本發明涉及一種復合細菌纖維素醫用敷料的制備方法，屬于生物材料制備技術領域。
背景技術：
醫用敷料主要功能是覆蓋、保護破損皮膚，同時提供有助于傷口愈合的環境，傳統主要使用脫脂棉紗布、紗布條、棉球和棉膜等天然纖維性材料類敷料，可使傷口干燥，具備物理隔離功能；但存在與滲出物結痂，造成傷口粘連，換藥時引發疼痛及新的創傷，以及細菌滋生、保濕及止血性能不佳等問題。為此，學者們研究出了生物敷料，其能與傷口緊密貼合，保持傷口潤濕避免其干燥，可輔助局部使用的藥物及機體內源性分子促進傷口愈合。生物敷料通常應具備以下要求：（1）保濕、吸濕性良好，能有效保留傷口滲液同時不形成積液；（2）傷口組織處粘連程度輕，不易與傷口滲液粘連成痂，減輕換藥時的疼痛及造成新生組織損傷；（3）抗菌、抑菌性較好，預防傷口感染；（4）生物相容性優良，對人體無刺激，不會引起中毒、病變等。
目前的生物敷料根據用途以及材質，可將其分為天然材料類、人工合成材料類和載藥類敷料。天然材料類包括海藻酸鹽敷料、殼聚糖敷料、動物類敷料等，海藻酸鹽敷料具有吸濕性強、揭除容易、有助于血液凝固及傷口愈合等優點，但是海藻酸鹽敷料需要一定的濕度才能發揮作用，所以它們不能用于干燥的傷口和被堅硬的壞死組織所覆蓋的傷口，這是海藻酸鹽敷料的主要缺點。殼聚糖敷料具有良好的生物相容性和生物可降解性，還具有抗菌、消毒、無毒、止血、減少創面滲出和促進創傷組織再生等優點，其缺點是力學性能較差，抗水性能差等。動物類敷料在結構、黏附性及膠原含量上與人體皮膚組織比較接近，但是它的力學性能較差，容易分層，會影響自體皮膚移植，且病原微生物容易污染，不易儲存。合成材料類包括薄膜型敷料、水膠體類敷料、泡沫類敷料，薄膜型敷料透氣性、阻菌性及貼附性好，但是吸收性較差，水膠體類敷料膠體層吸收大量滲出物后會造成創面傷口的二次污染，泡沫類敷料由于其具有多孔結構，傷口組織易長入孔隙，造成脫膜困難，并常有泡沫碎屑遺留于傷口導致痂痕增多。載藥類敷料的缺點為不具備粘連性，需要增加輔料加以固定，并且使用后會有著色現象，也有可能會產生耐藥性，對其在臨床上的應用也產生了一定的抑制作用。
技術實現要素：
本發明所要解決的技術問題：針對目前生物敷料需要一定的濕度才能發揮作用，所以它們不能用于干燥的傷口和被堅硬的壞死組織所覆蓋的傷口，并且抑菌消毒效果差的問題，提供了一種復合細菌纖維素醫用敷料的制備方法，本發明首先將釀酒酵母菌、醋化醋桿菌和木葡糖酸醋桿菌接種到自制的活化培養基中進行活化培養后，再將活化后的菌種接種到種子培養基中進行培養，隨后將種子液接種到發酵罐中與海藻酸鈉、硫酸軟骨素等一起進行厭氧發酵，再將得到的細菌纖維素膜取出并去除菌體和培養基，最后與地榆提取物進行冷凍干燥、緩沖溶液浸泡等操作得到一種復合細菌纖維素醫用敷料。本發明中的硫酸軟骨素具有良好的引濕性，可以吸收空氣中的水分，使自身含水量增加，解決了生物敷料需要不能用于干燥傷口的問題，并且本發明制備的醫用敷料能夠透過堅硬的壞死組織進入傷口內部，使傷口快速愈合，并且作用于軟骨組織時，還能使促進軟骨組織生長。
為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是：
（1）量取300～400mL去離子水加入到燒杯中，加熱至沸騰，然后停止加熱，再加入15～20g綠茶，浸泡30～40min，過濾，收集濾液，再加入20～30g蔗糖、5～8g蛋白胨、8～10g酵母粉，攪拌5～10min，并移入滅菌罐，在120～130℃下高溫滅菌10～20min，制得種子培養基，備用；
（2）稱取100～200g馬鈴薯泥、10～20g葡萄糖和10～15g瓊脂加入到培養皿中，再加入800～1000mL去離子水，攪拌均勻后，再加入質量濃度為5%醋酸溶液調節pH至6.5～6.8，隨后移入滅菌罐中，在110～120℃下高溫滅菌20～30min，制得活化培養基；
（3）將3～5g釀酒酵母菌、3～5g醋化醋桿菌和6～8g木葡糖酸醋桿菌分別接種到三個活化培養基中，然后置于恒溫培養箱中，在20～30℃下培養2～3天，將活化后的菌種按3～5%的接種量分別接種至備用的種子培養基中，于25～35℃、160～180r/min下搖床振蕩24～36h；
（4）然后分別將培養后的種子液按8～10%的接種量接種至同一發酵罐中，再稱取10～20g葡萄糖、20～30g甘露醇、5～8g蛋白胨和800～1000mL去離子水一起加入到發酵罐中，攪拌10～20min后，再依次加入10～20g海藻酸鈣、5～8g透明質酸、8～12g硫酸軟骨素，攪拌均勻后，在25～35℃下厭氧發酵4～5天；
（5）發酵完成后將細菌纖維素膜取出，然后用去離子水洗滌3～5次，再置于水浴鍋中，在120～130℃下水浴加熱1～2h，去除殘余菌體和培養基，再用去離子水洗滌至中性，得到復合細菌纖維素；
（6）稱取10～20g地榆，用粉碎機進行粉碎，將地榆粉末加入到燒杯中，并加入200～300mL質量濃度為75%乙醇溶液，再置于超聲波振蕩儀中，在1000～1200W、50～60℃下超聲振蕩30～40min，過濾，得到濾液，將細菌纖維素和濾液一起加入到已消毒的模具中冷凍干燥得到復合膜，然后再置于烘箱中，在60～70℃下干燥3～4h，再置于燒杯中，加入pH為5.5～5.8的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液將復合膜浸沒，常溫下浸泡1～2天，然后將復合膜取出并自然晾干，于2～4℃下保存，即可得到一種復合細菌纖維素醫用敷料。
本發明的應用方法：本發明制備的醫用敷料可用于治愈燒傷、燙傷、手術切口等多種皮膚類創傷，使用前先用醫用酒精將創傷周圍皮膚擦干，再選用比創面大5～8cm的本發明的醫用敷料覆蓋傷口，之后再用無菌紗布包扎，更換時間根據創面滲出液而定，滲出液多，敷料吸收飽和應及時更換，滲出液少，可隔1～2天更換即可。
本發明與其他方法相比，有益技術效果是：
（1）本發明中的細菌纖維素三維網絡內部均勻分布有海藻酸鈉、透明質酸、硫酸軟骨素，這種結構提高了整體的力學性能和熱穩定性，同時賦予了細菌纖維素敷料止血功能，并且能夠促進傷口愈合；
（2）本發明制備的醫用敷料能夠透過堅硬的壞死組織進入傷口內部，使傷口快速愈合，作用于軟骨組織時，還能使促進軟骨組織生長，具有保濕、透氣、吸收傷口滲出液等功效；
（3）本發明主制備步驟簡單，所需成本低。
具體實施方式
首先量取300～400mL去離子水加入到燒杯中，加熱至沸騰，然后停止加熱，再加入15～20g綠茶，浸泡30～40min，過濾，收集濾液，再加入20～30g蔗糖、5～8g蛋白胨、8～10g酵母粉，攪拌5～10min，并移入滅菌罐，在120～130℃下高溫滅菌10～20min，制得種子培養基，備用；接著稱取100～200g馬鈴薯泥、10～20g葡萄糖和10～15g瓊脂加入到培養皿中，再加入800～1000mL去離子水，攪拌均勻后，再加入質量濃度為5%醋酸溶液調節pH至6.5～6.8，隨后移入滅菌罐中，在110～120℃下高溫滅菌20～30min，制得活化培養基；再將3～5g釀酒酵母菌、3～5g醋化醋桿菌和6～8g木葡糖酸醋桿菌分別接種到三個活化培養基中，然后置于恒溫培養箱中，在20～30℃下培養2～3天，將活化后的菌種按3～5%的接種量分別接種至備用的種子培養基中，于25～35℃、160～180r/min下搖床振蕩24～36h；然后分別將培養后的種子液按8～10%的接種量接種至同一發酵罐中，再稱取10～20g葡萄糖、20～30g甘露醇、5～8g蛋白胨和800～1000mL去離子水一起加入到發酵罐中，攪拌10～20min后，再依次加入10～20g海藻酸鈣、5～8g透明質酸、8～12g硫酸軟骨素，攪拌均勻后，在25～35℃下厭氧發酵4～5天；發酵完成后將細菌纖維素膜取出，然后用去離子水洗滌3～5次，再置于水浴鍋中，在120～130℃下水浴加熱1～2h，去除殘余菌體和培養基，再用去離子水洗滌至中性，得到復合細菌纖維素；最后稱取10～20g地榆，用粉碎機進行粉碎，將地榆粉末加入到燒杯中，并加入200～300mL質量濃度為75%乙醇溶液，再置于超聲波振蕩儀中，在1000～1200W、50～60℃下超聲振蕩30～40min，過濾，得到濾液，將細菌纖維素和濾液一起加入到已消毒的模具中冷凍干燥得到復合膜，然后再置于烘箱中，在60～70℃下干燥3～4h，再置于燒杯中，加入pH為5.5～5.8的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液將復合膜浸沒，常溫下浸泡1～2天，然后將復合膜取出并自然晾干，于2～4℃下保存，即可得到一種復合細菌纖維素醫用敷料。
實例1
首先量取400mL去離子水加入到燒杯中，加熱至沸騰，然后停止加熱，再加入20g綠茶，浸泡40min，過濾，收集濾液，再加入30g蔗糖、8g蛋白胨、10g酵母粉，攪拌10min，并移入滅菌罐，在130℃下高溫滅菌20min，制得種子培養基，備用；接著稱取200g馬鈴薯泥、20g葡萄糖和15g瓊脂加入到培養皿中，再加入1000mL去離子水，攪拌均勻后，再加入質量濃度為5%醋酸溶液調節pH至6.8，隨后移入滅菌罐中，在120℃下高溫滅菌30min，制得活化培養基；再將5g釀酒酵母菌、5g醋化醋桿菌和8g木葡糖酸醋桿菌分別接種到三個活化培養基中，然后置于恒溫培養箱中，在30℃下培養3天，將活化后的菌種按5%的接種量分別接種至備用的種子培養基中，于35℃、180r/min下搖床振蕩36h；然后分別將培養后的種子液按10%的接種量接種至同一發酵罐中，再稱取20g葡萄糖、30g甘露醇、8g蛋白胨和1000mL去離子水一起加入到發酵罐中，攪拌20min后，再依次加入20g海藻酸鈣、8g透明質酸、12g硫酸軟骨素，攪拌均勻后，在35℃下厭氧發酵5天；發酵完成后將細菌纖維素膜取出，然后用去離子水洗滌5次，再置于水浴鍋中，在130℃下水浴加熱2h，去除殘余菌體和培養基，再用去離子水洗滌至中性，得到復合細菌纖維素；最后稱取20g地榆，用粉碎機進行粉碎，將地榆粉末加入到燒杯中，并加入300mL質量濃度為75%乙醇溶液，再置于超聲波振蕩儀中，在1200W、60℃下超聲振蕩40min，過濾，得到濾液，將細菌纖維素和濾液一起加入到已消毒的模具中冷凍干燥得到復合膜，然后再置于烘箱中，在70℃下干燥4h，再置于燒杯中，加入pH為5.8的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液將復合膜浸沒，常溫下浸泡2天，然后將復合膜取出并自然晾干，于4℃下保存，即可得到一種復合細菌纖維素醫用敷料。
本發明制備的醫用敷料可用于治愈燒傷、燙傷、手術切口等多種皮膚類創傷，使用前先用醫用酒精將創傷周圍皮膚擦干，再選用比創面大5cm的本發明的醫用敷料覆蓋傷口，之后再用無菌紗布包扎，更換時間根據創面滲出液而定，滲出液多，敷料吸收飽和應及時更換，滲出液少，可隔1天更換即可。
實例2
首先量取300mL去離子水加入到燒杯中，加熱至沸騰，然后停止加熱，再加入15g綠茶，浸泡30min，過濾，收集濾液，再加入20g蔗糖、5g蛋白胨、8g酵母粉，攪拌5min，并移入滅菌罐，在120℃下高溫滅菌10min，制得種子培養基，備用；接著稱取100g馬鈴薯泥、10g葡萄糖和10g瓊脂加入到培養皿中，再加入800mL去離子水，攪拌均勻后，再加入質量濃度為5%醋酸溶液調節pH至6.5，隨后移入滅菌罐中，在110℃下高溫滅菌20min，制得活化培養基；再將3g釀酒酵母菌、3g醋化醋桿菌和6g木葡糖酸醋桿菌分別接種到三個活化培養基中，然后置于恒溫培養箱中，在20℃下培養2天，將活化后的菌種按3%的接種量分別接種至備用的種子培養基中，于25℃、160r/min下搖床振蕩24h；然后分別將培養后的種子液按8%的接種量接種至同一發酵罐中，再稱取10g葡萄糖、20g甘露醇、5g蛋白胨和800mL去離子水一起加入到發酵罐中，攪拌10min后，再依次加入10g海藻酸鈣、5g透明質酸、8g硫酸軟骨素，攪拌均勻后，在25℃下厭氧發酵4天；發酵完成后將細菌纖維素膜取出，然后用去離子水洗滌3次，再置于水浴鍋中，在120℃下水浴加熱1h，去除殘余菌體和培養基，再用去離子水洗滌至中性，得到復合細菌纖維素；最后稱取10g地榆，用粉碎機進行粉碎，將地榆粉末加入到燒杯中，并加入200mL質量濃度為75%乙醇溶液，再置于超聲波振蕩儀中，在1100W、50℃下超聲振蕩30min，過濾，得到濾液，將細菌纖維素和濾液一起加入到已消毒的模具中冷凍干燥得到復合膜，然后再置于烘箱中，在60℃下干燥3h，再置于燒杯中，加入pH為5.5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液將復合膜浸沒，常溫下浸泡1天，然后將復合膜取出并自然晾干，于2℃下保存，即可得到一種復合細菌纖維素醫用敷料。
本發明制備的醫用敷料可用于治愈燒傷、燙傷、手術切口等多種皮膚類創傷，使用前先用醫用酒精將創傷周圍皮膚擦干，再選用比創面大6cm的本發明的醫用敷料覆蓋傷口，之后再用無菌紗布包扎，更換時間根據創面滲出液而定，滲出液多，敷料吸收飽和應及時更換，滲出液少，可隔1.5天更換即可。
實例3
首先量取350mL去離子水加入到燒杯中，加熱至沸騰，然后停止加熱，再加入18g綠茶，浸泡35min，過濾，收集濾液，再加入25g蔗糖、7g蛋白胨、9g酵母粉，攪拌8min，并移入滅菌罐，在125℃下高溫滅菌15min，制得種子培養基，備用；接著稱取150g馬鈴薯泥、15g葡萄糖和12g瓊脂加入到培養皿中，再加入900mL去離子水，攪拌均勻后，再加入質量濃度為5%醋酸溶液調節pH至6.6，隨后移入滅菌罐中，在115℃下高溫滅菌25min，制得活化培養基；再將4g釀酒酵母菌、4g醋化醋桿菌和7g木葡糖酸醋桿菌分別接種到三個活化培養基中，然后置于恒溫培養箱中，在25℃下培養2.5天，將活化后的菌種按4%的接種量分別接種至備用的種子培養基中，于30℃、170r/min下搖床振蕩30h；然后分別將培養后的種子液按9%的接種量接種至同一發酵罐中，再稱取15g葡萄糖、25g甘露醇、6g蛋白胨和900mL去離子水一起加入到發酵罐中，攪拌15min后，再依次加入15g海藻酸鈣、6g透明質酸、10g硫酸軟骨素，攪拌均勻后，在30℃下厭氧發酵4.5天；發酵完成后將細菌纖維素膜取出，然后用去離子水洗滌4次，再置于水浴鍋中，在125℃下水浴加熱1.5h，去除殘余菌體和培養基，再用去離子水洗滌至中性，得到復合細菌纖維素；最后稱取15g地榆，用粉碎機進行粉碎，將地榆粉末加入到燒杯中，并加入250mL質量濃度為75%乙醇溶液，再置于超聲波振蕩儀中，在1000W、55℃下超聲振蕩35min，過濾，得到濾液，將細菌纖維素和濾液一起加入到已消毒的模具中冷凍干燥得到復合膜，然后再置于烘箱中，在65℃下干燥3.5h，再置于燒杯中，加入pH為5.6的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液將復合膜浸沒，常溫下浸泡1.5天，然后將復合膜取出并自然晾干，于3℃下保存，即可得到一種復合細菌纖維素醫用敷料。
本發明制備的醫用敷料可用于治愈燒傷、燙傷、手術切口等多種皮膚類創傷，使用前先用醫用酒精將創傷周圍皮膚擦干，再選用比創面大8cm的本發明的醫用敷料覆蓋傷口，之后再用無菌紗布包扎，更換時間根據創面滲出液而定，滲出液多，敷料吸收飽和應及時更換，滲出液少，可隔2天更換即可。