一種多肽水凝膠、其制備方法及應用與流程

本發明屬于材料制備領域，涉及一種多肽水凝膠、其制備方法及其在干細胞三維培養的仿生支架材料、促進缺損組織的修復的仿生支架材料、控制生長因子釋放的載體中的應用。

背景技術：

水凝膠是一類具有親水基團，能被水溶脹但不溶于水的具有三維網絡結構的聚合物。它在水中能夠吸收大量的水分顯著溶脹，并在顯著溶脹之后能夠繼續保持其原有結構而不被溶解。它能夠感知外界刺激的微小變化，如溫度、pH值、離子強度、電場、磁場等，并能夠對刺激發生敏感性的響應，常通過體積的溶脹或收縮來實現。水凝膠的這一特點使它在生物醫學領域、生物酶的固定、3D細胞培養等方面有廣泛的應用前景。

制備水凝膠材料主要有兩大類，一類是合成高分子，一類是天然生物材料如多糖和蛋白等。后者具有較好的生物相容性，從而在生物醫藥等領域的應用具有優勢。目前引起研究者廣泛關注的一類生物高分子凝膠是多肽，這種材料生物相容性好，是一種很有前景的生物材料和環境友好材料。

氨基酸的主要折疊方式有四種α螺旋，β鏈，β-折疊片層和無規卷曲。對于大多數多肽，其折疊方式主要是以上四次結構的一種或幾種。目前，用于水凝膠材料制備的主要多肽的折疊方式為β-折疊片層，但是，研究發現β-折疊片層是β-淀粉樣蛋白的主要折疊方式。這種蛋白具有很強的神經毒性作用，而且在阿爾茨海默病的病程進展中發揮著主要作用，因此影響了其應用。

技術實現要素：

本發明的目的在于克服現有技術存在的不足之處而提供了一種多肽水凝膠的制備方法，本發明的多肽水凝膠的制備方法操作簡單、方便，水凝膠成分單純可控，其中使用的多肽的主要折疊方式為α螺旋，而從根本上規避了可能存在的安全問題。

本發明采用的技術方案為：一種多肽水凝膠的制備方法，包括：將多肽溶解在分散介質中，形成多肽溶液，數分鐘后即可形成所述多肽水凝膠；

其中，所述多肽由n個重復的xKEALKEy氨基酸序列構成，其中，n為2～10的整數，x為疏水氨基酸，y為親水氨基酸，K為賴氨酸，E為谷氨酸，A為丙氨酸，L為亮氨酸。

在上述技術方案中，能夠將所述多肽溶解形成多肽溶液的溶劑均可作為分散介質，如水、緩沖溶液等。

作為對上述技術方案的進一步改進，所述多肽水凝膠在溫度為20～40℃，PH為4～8的條件下形成。作為對上述技術方案的更進一步改進，所述多肽水凝膠在溫度為37℃，PH為7的條件下形成。本發明的多肽水凝膠可在較寬的溫度和PH范圍內形成，適用范圍廣。

當多肽溶液的PH不在上述范圍內中時，可按照下述步驟進行多肽水凝膠的制備：

i如果多肽溶液的初始pH小于4，可以通過添加堿性溶液(NaOH、KOH等)，將溶液的pH調節到4-8的范圍內，形成穩定的膠體。(如果添加藥物或一些蛋白因子等需要配合一下步驟：將藥物或者因子，添加進堿性溶液或者多肽溶液，通過高速攪拌或者超聲處理的方式，將藥物或者因子添加進入多肽中。

ii如果多肽溶液的初始pH大于8，可以通過添加酸性溶液(HCl、H₂SO₄或者酸性藥物等)，將溶液的pH調節到4-8的范圍內，形成穩定的膠體。(如果添加藥物或一些蛋白因子等需要配合一下步驟：將藥物或者因子，添加進酸性溶液或者多肽溶液，通過高速攪拌或者超聲處理的方式，將藥物或者因子添加進入多肽中。

作為對上述技術方案的進一步改進，所述多肽在水中的濃度為0.5mg/mL～20mg/mL。當多肽的濃度過高時，膠體的硬度過大，接近人的肌肉組織，影響其使用；而當多肽的濃度過低時，形成的膠體硬度則過低，影響其使用。

作為對上述技術方案的進一步改進，所述分散介質為水。

作為對上述技術方案的進一步改進，所述水中添加有培養基、細胞和生長因子中的至少一種。在水中添加培養基后，制得的多肽水凝膠可用于干細胞的3D培養；在水中添加細胞后，制得的多肽水凝膠可用于損傷組織的修復；在水中添加生長因子后，制得的多肽水凝膠可用于美容燒傷燙傷的修復；

作為對上述技術方案的進一步改進，所述n為3，所述多肽由xKEALKEyxKEALKEyxKEALKEy構成，其中，x為疏水氨基酸，y為親水氨基酸，K為賴氨酸，E為谷氨酸，A為丙氨酸，L為亮氨酸。

作為對上述技術方案的進一步改進，所述x為疏水性氨基酸D、E、H、K、Q、R、S或T，其中，D為天冬氨酸，E為谷氨酸，H為組氨酸，K為賴氨酸，Q為谷氨酰胺，R為精氨酸，S為絲氨酸，T為蘇氨酸；

所述y為親水氨基酸A、F、I、L、M、P、V、W或Y，其中，A為丙氨酸，F為苯丙氨酸，I為異亮氨酸，L為亮氨酸，M為蛋氨酸，P為脯氨酸，V為纈氨酸，W為色氨酸，Y為酪氨酸。

作為對上述技術方案的更進一步改進，所述x為疏水性氨基酸E、H或Q；所述y為親水氨基酸L、V或Y，此時對應的多肽使用安全性更高。

作為對上述技術方案的進一步改進，所述多肽的分子量低于4000。分子量低于4000的多肽分子不具有免疫原性。凡是具有免疫原性的物質其分子量一般在10,000以上，小于10,000者呈弱免疫原性，低于4,000者一般不具有免疫原性。

本發明還提供了所述的多肽水凝膠的制備方法制得的多肽水凝膠。

本發明還提供了所述的多肽水凝膠在干細胞三維培養的仿生支架材料、促進缺損組織的修復的仿生支架材料、控制生長因子釋放的載體中的應用。

本發明的多肽可以水為分散介質，通過自組裝形成多肽水凝膠。多肽水凝膠成分單純可控，安全性高，在完全自組裝前具有可注射性，生物相容性好、可降解、降解產物為人體可吸收的氨基酸，機械強度易于調控，且骨架十分接近細胞外基質中支持細胞生長的蛋白質三維網絡，可廣泛用于藥物緩釋載體、細胞培養支架等諸多生物和醫學領域。

液態多肽材料水凝膠通過注射引入受損組織空腔，在注射部位經充分自組裝后形成多孔支架水凝膠，并可在其上裝上生長因子和其它信號分子，通過傳統的控釋系統和表面工程與自組裝的結合可以形成仿生支架。支架材料可以借助細胞表面的特異性受體向細胞發出信號，通過細胞骨架或各種信號轉導途徑將信號傳導至細胞質乃至細胞核，對細胞存活、形態、功能、代謝、增殖、分化、遷移等基本生命活動具有較大影響。

相對于現有技術，本發明的有益效果為：

本發明的多肽水凝膠的制備方法操作簡單、方便，水凝膠成分單純可控，其中使用的多肽的主要折疊方式為α螺旋，且α-螺旋百分比高達85％以上，而從根本上規避了可能存在的安全問題。

本發明的多肽水凝膠在pH 5.8-7.6的范圍可以保持凝膠狀態，在此pH范圍外為液體。

本發明的多肽水凝膠中不需要添加任何有毒性的化學試劑，膠體僅含有水，多肽(有時會含有極低含量的鈉離子)。本發明的多肽水凝膠具有很好的組織相容性，能快速誘導周圍組織的生長。沒有免疫原性，有生物降解性，產物為氨基酸，可被重新吸收利用，安全性高。

本發明在生物材料、生物化學、細胞分子生物學、納米材料學等領域的最新研究成果指引下，合成具有生物活性的多肽，在一定條件下與水分子原位自組裝成具有生物活性的水凝膠支架，并且由于該體系可注射，能填滿任何形狀的組織間隙，形成促缺損組織再生的仿生活性支架，并可作為載體控制細胞生長因子的釋放，促進組織形成，修復缺損組織。

通過分子自組裝形成的多肽水凝膠更能模擬精細的生物和天然大分子體系，由于可注射納米多肽自組裝水凝膠既可以從分子水平來調控各種反應及結果，又避免了其他如化學或物理交聯的水凝膠對機體存在的潛在危害，是真正意義的仿生材料。其自組裝條件簡單，有生物活性，可以修復各種不規則形狀的組織缺損。此外，與其他類型的多肽水凝膠相比(主要折疊方式為β折疊片)，研究表明，β折疊片具有較強的神經細胞毒性，因此這類材料存在很大的安全風險。本發明的材料的多肽分子的主要折疊方式為α螺旋，因此不存在此類風險。

附圖說明

圖1為實施例1中將干細胞種在水凝膠里面，在放大4和10倍率下獲得的顯微鏡照片；

圖2顯示了實施例1中共聚焦顯微鏡下干細胞的生長情況，其中A為俯視圖，B、C為側視圖；

圖3顯示了實施例3中1mg/mLEGF和10mg/mLEGF在多肽水凝膠中的釋放情況；

圖4顯示了實施例3中第21天時，多肽水凝膠及生理鹽水中的EGF含量；

圖5證實了本發明的多肽為α-螺旋結構；

圖6顯示了本發明的多肽纖維大小在2-3納米。

具體實施方式

為更好的說明本發明的目的、技術方案和優點，下面將結合具體實施例對本發明作進一步說明。

實施例1

首先合成具有生物活性的高純度的多肽(粉末狀，其氨基酸序列為xKEALKEyxKEALKEyxKEALKEy，K為賴氨酸，E為谷氨酸，A為丙氨酸，L為亮氨酸,x為谷氨酸，y為亮氨酸)。

所述多肽可通過以下兩種方法中任意一種合成：

i通過化學方法合成，即使用多肽合成儀，合成特定序列的多肽，經過純化后即可以使用；

ii通過生物生產，即將相關基因導入大腸桿菌或者CHO細胞，來生產具有特定序列的多肽，分離高產細胞株，進行擴大培養，純化后獲得多肽。

將合成的多肽用去離子水配成3mg/mL濃度的溶液，然后再滴加少量alpha-MEM培養基溶液，在37℃、PH為7的條件下，靜置數分鐘后，多肽水凝膠逐漸形成。這樣就獲得了仿生的有生物活性的自組裝多肽水凝膠材料，也是干細胞三維培養的優良仿生支架材料。將干細胞種在制得的多肽水凝膠里面，在放大4和10倍率下獲得的顯微鏡照片如圖1所示，其中第一張為放大4倍的照片，其余三張為放大10倍的照片；圖1顯示出利用本發明的多肽制得的多肽水凝膠可作為干細胞三維培養的優良仿生支架材料。

圖2顯示了共聚焦顯微鏡下干細胞的生長情況，其中A為俯視圖，B、C為側視圖，圖2中大面積的稍亮區域顯示的是活細胞，也即箭頭1指示的地方，箭頭2指示的是死細胞，其中活細胞占干細胞總數的95％；圖2顯示干細胞大小大于其正常大小10微米，說明干細胞在分裂和生長，干細胞可以在多肽水凝膠中生長，因而可作為支架材料促進組織缺損的修復。

實施例2

首先合成具有生物活性的高純度的多肽(粉末狀，其氨基酸序列分別為xKEALKEyxKEALKEyxKEALKEy，K為賴氨酸，E為谷氨酸，A為丙氨酸，L為亮氨酸,x為組氨酸，y為纈氨酸)。其中，多肽的合成方法同實施例1。

將多肽用去離子水配成0.5mg/mL濃度的溶液，用無菌的注射器將混合溶液注入不規則形狀的組織缺損區，在組織液(如血液)的誘導下原位自組裝形成水凝膠，作為支架材料促進組織缺損的修復。

實施例3

首先合成具有生物活性的高純度的多肽(粉末狀，其氨基酸序列分別為xKEALKEyxKEALKEyxKEALKEy，K為賴氨酸，E為谷氨酸，A為丙氨酸，L為亮氨酸,x為谷氨酰胺，y為酪氨酸)。其中，多肽的合成方法同實施例1。

將多肽材料用去離子水配成10mg/mL濃度的溶液，然后再滴加一定量的FITC熒光標記的EGF，使其最終濃度為1～10mg/mL，在37℃、PH為7的條件下，靜置數分鐘后，多肽水凝膠逐漸形成。圖3顯示了1mg/mLEGF和10mg/mLEGF在多肽水凝膠中的釋放情況(其中，位于上方的曲線顯示的是10mg/mLEGF在多肽水凝膠中的釋放情況，位于下方的曲線顯示的是1mg/mLEGF在多肽水凝膠中的釋放情況)；圖4顯示了第21天時，多肽水凝膠及生理鹽水中的EGF含量，其中圖A顯示了多肽水凝膠中的EGF含量，其為74％，圖B顯示了生理鹽水中的EGF含量，其為23％；表1顯示了分別從第0、7、14、21天的多肽水凝膠中取出的EGF在不同濃度時的熒光強度，從表中可以看出從第21天的多肽水凝膠中取出的EGF與之前三次取出的EGF的熒光強度基本相同，無顯著差異，說明EGF因子結構上沒有變化。圖3、圖4和表1說明多肽水凝膠具有EGF緩釋功能其不會引起EGF結構上的變化。

表1

實施例4

對實施例1～3中的多肽的α-螺旋結構進行測試，試驗步驟具體如下：

1)配置0.1mg/ml的多肽溶液；

2)將15μl樣品加入0.1cm石英比色皿；

3)將石英比色皿置于圓二色光譜(簡稱CD)儀中，設置譜帶寬度為1nm，掃

描范圍190-260nm，掃描次數為5，溫度25℃；

4)掃描后，將數據轉出并作圖。

其中，實施例1中的多肽檢測結果如圖5所示，實線代表一個α-螺旋蛋白，虛線代表本發明的多肽，在波長為200-240nm范圍內，二者基本重合，說明二者結構接近，也即本發明的多肽為α-螺旋結構。經測試，實施例1～3中的多肽α-螺旋百分比均在85％以上。圖6顯示本發明的多肽纖維大小在2-3納米。

如圖5所示，實線代表一個α-螺旋蛋白，虛線代表本發明的多肽，在波長為200-240nm范圍內，二者基本重合，說明二者結構接近，也即本發明的多肽為α-螺旋結構，經測試，α-螺旋百分比大于85％。圖6顯示本發明的多肽纖維大小在2-3納米。

最后所應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非對本發明保護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的實質和范圍。