本發明屬于益生菌生物醫藥與保健品
技術領域：
，具體涉及一種防治糖尿病并控制體重的復合益生菌制劑的制備方法。
背景技術：
：糖尿病是現代疾病中的第二殺手，其對人體的危害僅次于癌癥。其實，糖尿病本身并不可怕，可怕的是糖尿病的并發癥，糖尿病帶來的危害，幾乎都來自它的并發癥。在我國糖尿病患者中，合并高血壓者多達1200萬，腦卒中者500萬，冠心病者600萬，雙目失明45萬，尿毒癥者50萬。糖尿病是一種復合病因的綜合病癥，是由于體內胰島素缺乏或拮抗胰島素的激素增加，或胰島素在靶細胞內不能發揮正常生理作用而引起的葡萄糖、蛋白質及脂質代謝紊亂的一種綜合病癥/其特征為血循環中葡萄糖濃度異常升高及悄糖、血糖過高時出現典型的“三多一少”癥狀，即多吃、多尿、多食及體重減輕，且伴有疲乏無力。嚴重者可發生酮癥酸中毒、高滲性糖尿病昏迷，且易合并多種感染。隨著病程的延長，其代謝紊亂可導致眼、腎、神經、血管及心臟等組織器官的慢性病變。若得不到及時、恰當的治療，則發生心臟病變，腦血管病變，腎功能衰竭，雙目失明、下肢壞死等情況，成為致殘、致死的主要原因。二甲雙胍是臨床常用的治療糖尿病的雙胍類藥物，適用于單用飲食和運動治不能獲良好控制的2型糖尿病患者。可單獨用藥，也可與磺脲類或胰島素合用。用于治療肥胖型的糖尿病效果很好，因些臨床應用廣泛，二甲雙胍常見的不良反應為胃腸道不適，如惡心、嘔吐、腹瀉、腹痛、便秘、腹脹、消化不良、胃灼熱，這種不良反應高達30%，此不良反應限制了二甲雙胍的使用。技術實現要素：為了解決二甲雙胍胃腸道副作用大限制使用人群的技術問題，本發明提供了一種二甲雙胍與益生菌，益生元的組合物，通過與益生菌的配伍，減少二甲雙胍的用量，增強防治糖尿病并控制體重的效果，來減輕二甲雙肌的不良反應，從而實現減毒增效的目的。本發明中的各種益生菌是從500多種有益微生物中篩選出5種能夠可共生共存，互相促進；有明顯控制體重與治療糖尿病的效果；并且與二甲雙胍聯合使用，大大減少了二甲雙胍導致的腸胃不適反應。為了達到上述目的，本發明提供一種防治糖尿病并控制體重的復合益生菌制劑，其特征在于：所述復合益生菌組份及重量份數配比為：10億CFU/g丁酸梭菌10-20份、10億CFU/g布拉氏酵母菌10-40份、50億CFU/g羅伊氏乳桿菌5-15份、10億CFU/g嬰兒雙歧桿菌10-20份、100億CFU/g地衣芽孢桿菌10-20份、二甲雙胍8-12份、阿拉伯糖10-20份、低聚木糖5-15份，可溶性淀粉10-20份；其制備過程包括：在無菌攪拌罐中依次加入10億CFU/g丁酸梭菌10-20份、10億CFU/g布拉氏酵母菌10-40份、50億CFU/g羅伊氏乳桿菌5-15份、10億CFU/g嬰兒雙歧桿菌10-20份、100億CFU/g地衣芽孢桿菌10-20份、可溶性淀粉10-20份攪勻30分鐘；然后再加入二甲雙胍8-12份、阿拉伯糖10-20份、低聚木糖5-15份繼續攪拌，直到完全混勻后，即可分裝5g/袋；即為防治糖尿病并控制體重的復合益生菌制劑。其中，布拉氏酵母、羅伊氏乳桿菌、丁酸梭菌、地衣芽孢桿菌、嬰兒雙歧桿菌以下方法培養：布拉氏酵母的制備取出菌種保藏管，用YPD固體培養基劃平板進行復蘇，30℃培養48小時。在平板下挑取單個菌落接種150毫升YPD培養基中，在培養箱中30℃震蕩培養24小時。種子采用5%的接種量，接種至裝有350L酵母菌培養基的500L發酵罐中，控溫30℃，開攪拌200r/min,前10小時，通氣量為每分鐘100L，10小進后，通氣量為每分鐘300L，培養20-28小時，檢測其菌液濃度，菌含量超過20億CFU/ml，即可加入脫脂奶粉，真空冷凍干燥，調節布拉氏酵母菌含量為10億CFU/g，即可。其中所述的YPD培養基：酵母膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水1000mL。其中所述的酵母菌培養基：紅糖15g/L，酵母膏3g/L，蛋白胨5g/L，硫酸銨3g/L，硫酸鎂0.5g/L。各培養基滅菌的條件為：0.10-0.15MPa，121℃滅菌30分鐘。羅伊氏乳桿菌的制備取出菌種保藏管，用MRS固體培養基劃平板進行復蘇，37℃厭氧培養48小時。在平板下挑取單個菌落接種250毫升MRS培養基中，在培養箱中37℃厭氧培養24小時。種子采用5%的接種量，接種至裝有450L乳酸菌培養基的500L發酵罐中，37℃厭氧培養20-28小時，檢測其菌液濃度，菌含量超過100億CFU/ml，即可加入脫脂奶粉，真空冷凍干燥，調節羅伊氏乳桿菌含量為50億CFU/g，即可。其中所述的MRS固體培養基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，牛肉膏10g/L，葡萄糖20g/L，醋酸鈉5g/L，檸檬酸二銨2g/L，吐溫-801ml/L，硫酸鎂0.6g/L，硫酸錳0.05g/L，磷酸氫二鉀2g/L，瓊脂20g/L，碳酸鈣20g/L，固體培養基中加入瓊脂2%；其中所述的乳酸菌培養基：葡萄糖4%，蛋白胨1.2%，牛肉膏0.75%，氯化鈉0.1%，硫酸錳0.001%，硫酸鎂0.02%，醋酸鈉0.05%，碳酸鈣1%，pH6.0。各培養基滅菌的條件為：0.10-0.15MPa，121℃滅菌30分鐘。地衣芽孢桿菌的制備取出菌種保藏管，用LB固體培養基劃平板進行復蘇，37℃培養48小時。在平板下挑取單個菌落接種500毫升LB培養基中，在培養箱中37℃震蕩培養24小時。種子采用5%的接種量，接種至裝有350L地衣芽孢桿菌液體培養基的500L發酵罐中，控溫37℃，開攪拌200r/min,前10小時，通氣量為每分鐘200L，10小進后，通氣量為每分鐘400L，培養32-48小時，檢測其菌液濃度，芽孢含量超過120億CFU/ml，即可加入碳酸鈣粉，噴霧干燥，調節地衣芽孢桿菌含量為100億CFU/g，即可。其中所述LB固體培養基：蛋白胨5g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，瓊脂20g，水1000mL，pH7.2，其中所述地衣芽孢桿菌液體培養基：葡萄糖10g/L，玉米淀粉10g/L，豆粕粉30g/L，硫酸鎂0.5g/L，硫酸錳0.5g/L，磷酸二氫鈉0.5g/L，氯化鈉2g/L，pH7.2。各培養基滅菌的條件為：0.10-0.15MPa，121℃滅菌30分鐘。嬰兒雙歧桿菌的制備取出菌種保藏管，用雙歧桿菌固體培養基劃平板進行復蘇，37℃厭氧培養72小時。在平板下挑取單個菌落接種500毫升雙歧桿菌培養基中，在培養箱中37℃厭氧培養48小時。種子采用5%的接種量，接種至裝有450L雙歧桿菌培養基的500L發酵罐中，37℃厭氧培養40-48小時，檢測其菌液濃度，菌含量超過20億CFU/ml，即可加入脫脂奶粉，真空冷凍干燥，調節雙歧桿菌菌體含量為10億CFU/g，即可。其中所述的雙歧桿菌培養基：蛋白胨5.0g/L，酵母提取物5g/L，牛肉膏5.0g/L，胰蛋白胨10.0g/L，葡萄糖10.0g/L，醋酸鈉5.0g/L，檸檬酸二銨2.0g/L，吐溫-801.0ml/L，硫酸鎂0.1g/L，硫酸鋅0.25g/L，磷酸氫二鉀2g/L，固體培養基中加入瓊脂2%。培養基滅菌的條件為：0.10-0.15MPa，121℃滅菌30分鐘。丁酸梭菌的制備取-80℃甘油管保藏的菌種1mL接種于裝有999mLRCM培養基的厭氧瓶中，37℃條件下靜態厭氧活化64h。將活化好的菌種按1%(v/v)的接種量轉接到滅過菌的99L丁酸梭菌發酵培養基中。37℃條件下靜態厭氧培養64h~126h，芽孢含量超過15億CFU/ml，即可加入脫脂奶粉，真空冷凍干燥，調節丁酸梭菌芽孢含量10億CFU/g，即可。其中，所述的RCM培養基：胰蛋白陳10g/L，牛肉膏10g，酵母膏10g/L，葡萄糖5g/L，氯化鈉5g/L，可溶性淀粉1g/L，半胱氨酸鹽酸鹽0.5g/L，醋酸鈉3g/L，pH7.0，121℃滅菌20min，其中，所述的丁酸梭菌發酵培養基：:酵母膏15g/L，牛肉膏5g/L，KH2PO42g/L硫酸鎂1g/L，半胱氨酸鹽酸鹽1g/L，NaHCO31g/L，CaCO31g/L，葡萄糖20g/L，PH7.0，121℃滅菌20min。從病理學上來講，對付糖尿病有三個基本策略(益生菌在其中都發揮著重要作用)：(1)通過控制食物或服用藥物減少腸道中葡萄糖的吸收量；(2)減少肝里葡萄糖的合成；3)促進代謝過程對葡萄糖的使用。葡萄糖在第一和第三個策略中都十分有用，而在第二個策略中的作用卻不大，所以我們在這里就不討論這一點了。第一個治療策略一一減少胃腸道對葡萄糖的吸收——可以通過含益生菌或益生元的食品來抑制葡萄糖的吸收。葡萄糖在腸道里可以以不同形式存在。正如前面提到的，葡萄糖可以和其他糖類結合，形成更復雜的種類。然后它們將被身體分解，釋放出葡萄糖，使其能被吸收。例如，身體要把蔗糖分解成最基本的組成部分——葡萄糖和果糖，然后再吸收它們，那么腸道里就一定要有蔗糖。事實上，身體里的各個組成部分都喜歡葡萄糖。它是最基本的能量來源，任何身體組織都能輕易地對其加以利用。所以，身體組織的代謝系統都把葡萄糖作為主要的能量來源。既然如此，腸道里的益生菌是怎樣幫助治療糖尿病和控制體重的呢?假設你攝入了很多糖(為了簡單起見，假設這些糖是葡萄糖，但是對其他糖類來說，原理也是一樣的)。如果你吃下了純葡萄糖，會發生什么呢?不是發生糖尿病昏迷，就是葡萄糖被全部吸收。為了達到這個目的，葡萄糖必須先進入腸道，通過腸道上皮細胞中的任何東西(如果有的話)。在健康的胃里，益生菌包圍著這些上皮細胞(或者說層疊其上)；而在一個不健康的胃里，只有一堆病原細菌。葡萄糖被這些腸道上皮細胞吸收，然后進入身體其他部分(當然，這是建立在假設所有的葡萄糖都能被上皮細胞利用的基礎上)。總而言之，胃腸道內的益生菌提供了第一個防護層，以免大量葡萄糖被吸收。這就是說，如果你補充大量益生菌，那么已經加強了這第一個防護層，因為益生菌喜歡利用葡萄糖。那么，葡萄糖是益生元嗎?不是。根據定義，益生元是含有某些益生菌而非大腸桿菌等病原有機體的食物。這也不會改變益生菌需要葡萄糖的事實。如果周圍有大量葡萄糖的話，它們甚至都不碰其他的糖類。原因很簡單，因為吞食葡萄糖對益生菌來說毫不費力。所有生物都認同成本/收益率。越容易做的事情，生命體就越有可能去做。益生菌體內有可以利用葡萄糖的組織，所以它們會吸收葡萄糖，然后吃掉它。現在，回到我們攝取糖的例子：如果體內有大量益生菌存在，而且它們都在積極消耗有害菌，那么在體內輸送的葡萄糖就會減少。直接結果就是血液里的葡萄糖減少。如果血液里葡萄糖含量減少，被肝用來制造肝糖(或進行其他活動)的葡萄糖就減少了，而身體就是通過把葡萄糖轉化成肝糖來對其進行儲存的。最后，如果制造的肝糖減少了，一段時間之后，身體能夠轉化為葡萄糖的肝糖就減少了。記住，只需要提供大量益生菌，就能讓這些變化發生。而且，所有這些利益都能通過益生菌來獲得，那我們為什么還要冒險呢?這又把我們帶回到控制體重和糖尿病的關系這個主題上來了。葡萄糖是一種非常好的能量來源，隨時貢獻自我以便生成其他物質。如果體內以葡萄糖形式存在的能量過多，超過了可以使用的量，那么身體會怎么做呢?它會以脂肪的形式儲存起來，而那些肥肉很可能會陪伴你一生。公式很簡單：過多能量(即葡萄糖)=體重上升。如果你攝入的卡路里比消耗的要多，你的體重就會上升。在前面，我們談到有三種主要的策略可以用來治療糖尿病，第三種就是加速葡萄糖的代謝。有幾種方法可以使你體內的細胞更多地使用葡萄糖，食用益生菌是最有效的手段之一；它能夠很大限度地影響腸道里的活動。事實上，發生在腸道里的活動比發生在身體里的活動更加重要。為了證明這一點，可以把你的腸和它外部的身體想象成是相對的。科學家們就是這么干的。他們認為腸道是一個中空的管道，從口腔到肛門，身體就包裹在其外。"管道"是個很形象的比喻，因為通過腸道的任何東西都不直接和身體產生聯系。換句話說，你咽下的一切東西從管道的一頭進去，又從另一頭出來——在此期間一直停留在管道里。不僅食物如此，益生菌也一樣。它們在腸道自成一體的環境中運行良好。正如前面提到的，人體內的細菌數量比細胞還多。這也就意味著，益生菌這種有益細菌能在整個代謝過程中起很大作用。如果在進餐時補充大量益生菌，它們對食物的消耗將遠遠超過你的身體對食物的利用。你吞下的食物很少會被真正吸收。本發明的復合益生菌制劑中含有大量的地衣芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌是具有耐酸、耐熱特性的有益菌,在胃酸下四小時存活率為100%,同時具有強力的病原菌抑制能力，是各種益菌當中，對環境耐受力最好可以直達小腸的菌種之一，口服后可改變人體腸道菌群生態，幫助消化道機能正常化，以使排便順暢，維持體內生理環保。能調節腸道菌群，增強動物細胞免疫放應。地衣芽孢桿菌為兼性厭氧菌，在腸道中可以起到整腸作用，能有效防治腹瀉，便秘，可以快速吸收利用腸道中的葡萄糖，從而減少腸道對葡萄糖的吸收，降低血糖。本發明的復合益生菌制劑中含有大量的活性的羅伊氏乳桿菌與嬰兒雙歧桿菌，乳桿菌與雙歧桿菌能促進蛋白質、單糖及鈣、鎂等營養物質的吸收，產生維生素B族等大量有益物質；使腸道菌群的構成發生有益變化，改善人體胃腸道功能，恢復人體腸道內菌群平衡，形成抗菌生物屏障，維護人體健康；抑制腐敗菌的繁殖，消解腐敗菌產生的毒素，清除腸道垃圾；抑制膽固醇吸收，降血脂、降血壓作用；可提高SOD酶活力，消除人體自由基，具抗衰老、延年益壽作用；有效預防女性泌尿生殖系統細菌感染；控制人體內毒素水平，保護肝臟并增強肝臟的解毒、排毒功能。乳桿菌與雙歧桿菌可治療腹瀉。通過用乳桿菌與雙歧桿菌對腹瀉患者臨床觀察研究表明，在服藥兩周以后，患者大便次數、形狀異常，臨床癥狀消失，對總有效率為90.3%，復發率低。許多國內醫院已將乳桿菌與雙歧桿菌制劑作為治療腹瀉的首選藥物。抗生素相關性腸炎實際上是抗生素的使用，使原來過路菌或外籍菌（如腸桿菌）成為優勢種群，它們大量增殖或分泌相關毒素與腸粘膜上皮細胞受體結合后使CAMP酶活性升高，大量水鹽電解質丟失，而造成腹瀉癥狀。增殖乳桿菌與雙歧桿菌，扶植了腸道中的原籍菌，使機體定植抗力升高，有利于拮抗致病菌和條件致病菌的定植。乳桿菌與雙歧桿菌可治療因大量使用抗生素而導致的偽膜性腸炎。有人采用乳桿菌與雙歧桿菌制劑治療偽膜性腸炎380例，臨床總治愈率無明顯差異，但臨床副作用和復發率均明顯降低。雙歧桿菌可以治療便秘。便秘是指排便次數減少或糞便干燥難解（一般兩天以上無排便）而言，根據病因其大致上可分為器質性便秘和功能性便秘兩大類。乳桿菌與雙歧桿菌主要用于功能性便秘這一類癥狀。引起功能性便秘一般來說與腸道菌失調密切相關，多半互為因果。成其是腸道外籍菌（或過路菌）等腐敗菌增加，其產生相應有毒代謝產物如胺、酚、吲哚類等物質。通過調整腸道正常菌群，恢復腸道正常菌群平衡，使腐敗菌數量大大減少，而其有毒代謝產物吸收減少，從而使便秘癥狀得以緩解。尤其補充雙歧桿菌等原籍菌，其產生乙酸和乳酸pH值為2.8~3.1,使腸道呈酸性，其結果能控制由有害菌引起的異常發酵，并且刺激腸蠕動，從而減少水分的過度吸收而緩解便秘癥狀，還可以復活機體免疫功能，有利于調整內分泌—免疫功能恢復，恢復腸道蠕動功能從而緩解便秘等癥狀。本發明的復合益生菌制劑中含有布拉氏酵母菌，布拉氏酵母菌是一種非致病性，目前為止唯一在臨床使用的真菌類微生態制劑,其具有獨特的藥理作用,通過抑制致病微生物的生長繁殖，減少致病微生物對粘膜上皮細胞的粘附和侵襲，釋放短肽蛋白中和、鈍化和降解細菌毒素，從而發揮抗致病微生物的作用，另一方面，在腸道內布拉氏酵母菌通過代謝釋放多胺類物質(亞精胺和精胺)發揮許多生理功能，如提高小腸絨毛膜二糖酶水平，提高堿性磷酸酶，刺激腸道釋放分泌型IgA，提高腸道局部抗感染能力，尤其最近研究發現，布拉氏酵母菌通過抑制炎癥信號途徑中NF-κB的易位而抑制炎癥信號途徑，發揮抗炎癥作用。以上研究表明使用布拉氏酵母菌可加快病情恢復，縮短住院時間。對于小兒腹瀉的治療和預防都有很顯著的作用，并且具有較好的療效及安全性。本發明中的復合益生菌制劑中含量有丁酸梭菌，丁酸梭菌能促進有益的雙歧桿菌、乳酸菌、擬桿菌的增殖和有效的抑制引起疾病的葡萄球菌、念珠菌、克雷伯菌、彎曲桿菌、綠膿桿菌、大腸桿菌、痢疾桿菌和傷寒沙門菌以及腐敗菌的繁殖，從而減少了胺類、吲哚類和硫化氫等有害物質。丁酸梭菌的主要代謝產物為丁酸，而丁酸是腸道上皮組織細胞的再生和修復的主要營養物質。因此，對腸道上皮組織的再生和修復有很重要的意義。用丁酸梭菌或與雙歧桿菌、益生元等合用，對于因菌群失調而引起的急慢性腹瀉、腸易激綜合癥、抗生素相關性腸炎、便秘等癥狀有良好的療效，對于腸炎、肝硬化和放療、化療造成的免疫功能下降也能起到輔助的治療作用。不少資料還說明，該菌還能促進維生素E的吸收，降解膽酸和提高抗氧能力。本發明中含有二甲雙胍，二甲雙胍的降糖機制和磺脲類不同，它不通過刺激胰島素分泌，其降糖作用主要是增加周圍組織糖的無氧酵解，增加糖的利用，這一作用的主要部位在小腸，動物試驗證實本品可增加小腸的無氧酵解，使空腸對糖的利用增加20％。②抑制肝糖元異生，由于減少糖元異生引起繼發基礎血糖減低而降低基礎肝糖輸出。③通過增加胰島素與胰島素受體的結合，增加胰島素對血糖的清除作用，由于胰島素抵抗是NIDDM的特點，二甲雙胍通過增加胰島素受體數量減少者的受體結合點和增加低親和性的結合點的數量從而改善NIDDM病人對胰島素的敏感性。動物試驗證明二甲雙胍還有受體后作用，使胰島素刺激的糖元生成增加，胰島素受體磷酸化作用增加和使酪氨酸激酶活性增加。本發明的有益效果在于：本發明將丁酸梭菌，布拉氏酵母菌，羅伊氏乳桿菌，嬰兒雙歧桿菌，地衣芽孢桿菌等有益菌；以及阿拉伯糖，低聚木糖等益生元與二甲雙肌結合起來，以避免二甲雙胍而引起的惡心、嘔吐、腹瀉、腹痛、便秘、腹脹、消化不良、胃灼熱、腸易激綜合癥等癥狀有良好的療效，對于腸炎、肝硬化和放療、化療造成的免疫功能下降也能起到輔助的治療作用，并通過直接吸收利用葡萄糖，加速葡萄糖代謝，提高對控制體重與糖尿病的治療效果。本發明中的各種益生菌是從500多種有益微生物中篩選出5種能夠可共生共存，互相促進；有明顯控制體重與治療糖尿病的效果；并且與二甲雙胍聯合使用，大大減少了二甲雙胍導致的腸胃不適反應。臨床試驗結果表明：口服本發明的復合益生菌制劑的患者，初步判定在血糖達標時間、改善糖耐量、改善胰島素及c膚釋放方面要優于單純應用基二甲雙胍者。另外，本發明的復合益生菌制劑在改善二甲雙胍藥物胃腸道不良反應方面比單純應用二甲雙肌者效果顯著。說明本發明的復合益生菌制劑在改善胰島素抵抗、保護胰島細胞功能方面確有療效，并且無副作用。實施例1一種防治糖尿病并控制體重的復合益生菌制劑，其特征在于：所述復合益生菌組份及重量份數配比為：10億CFU/g丁酸梭菌15份、10億CFU/g布拉氏酵母菌20份、50億CFU/g羅伊氏乳桿菌10份、10億CFU/g嬰兒雙歧桿菌15份、100億CFU/g地衣芽孢桿菌15份、二甲雙胍10份、阿拉伯糖15份、低聚木糖10份，可溶性淀粉15份；其制備過程包括：在無菌攪拌罐中依次加入10億CFU/g丁酸梭菌15份、10億CFU/g布拉氏酵母菌20份、50億CFU/g羅伊氏乳桿菌10份、10億CFU/g嬰兒雙歧桿菌15份、100億CFU/g地衣芽孢桿菌15份、可溶性淀粉15份攪勻30分鐘；然后再加入二甲雙胍10份、阿拉伯糖15份、低聚木糖10份繼續攪拌，直到完全混勻后，即可分裝5g/袋；即為防治糖尿病并控制體重的復合益生菌制劑。其中，所述的布拉氏酵母、羅伊氏乳桿菌、丁酸梭菌、地衣芽孢桿菌、嬰兒雙歧桿菌按以下方法培養：布拉氏酵母的制備取出菌種保藏管，用YPD固體培養基劃平板進行復蘇，30℃培養48小時，在平板下挑取單個菌落接種150毫升YPD培養基中，在培養箱中30℃震蕩培養24小時，種子采用5%的接種量，接種至裝有350L酵母菌培養基的500L發酵罐中，控溫30℃，開攪拌200r/min,前10小時，通氣量為每分鐘100L，10小進后，通氣量為每分鐘300L，培養20-28小時，檢測其菌液濃度，菌含量超過20億CFU/ml，即可加入脫脂奶粉，真空冷凍干燥，調節布拉氏酵母菌含量為10億CFU/g，即可；其中所述的YPD培養基：酵母膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水1000mL。其中所述的酵母菌培養基：紅糖15g/L，酵母膏3g/L，蛋白胨5g/L，硫酸銨3g/L，硫酸鎂0.5g/L，各培養基滅菌的條件為：0.10-0.15MPa，121℃滅菌30分鐘；羅伊氏乳桿菌的制備取出菌種保藏管，用MRS固體培養基劃平板進行復蘇，37℃厭氧培養48小時，在平板下挑取單個菌落接種250毫升MRS培養基中，在培養箱中37℃厭氧培養24小時，種子采用5%的接種量，接種至裝有450L乳酸菌培養基的500L發酵罐中，37℃厭氧培養20-28小時，檢測其菌液濃度，菌含量超過100億CFU/ml，即可加入脫脂奶粉，真空冷凍干燥，調節羅伊氏乳桿菌含量為50億CFU/g，即可；其中所述的MRS固體培養基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，牛肉膏10g/L，葡萄糖20g/L，醋酸鈉5g/L，檸檬酸二銨2g/L，吐溫-801ml/L，硫酸鎂0.6g/L，硫酸錳0.05g/L，磷酸氫二鉀2g/L，瓊脂20g/L，碳酸鈣20g/L；其中所述的乳酸菌培養基：葡萄糖4%，蛋白胨1.2%，牛肉膏0.75%，氯化鈉0.1%，硫酸錳0.001%，硫酸鎂0.02%，醋酸鈉0.05%，碳酸鈣1%，pH6.0。各培養基滅菌的條件為：0.10-0.15MPa，121℃滅菌30分鐘。地衣芽孢桿菌的制備取出菌種保藏管，用LB固體培養基劃平板進行復蘇，37℃培養48小時，在平板下挑取單個菌落接種500毫升LB培養基中，在培養箱中37℃震蕩培養24小時。種子采用5%的接種量，接種至裝有350L地衣芽孢桿菌液體培養基的500L發酵罐中，控溫37℃，開攪拌200r/min,前10小時，通氣量為每分鐘200L，10小進后，通氣量為每分鐘400L，培養32-48小時，檢測其菌液濃度，芽孢含量超過120億CFU/ml，即可加入碳酸鈣粉，噴霧干燥，調節地衣芽孢桿菌含量為100億CFU/g，即可，其中所述LB固體培養基：蛋白胨5g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，瓊脂20g，水1000mL，pH7.2，其中所述地衣芽孢桿菌液體培養基：葡萄糖10g/L，玉米淀粉10g/L，豆粕粉30g/L，硫酸鎂0.5g/L，硫酸錳0.5g/L，磷酸二氫鈉0.5g/L，氯化鈉2g/L，pH7.2，各培養基滅菌的條件為：0.10-0.15MPa，121℃滅菌30分鐘；嬰兒雙歧桿菌的制備取出菌種保藏管，用雙歧桿菌固體培養基劃平板進行復蘇，37℃厭氧培養72小時，在平板下挑取單個菌落接種500毫升雙歧桿菌培養基中，在培養箱中37℃厭氧培養48小時，種子采用5%的接種量，接種至裝有450L雙歧桿菌培養基的500L發酵罐中，37℃厭氧培養40-48小時，檢測其菌液濃度，菌含量超過20億CFU/ml，即可加入脫脂奶粉，真空冷凍干燥，調節雙歧桿菌菌體含量為10億CFU/g，即可。其中所述的雙歧桿菌培養基：蛋白胨5.0g/L，酵母提取物5g/L，牛肉膏5.0g/L，胰蛋白胨10.0g/L，葡萄糖10.0g/L，醋酸鈉5.0g/L，檸檬酸二銨2.0g/L，吐溫-801.0ml/L，硫酸鎂0.1g/L，硫酸鋅0.25g/L，磷酸氫二鉀2g/L，固體培養基中加入瓊脂2%；培養基滅菌的條件為：0.10-0.15MPa，121℃滅菌30分鐘。丁酸梭菌的制備取-80℃甘油管保藏的菌種1mL接種于裝有999mLRCM培養基的厭氧瓶中，37℃條件下靜態厭氧活化64h，將活化好的菌種按1%(v/v)的接種量轉接到滅過菌的99L丁酸梭菌發酵培養基中，37℃條件下靜態厭氧培養64h~126h，芽孢含量超過15億CFU/ml，即可加入脫脂奶粉，真空冷凍干燥，調節丁酸梭菌芽孢含量10億CFU/g，即可；其中，所述的RCM培養基：胰蛋白陳10g/L，牛肉膏10g，酵母膏10g/L，葡萄糖5g/L，氯化鈉5g/L，可溶性淀粉1g/L，半胱氨酸鹽酸鹽0.5g/L，醋酸鈉3g/L，pH7.0，121℃滅菌20min；其中，所述的丁酸梭菌發酵培養基：:酵母膏15g/L，牛肉膏5g/L，KH2PO42g/L硫酸鎂1g/L，半胱氨酸鹽酸鹽1g/L，NaHCO31g/L，CaCO31g/L，葡萄糖20g/L，PH7.0，121℃滅菌20min。實施例2在120例2型肥胖型糖尿病患者進行試驗，均符合WHO診斷標準，且符合以下條件：初次確診或確診不超過半年未治療且空腹血糖≥11.1mmol/L；無嚴重急慢性并發癥。治療方法將符合條件的120例患者按肥胖程度與糖尿病嚴重程度分為兩組。對照組：在對患者進行糖尿病健康知識教育和飲食治療的基礎上聯合應用二甲雙胍，二甲雙胍每次0.5g，每日2次。試驗組：在對患者進行糖尿病健康知識教育和飲食治療的基礎上聯合應用復合益生菌制劑，每次一包，每日2包。兩組患者在性別，年齡、體重指數、糖化血紅蛋白，空腹血糖、大致發病時間分布上差異無統計學意義。觀察指標安全性指標：如血常規，大便常規，肝功能、腎功能檢查、心電圖等；療效性指標：治療前后體重指數，血糖達標時間；實驗室檢查：治療后糖化血紅蛋白，糖耐量實驗、胰島素及C肽釋放試驗。胃腸道不良反應指標：如惡心、嘔吐、腹脹、腹痛等。2結果只經過一個月的試驗，試驗組對減輕肥胖程度有明顯的效果，體重指數治療前后變化見表1；后來在試驗組的基礎上，繼續服用本發明的復合益生菌制劑一天一次，總共三個月后，試驗組有14人BMI達到正常指標（小于24），偏胖（BMI24-27.9）人數為29人，肥胖（BMI27.9-29）10人，肥胖（BMI29-30）6人，重度肥胖（BMI30-35）1人表1體重指數變化肥胖程度BMI對照組治療前對照組治療后試驗組治療前試驗組治療后偏胖24-27.91415141827.9-292424232529-3016151713重度肥胖30-356664血糖達標時間試驗組明顯少于對照組，見表2表2血糖達標時間治療后的實驗室檢查結果糖化血紅蛋白試驗組顯著低于對照組。.糖耐量試驗：餐后3小時兩組無顯著差異，余時間試驗組比對照組明顯降低。C肽釋放試驗：試驗組較對照組在空腹及餐后1小時釋放明顯增多，餐后2小時，3小時也差異明顯。胰島素釋放試驗：試驗組1小時較對照組胰島素釋放明顯增多，見表3-6。表3兩組患者治療前后HbAlc(%)結果比較組別治療前治療后試驗組9.7±2.25.4±1.1對照組9.6±2.36.6±1.6表4兩組患者治療前后糖耐量試驗（mmol/L）結果表5兩組患者治療前后C肽釋放試驗（ng/ml）結果表6兩組患者治療前后胰島素釋放試驗結果（Uu/ml）安全性觀察結果本發明中的試驗組受試者于治療前后分別進行安全性指標檢測，結果未發現明顯異常改變，說明本發明的復合益生菌制劑使用安全，無明顯不良反應。胃腸道不良反應結果見表7表7胃腸道不良反應結果組別胃腸道反應人數試驗組0對照組24曲型病例：毛某：男，55歲，患糖尿病12年，打胰島素4年，肥胖BMI系數為30.12，未服用本發明的復合微生物制劑前，控制飲食，體質虛弱，最高血糖18.6mmol/L、甘油三脂7.8mmol/L、總膽固醇9.6mmol/L。服用本發明復合微生物制劑5克/次，一天兩次，15天后，即停止打胰島素，30天后，改為一天服用本發明復合微生物制劑一天一次，每次半包2.5克，兩個月后，檢查，血糖5.6mmol/L、甘油三脂2.2mmol/L、總膽固醇4.4mmol/L、BMI系為28.2，體質全面恢復正常。賀某：男，65歲，患糖尿病15年，打胰島素11年，肥胖BMI系數為29.82，未服用本發明的復合微生物制劑前，控制飲食，最高血糖17.6mmol/L、甘油三脂7.6mmol/L、總膽固醇9.4mmol/L。服用本發明復合微生物制劑5克/次，一天兩次，15天后，即停止打胰島素，30天后，改為一天服用本發明復合微生物制劑一天一次，每次半包2.5克，45天后，檢查，血糖5.8mmol/L、甘油三脂2.4mmol/L、總膽固醇4.6mmol/L、BMI系為28.4，體質全面恢復正常。當前第1頁1 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