶聯的方式偶聯到脂質體上)，以達到脂質體的主動靶向作用。本發明將去氫駱駝蓬堿包裹入磁納米脂質體，可達到磁靶向和配體主動靶向及長循環多重作用，從而提高去氫駱駝蓬堿在腫瘤中的治療指數，降低其毒副作用；同時針對去氫駱駝蓬堿易入腦的特點，獨創性地將去氫駱駝蓬堿用于治療腦癌的藥物中，對于現在無特效藥的腦癌擬起到治療作用。附圖說明圖1(a)、(b)為cRGD偶聯的HM磁納米脂質體透射電鏡圖。圖2為cRGD偶聯的去氫駱駝蓬堿磁納米脂質體粒徑分布。圖3為cRGD偶聯的去氫駱駝蓬堿磁納米脂質體電位分布。圖4為cRGD偶聯的去氫駱駝蓬堿磁納米脂質體的釋放度(n＝3)。圖5為HM磁納米脂質體的粒徑圖。圖6為Lf包裹的磁納米脂質體的粒徑圖。圖7為HM磁納米脂質體的電位圖。圖8為Lf包裹的磁納米脂質體的電位圖。具體實施方式下面結合實施例和附圖對本發明進一步加以說明。實施例11、RGD偶聯的去氫駱駝蓬堿磁納米脂質體的制備事先精密稱取cyclo(Arg-Gly-Aspd-Phe-Cys)(cRGDfc)2.5mg、馬來酰基-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(Mal-DSPE-PEG-2000)5mg置于小瓶中，加2mL磷酸鹽緩沖液溶解，置于磁力攪拌器上室溫下攪拌48h，HPLC下檢測cyclo(Arg-Gly-Aspd-Phe-Cys)(cRGDfc)分子中的巰基與馬來酰基-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(Mal-DSPE-PEG-2000)中的馬來酰基是否發生化學偶聯反應，形成cRGDfc-DSPE-PEG-2000。若偶聯成功后置于冷凍干燥儀中冷凍干燥，保存在-20℃備用。精密稱取一定量的大豆卵磷脂、DPPC、DSPE-PEG-2000、膽固醇、制備的cRGD-DSPE－PEG－2000置于150mL圓底燒瓶中，溶于6mL乙醚和氯仿混合溶劑中(V乙醚：V氯仿＝1:2)溶解,精密稱取1.25mgHM于試管中加入2mL甲醇溶解后也置于6mL乙醚和氯仿混合溶劑中溶解，再按油水相體積3:1比例加入水溶液(其中含5mg/mlUSPIO1ml)；與上述溶液一同置于圓底燒瓶中混勻,冰浴超聲90min，直至形成穩定的W/O型乳劑。將此乳劑置于旋轉蒸發儀上在50℃，0.05MPa條件下減壓蒸發除去有機溶劑，達到膠態后，加入10mL蒸餾水水化，繼續減壓蒸發20min除去殘留溶劑，得到紅褐色混合液，即為去氫駱駝蓬堿磁納米脂質體，4℃保存，放置4小時后分別用0.45μm和0.22μm微孔濾膜擠壓濾過即可對其進行體外性質測定。其中，實施例中USPIO可采用市售10～50nm的USPIO，也可采用自制的粒徑在20～30nm的磁納米粒。2、實驗結果采用自制的磁納米粒制得的cRGD偶聯的去氫駱駝蓬堿磁納米脂質體，不同藥脂比情況下的包封率、粒徑、電位結果如表1～2：表1-不同重量比的脂質體包封率(n＝3)磷脂∶DPPC∶膽固醇10∶10∶55∶5∶105∶5∶56∶12∶512∶6∶5EE％87.7358.08745.62356.04353.18表2-不同重量比的脂質體粒徑電位表(n＝3)磷脂∶DPPC∶膽固醇10∶10∶55∶5∶105∶5∶56∶12∶512∶6∶5粒徑(nm)349.3263.6287.8383.5139.7電位(mV)-22.7-21.5-33.4-13.6-17.2由表1～2可知，最優的處方是在磷脂∶DPPC∶膽固醇＝10∶10∶5處方條件下，所得的藥物包封率最高，為87.73％，包封率大于80％，粒徑在340nm左右，電位在-20mv左右。采用市售的USPIO制得的cRGD偶聯的去氫駱駝蓬堿磁納米脂質體，形態結果見圖1(a)和圖1(b)，粒徑分布圖見圖2，電位分布圖見圖3。由圖1～3可知，脂質體呈圓形，為單層脂質體形態，脂質體內部可見有磁納米粒包裹，脂質體粒徑分布較窄，荷負電。不同藥脂比情況下的包封率、粒徑、電位、包封的鐵含量結果如表3～6：采用磷脂∶DPPC∶膽固醇為10∶10∶5的比例制備去氫駱駝蓬堿長循環磁納米脂質體，測定其在pH7.2磷酸鹽緩沖液中的釋放度，結果見圖4。表3-不同質量比cRGD偶聯去氫駱駝蓬堿磁納米脂質體包封率(n＝3)磷脂∶DPPC∶膽固醇10∶10∶55∶5∶105∶5∶5EE％75.01％87.64％67.04％表4-不同質量比的脂質體粒徑值表(n＝3)單位：nm磷脂∶DPPC∶膽固醇10∶10∶55∶5∶105∶5∶5過膜后粒徑(nm)277.9289.4273.6表5-不同質量比的脂質體電位值表(n＝3)單位：mV磷脂∶DPPC∶膽固醇10∶10∶55∶5∶105∶5∶5過膜后電位(mV)-20.8-30.5-21.0表6-不同質量比的脂質體Fe2+含量單位：μg/ml磷脂∶DPPC∶膽固醇10∶10∶55∶5∶105∶5∶5Fe2+含量(μg/ml)145.28151.54145.54由表1～2可知，最優的處方是在磷脂∶DPPC∶膽固醇＝5∶5∶10處方條件下，所得的藥物包封率最高，為87.64％，包封率大于80％，粒徑為289.4nm，在200-300nm之間，電位為-30.5mV，Fe2+含量為151.54μg/ml。藥物在6h后釋放完全。實施例21、乳鐵蛋白偶聯的去氫駱駝蓬堿磁納米脂質體的制備精密稱取一定量的大豆卵磷脂、DPPC、DSPE-PEG-2000、膽固醇及1.25mgHM置于150mL圓底燒瓶中，溶于6mL乙醚和氯仿混合溶劑中(V乙醚：V氯仿＝1:2),置于旋轉蒸發儀上旋轉蒸發形成薄膜，然后加入水溶液(其中含5mg/mlUSPIO1ml)在旋轉蒸發儀上水化，得到去氫駱駝蓬堿磁納米脂質體。在此基礎上，取適量乳鐵蛋白溶于水中，配成一定濃度水溶液，加入上述得到的去氫駱駝蓬堿磁納米脂質體液中室溫下孵育4h，使配體利用靜電作用或事先在配制磁納米脂質體時加入馬來酰基-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(Mal-DSPE-PEG-2000)，利用乳鐵蛋白自身的巰基與馬來酰基-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000中的馬來酰基發生加成反應，從而使配體包裹在脂質體表面，即得到乳鐵蛋白包裹的去氫駱駝蓬堿磁納米脂質體。通過脂質體中大豆磷脂、DPPC、膽固醇含量的優化，發現當大豆磷脂、DPPC、膽固醇的比例為10：10：5，或5：5：10時，可獲得藥物包封率在80％以上的脂質體。2、實驗結果采用激光粒徑測定儀測定脂質體的粒徑和電位，分別吸取0.5mL制得的Lf偶聯的HM磁納米脂質體和未偶聯Lf的HM磁納米脂質體，分別加蒸餾水稀釋至2mL，過膜擠壓后放入樣品池中，采用激光粒徑測定儀測定粒徑及電位，超濾離心法測定Lf包裹的HM磁納米脂質體包封率，實驗結果見表7～8。包裹Lf前后的粒徑分布圖和電位分布圖見圖5～圖8。由圖5～圖8可知，包裹配體前后脂質體的粒徑分布和電位變化不大。表7-HM脂質體的粒徑,電位表8-超濾離心法測定Lf包裹的HM磁納米脂質體包封率結果當前第1頁1 2 3