一種響應面法優化提取卡西卡甫棗總黃酮的方法與流程

本發明涉及一種響應面法優化提取卡西卡甫棗總黃酮的方法。

背景技術：

卡西卡甫棗又名酸棗、小紅棗，為鼠李科植物酸棗Ziziphus jujuba Mill. var.spinosa (Bunge)Hu ex.H.F.Chow的干燥成熟果實。具有清血排毒，清熱消炎，止咳化痰，補身安神，除疹止癢等功效。用于熱性或血液質性或膽液質性各種病證，如血熱腐敗、濃液成塊，發熱發燒、肺炎、胸膜炎，乃孜來性感冒、咳嗽頑痰，體虛失眠，皮疹瘙癢等。

黃酮的功效是多方面的，它是一種很強的抗氧劑，可有效清除體內的氧自由基，如花青素、花色素可以抑制油脂性過氧化物的全階段溢出，這種阻止氧化的能力是維生素E的十倍以上，這種抗氧化作用可以阻止細胞的退化、衰老，也可阻止癌癥的發生。藥理研究表明，棗類黃酮具有明顯的止咳、祛痰、行血、止血、通經活絡之功效，同時具有明顯的抗補體活性和促進淋巴細胞增殖的作用，它能有效增強機體免疫力。棗肉黃酮能增強小鼠體液免疫和細胞免疫功能，并對放射性損傷有一定的保護作用，是免疫增強劑。研究證實，卡西卡甫棗的黃酮類成分具有抗癌的生理活性，其藥用價值備受關注。但是目前的提取方法得到的卡西卡甫棗總黃酮的純度普遍偏低，一直制約著卡西卡甫棗總黃酮藥理和質量控制的研究。因此如何從卡西卡甫棗內提取獲得純度含量高的卡西卡甫棗總黃酮變得尤為重要。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種響應面法優化提取卡西卡甫棗總黃酮的方法。

為了解決上述技術問題，本發明提供了如下的技術方案：

一種響應面法優化提取卡西卡甫棗總黃酮的方法，包括如下步驟：

（1）卡西卡甫棗去核、干燥、粉碎，得到卡西卡甫棗粉末；

（2）卡西卡甫棗粉末用乙醇提取，提取液濃縮干燥，測定干浸膏的總黃酮含量；

（3）選擇提取時間、提取溫度和液料比三個因素對步驟（2）進行單因素實驗，確定提取時間、提取溫度和液料比的最優水平，在最優水平兩側對稱選2個水平，根據Box-Benhnken設計原則進行三因素三水平實驗設計，以提取時間、提取溫度和液料比為自變量，以總黃酮含量為響應值，建立總黃酮含量的多元二次方程；

（4）對步驟（3）建立的多元二次方程進行響應面分析，取總黃酮含量為最大值，得出最優的提取條件。

進一步，在步驟（3）中，

以提取時間A、提取溫度B、液料比C為自變量，以總黃酮含量Y為響應值，建立的多元二次方程為：

Y=1.37+0.074A+0.090B+0.035C+8.486E-003AB-0.027AC-2.546E-003BC-0.11A²-0.14B²-0.048C²；

一種提取卡西卡甫棗總黃酮的方法，包括如下步驟：

（1）卡西卡甫棗去核、干燥、粉碎，得到卡西卡甫棗粉末；

（2）卡西卡甫棗粉末用乙醇提取，提取液濃縮干燥，得到卡西卡甫棗總黃酮。

進一步，步驟（2）提取時，料液比為1:10～30，時間為0.5～2.5h，溫度為40～80℃。

進一步，步驟（3）提取時，料液比為1:26，時間為1.7h，溫度為74℃。

本發明針對卡西卡甫棗本身，采用響應面法優化提取工藝，能夠更為有效提取出卡西卡甫棗總黃酮，減少其他非黃酮成分的提取。

附圖說明

附圖用來提供對本發明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與本發明的實施例一起用于解釋本發明，并不構成對本發明的限制。在附圖中：

圖1為提取時間對總黃酮含量的影響曲線；

圖2為提取溫度對總黃酮含量的影響曲線；

圖3為料液比對總黃酮含量的影響曲線；

圖4為提取時間、提取溫度、液料比對總黃酮含量的響應面三維圖。

具體實施方式

以下結合附圖對本發明的優選實施例進行說明，應當理解，此處所描述的優選實施例僅用于說明和解釋本發明，并不用于限定本發明。

（1）卡西卡甫棗去核、干燥、粉碎，得到卡西卡甫棗粉末；

（2）卡西卡甫棗粉末用乙醇提取，提取液濃縮干燥，測定干浸膏的總黃酮含量；

（3）選擇提取時間、提取溫度和液料比三個因素對步驟（2）進行單因素實驗，確定提取時間、提取溫度和液料比的最優水平，在最優水平兩側對稱選2個水平，根據Box-Benhnken設計原則進行三因素三水平實驗設計，以提取時間、提取溫度和液料比為自變量，以總黃酮含量為響應值，建立總黃酮含量的多元二次方程；

（4）對步驟（3）建立的多元二次方程進行響應面分析，取總黃酮含量為最大值，得出最優的提取條件。

總黃酮含量的測定方法：紫外分光光度法，將干浸膏使用無水甲醇溶解，并定容到50ml容量瓶中，吸取提取液1ml，加適量蒸餾水，加入濃度為 5%NaNO₂ 0.5mL，搖勻置6min; 再加入濃度為10%A1(NO₃)₃ 0.5mL，搖勻置 6min；加濃度為 4% NaOH 4mL，用蒸餾水定容至10mL，搖勻15min后測定吸光度，以蘆丁為標準品，根據吸光度（Y）和濃度（X）的回歸方程：y=14.737x-0.0248，R=0.9994計算濃度。總黃酮含量=總黃酮的質量/卡西卡甫棗粉末的質量。

單因素實驗結果

1.1提取時間對總黃酮含量的影響

以提取溫度60℃，液料比1:25(g/ml)，提取時間0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h進行回流提取，考察提取時間對黃酮含量的影響，結果見圖1。

從圖1可以看出，在提取溫度、料液比相同的條件下，隨著提取時間的增加，提取所得卡西卡甫棗總黃酮含量先增加，之后開始逐漸減少至趨于平穩，這是因為提取時間可影響提取溶劑與細胞內的活性物質接觸，提取時間越長，溶劑越能夠充分滲透到細胞內與活性物質接觸溶解，從而提高提取的黃酮含量;而提取時間過長時則會導致細胞內的溫度過高，造成提取物的氧化，另外還有其他物質的更多溶出，從而降低總黃酮的量，故從黃酮含量的角度來看，提取時間選擇1.5h為宜。

1.2提取溫度對總黃酮含量的影響

以提取時間1.5h，液料比1:25(g/ml)，提取溫度40℃、50℃、60℃、70℃、80℃進行回流提取，考察提取溫度對總黃酮含量的影響，結果見圖2。

從圖2可知，在提取時間、料液比相同的條件下，卡西卡甫棗總黃酮的含量隨著溫度的上升而增加，這可能是因為溫度的升高會加快分子的運動，同時溫度升高也能軟化和破壞細胞壁組織從而有利于細胞內的黃酮類化合物的流出，而當溫度超過70℃時，黃酮類化合物的含量下降，這可能是因為溫度過高，造成提取物的氧化分解，另外還有其他物質的更多溶出，從而降低總黃酮的量，因此從黃酮含量的角度來說，考慮選擇提取溫度在70℃較好。

1.3液料比對總黃酮含量的影響

以提取時間1.5h，提取溫度60℃，液料比1:10(g/ml)、1:15(g/ml)、1:20(g/ml)、1:25(g/ml)、1:30(g/ml)進行回流提取，考察料液比對總黃酮含量的影響，結果見圖3。

從圖3可以看出，在提取時間、提取溫度相同的條件下，當料液比為1:25 (g/mL)時，黃酮類化合物的含量最高，當料液比大于1:25(g/mL)時，總黃酮含量反而降低。這可能是因為溶劑量過多時，一些其他類物質也被提取出來，而有效成分的總量變化不大，相比較而言總黃酮含量呈下降趨勢。就黃酮含量的角度而言，選擇料液比為1:25 (g/mL)左右為宜。

響應面法優化設計

根據單因素試驗結果確定的提取時間、提取溫度、液料比最優水平，并在最優水平兩側對稱選2個水平，具體因素水平設置見表1。

表1 因素水平設置表

利用Design-Expert軟件根據Box-Benhnken設計原則進行三因素三水平實驗設計，實驗方案設計與響應值結果見表2。回歸方程方差分析見表3。

表2 響應曲面設計方案以及響應值

以提取時間A、提取溫度B、液料比C為自變量，以總黃酮含量為響應值Y，建立多元二次方程：

Y=1.37+0.074A+0.090B+0.035C+8.486E-003AB-0.027AC-2.546E-003BC-0.11A²-0.14B²-0.048C²。

表3 黃酮含量回歸方程的方差分析

利用 Design-Expert 軟件對多元二次回歸方程進行響應面分析，得到回歸方程的響應面及其等高線圖，見圖4。

總黃酮含量：由表3分析可知，（P<0.0001<P=0.05）二次回歸方程模型顯著，失擬項顯著（P=0.1220>P=0.05）。表明該方程對實驗擬合情況好，可以用該模型代替真實實驗點對不同反應條件下卡西卡甫棗總黃酮含量的實驗進行結果預測和分析。回歸模型方程各項的方差分析結果還表明，方程一次項中A、B、C影響是極顯著的，二次項的影響也都是顯著的，方程的擬合是較充分的，但交互項AB、AC、BC的P值均>0.05，表明提取時間、提取溫度、液料比這三個因素的兩兩交互作用不顯著。通過該模型的方差分析可知：提取溫度（B）對黃酮含量影響差異顯著（P<0.0001），而提取時間（A）、液料比（C）兩個因素對黃酮含量影響差異不顯著。即：提取時間的改變將會顯著影響黃酮含量。三因素對黃酮含量影響效應的大小依次 提取溫度（B）>提取時間（A）>液料比（C）。

最優條件驗證實驗

從響應面實驗分析結果可以看出，回流提取的提取時間和提取溫度是影響卡西卡甫棗總黃酮含量的主要因素，利用 Design-Expert（8.0.6版本）軟件分析，在軟件中選擇總黃酮含量為最大值，由軟件直接分析得出卡西卡甫棗中總黃酮回流提取的最佳工藝條件為：提取時間1.65h，提取溫度73.4℃，液料比1:26.35時，預測總黃酮含量最優值為1.4052mg/g。在上述優化條件下，考慮實際操作的局限性，將工藝參數修正為提取時間1.7h、提取溫度74℃、液料比1:27。在此修正條件下進行了3次平行驗證實驗，卡西卡甫棗總黃酮含量的平均值為1.4030mg/g，相比誤差0.31% ，與理論預測值較接近，結果較理想。

實例1

卡西卡甫棗總黃酮的提取方法，步驟如下：

對卡西卡甫棗進行挑選、清洗、切片、去核、烘干，將烘干后的卡西卡甫棗進行粗粉碎成100目的顆粒，稱取卡西卡甫棗粉末9.9322g，按 1:25(g/mL)料液比加入無水乙醇，置于70℃恒溫水浴鍋中浸提1.5h，離心，取上清液，得到粗提液；使用旋轉蒸發儀將提取液濃縮，并使用真空干燥箱烘干，烘干時間為24h。將干浸膏使用無水甲醇溶解，并定容到50ml容量瓶中，使用NaNO₂-Al(NO₃)₃顯色紫外分光光度法測得卡西卡甫棗總黃酮含量為1.3748mg/g。

實例2

卡西卡甫棗總黃酮的提取方法，步驟如下：

對卡西卡甫棗進行挑選、清洗、切片、去核、烘干，將烘干后的卡西卡甫棗進行粗粉碎成100目的顆粒，稱取卡西卡甫棗粉末10.8135g，按 1:30(g/mL)料液比，加入無水乙醇，置于80℃恒溫水浴鍋中浸提1.5h，離心，取上清液，得到粗提液；使用旋轉蒸發儀將提取液濃縮，并使用真空干燥箱烘干，烘干時間為24h。將干浸膏使用無水甲醇溶解，并定容到50ml容量瓶中，使用NaNO₂-Al(NO₃)₃顯色紫外分光光度法測得卡西卡甫棗總黃酮含量為1.3272mg/g。

實例3

卡西卡甫棗總黃酮的提取方法，步驟如下：

對卡西卡甫棗進行挑選、清洗、切片、去核、烘干，將烘干后的卡西卡甫棗進行粗粉碎成100目的顆粒，稱取卡西卡甫棗粉末10.0696g，按 1:25( g/mL)料液比，加入無水乙醇，置于80℃恒溫水浴鍋中浸提2.0h，離心，取上清液，得到粗提液；使用旋轉蒸發儀將提取液濃縮，并使用真空干燥箱烘干，烘干時間為24h。將干浸膏使用無水甲醇溶解，并定容到50ml容量瓶中，使用NaNO₂-Al(NO₃)₃顯色紫外分光光度法測得卡西卡甫棗總黃酮含量為1.2865mg/g。

最后應說明的是：以上所述僅為本發明的優選實施例而已，并不用于限制本發明，盡管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，對于本領域的技術人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。