小分子免疫激動劑偶聯PD?1抗體的新型抗體及其在抗腫瘤中的應用的制作方法
本發明涉及免疫化學領域，更具體地說，涉及一種對免疫系統具有抑制作用的PD-1抗體與一類小分子免疫激動劑化合偶聯形成新型抗體，以及該新型抗體的制備和在抗腫瘤中的應用。
背景技術：
近些年，在免疫抗腫瘤領域的一個重要進展是應用PD-1抗體的免疫抗腫瘤作用，作為一個抗腫瘤的突破性抗體藥物，它的靶點是表達在免疫細胞上(如T細胞)的PD-1蛋白。PD-1是一個免疫抑制蛋白，對正常人體的免疫過度起到抑制和免疫平衡的作用。但是在腫瘤病人體內，PD-1也對正常的抗腫瘤免疫反應產生抑制作用；因此PD-1抗體可以解除這種對腫瘤的免疫抑制作用(中國生物制品學雜志2014年6月27卷6期856—860)，這個作用在臨床治療腫瘤中產生了許多長期治療的效果。
目前PD-1抗體已經在美國、日本等國家上市臨床應用(具體可參見以下網址：http://www.fiercebiotech.com/biotech/anti-pd-1-cancer-star-nivolumab-wins-world-s-first-regulatory-approval；http://www.pharmatimes.com/news/japan_approves_worlds_first_pd-1_drug％2C_nivolumab_1002153)。
然而，PD-1抗體的作用只是解除免疫系統的抑制“剎車”作用，因此其療效雖然顯著，但是僅僅在大約20％到30％病人中有效。為了提高其療效比例，需要一種產品能夠同時提高腫瘤病人自身免疫能力，以產生協同作用和更高的治療效果。
技術實現要素：
本發明要解決的技術問題在于，針對上述PD-1抗體療效比例較低的問題，提供一種小分子免疫激動劑偶聯PD-1抗體的新型抗體及其在抗腫瘤中的應用。
本發明解決上述技術問題的技術方案是，提供一種小分子免疫激動劑偶聯PD-1抗體的新型抗體，所述新型抗體由小分子免疫激動劑和PD-1抗體偶聯反應得到，所述新型抗體包括以下通式[Ⅰ]的化合物：
式[Ⅰ]中：X1表示OH或SH；R1表示烷氧基或烷基胺基，X2表示鏈接基團；其中抗體部分與小分子免疫激動劑組成部分由小分子免疫激動劑和所述抗體共價化合鏈接形成，m為小分子激動劑的數目(m定義為偶聯度)，為1～10的數字；抗體部分指為抗PD-1的單抗(IgG1、IgG2或IgG4)。
當所述小分子免疫激動劑為式1的化合物時：
所述X2表示硫代羰基基團：
當所述小分子免疫激動劑為式2-1、2-2、2-3的化合物時：
所述X2表示如下基團：
當所述小分子免疫激動劑為式3的化合物時：
式3中，u為0～12的整數；
X2表示如下基團：
其中u為0～12的整數；
當所述小分子免疫激動劑為式4的化合物時：
X2表示如下基團：
其中PEG為聚乙二醇基團如二聚乙二醇基團為三聚乙二醇基團為四聚乙二醇基團為
本發明提供了一種新型的雙功能抗體10、12、14、16、18，這些新型抗體既有免疫抑制解除功能(以顯著提高的抗腫瘤效果為代表)，又同時具有激活免疫功能。
本發明的創造之處在于，提供既有免疫抑制解除功能(以顯著提高的抗腫瘤效果為代表)，又同時具有激活免疫功能的新型抗體及其制備方法。
本發明的創造之處在于，提供具有上述雙功能，又能促進活性T細胞增值的新型抗體及其制備方法。
本發明的目的在于，提供用于制備上述新型抗體的偶聯前體小分子化合物及合成這些偶聯前體小分子的化合物或它們的鹽。
本發明的另一目的在于，提供所制備的新型抗體在免疫抑制的解除和激發、抗病毒、腫瘤免疫調節和腫瘤生物免疫治療中的應用。
本發明中的新偶聯抗體可用于惡性腫瘤的免疫治療和免疫調節，其用藥方法可為腹腔注射、皮下注射、肌肉注射和靜脈注射；或者可采用將本發明中的新型抗體和免疫細胞(如樹突狀細胞、自然殺傷細胞NK、淋巴細胞、單核/巨噬細胞、粒細胞等)共培養后，分離免疫細胞體內回輸的方法。
上述新型抗體和制備它們的相應的小分子免疫激動劑化合物或它們的鹽可制成適用于上述各種治療藥物、可與其他藥物制成復方藥物、協同藥物、或制成藥學上可接受的載體的復合物或結合物。
本發明的新型雙功能抗體或它們的鹽可用于制備各種比例的治療藥物中。
附圖說明
圖1是新型抗體10、12、14、16、18的白介素-6(IL-6)激發活性。
圖2是新型抗體10、12、14、16、18的白介素-12(IL-12)激發活性。
圖3是新型抗體10、12、14、16、18的IFN-γ激發活性。
圖4是新型抗體10、12、14、16、18的抗腫瘤活性。
圖5是新型抗體10、12、14、16、18的促進T細胞增值活性。
圖6是小分子免疫激動劑19、20、21、22、20-2的IFN-γ激發活性。
圖7是小分子免疫激動劑19、20、21、22的白介素-6(IL-6)激發活性。
圖8是PD-1抗體的功能特征。
圖9、10、11是本發明新型抗體的PD-1抗體功能特征。
具體實施方式
為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。
本發明提供了一種小分子免疫激動劑偶聯PD-1抗體的新型抗體，具有如下的結構通式[Ⅰ]表示：
式[Ⅰ]中：X1表示OH或SH；R1表示烷氧基或烷基胺基，X2表示鏈接基團；其中抗體與小分子免疫激動劑組成部分由小分子免疫激動劑和所述抗體共價化合鏈接形成，m為小分子激動劑的數目(m定義為偶聯度)，為1～10的數字；抗體部分指為抗PD-1的單抗(IgG1、IgG2或IgG4)。
當所述小分子免疫激動劑為式1的化合物時：
所述X2表示硫代羰基基團：
當所述小分子免疫激動劑為式2-1、2-2、2-3的化合物時：
所述X2表示如下基團：
當所述小分子免疫激動劑為式3的化合物時：
式3中，u為0～12的整數；
X2表示如下基團：
其中u為0～12的整數；
當所述小分子免疫激動劑為式4的化合物時：
X2表示如下基團：
其中PEG為聚乙二醇基團如二聚乙二醇基團為三聚乙二醇基團為四聚乙二醇基團為等。
當小分子免疫激動劑為式1、2-1、2-2、2-3、4代表的化合物時，以PD-1抗體和其它抗體為例作為抗體部分形成的新型抗體的典型代表結構式如下:
其中m為1到10之間的數。
當偶聯新型抗體的前體小分子為式1、2-1、2-2、2-3、4代表的化合物時，以PD-1抗體為例作為代表性抗體形成的新型抗體的典型代表合成及其結構式如下:
在上述偶聯形成的新型抗體中，抗體選自PD-1單抗；也可應用于其它的類似的解除免疫抑制的抗體，如PD-L1抗體、CTLA-4抗體、TIM-3抗體、LAG3抗體、TIGIT抗體等；PD-1單抗包括各種抗人PD-1蛋白的單抗(IgG1、IgG2和IgG4)，所述PD-1蛋白的序列如下：
1MQIPQAPWPWWAVLQLGWRPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTS61ESFVLNWYR70MSPSNQTDKLAAFPEDR86SQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSWRARRND118SGTYLCGAISLAPKAQIKE136SLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVVGVVGGLLGS181LVLLVWVLAVICSRAARGTIGARRTGQPLKEDP5AVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVP241CVPEQTEYATIVFP5GMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL
所述PD-1抗體針對該序列為抗原的表位序列。
偶聯前體化合物11合成舉例：
將20-1溶解于無水DMSO中，于10℃冷卻加入等當量的丁二酸酐，混合物自然室溫攪拌24小時。混合反應物倒與20倍體積水中，析出大量白色固體化合物SZU-101；收率88％；MS(ESI)445.27(M+1)；
將SZU-101(1eq)，NHS(1.2eq)和EDC(1.3eq)溶于無水DMF，室溫下攪拌4h，結束反應，將反應液倒入二氯甲烷中，抽濾，干燥，得活性酯23白色固體，直接用于下一步反應。將活性酯和NH2-PEG2-COOH(化合物24)按等當量比例溶于DMF，室溫攪拌至反應結束(TLC監測)。加水，析出大量固體，抽濾，干燥，柱層析分離純化(二氯甲烷：甲醇＝10:1)得白色固體化合物19，收率86％；熔點221℃；高分辨質譜分子量HRMS(ESI)理論值m/z 603.2746,found 604.2757(M+H)。
將19(1eq)，NHS(1.2eq)和EDC(1.3eq)溶于無水DMF，室溫下攪拌12h，結束反應，將反應液倒入二氯甲烷中，抽濾，干燥，得活性酯化合物11白色固體，收率82％；熔點187℃；高分辨質譜分子量HRMS(ESI)理論值m/z 700.2839,found 701.2842(M+1)。
偶聯前體化合物13合成舉例：
將化合物20-1(參考中國專利CN201210382202.8)(1eq)和巰基乙酸(1eq)溶于無水DMF，加入1.2eq HBTU，3eq三乙胺以及0.1eq DMAP，室溫攪拌，反應結束后，加水，抽濾，干燥得20-2淡黃色固體。再與4-(N-馬來酰亞胺甲基)環己烷-1-羧酸(1eq)在DMF中室溫攪拌，TLC監測原料消失，反應混合物傾倒入冷水，產物固體過濾，干燥得化合物20，MS(ESI)656.27(M+1).將化合物20(1eq)加入NHS(1.2eq)和EDC(1.3eq)的DMF溶液室溫攪拌過夜，反應完成后，經制備液相分離得活性酯化合物13，熔點201℃，收率35％(從起始原料20-1算起)；高分辨質譜分子量HRMS(ESI)理論值m/z 752.2630,found 753.2632(M+1)。
偶聯前體化合物15、17合成制備方法、反應條件和投料比例與制備化合物13相同，只是將用替換；
偶聯前體化合物15合成路線：
得化合物21，白色固體，質譜鑒定分子量：HRMS(ESI)630.2356(M+1)。得偶聯前體化合物15，白色固體，質譜鑒定分子量：HRMS(ESI)727.2431(M+1)。
偶聯前體化合物17的合成路線：
得化合物22，白色固體，質譜鑒定分子量：HRMS(ESI)588.1819(M+1)。得偶聯前體化合物17，白色固體，質譜鑒定分子量：HRMS(ESI)685.2022(M+1)。
以PD-1抗體形成的本發明中新型雙功能抗體制備合成實施舉例：
物質鑒定質譜儀型號：LDI-1700激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)，生產商：美國Linear Scientific公司。
質譜確定小分子免疫激動劑的比例(偶聯度)的方法如下：質譜鑒定所得偶聯新型抗體產物的分子量減去原PD-1抗體分子量得增加值，計算：分子量增加值/(偶聯前體小分子分子量-18)＝偶聯度；(小分子化合物每偶聯1個減去1個水分子的分子量)。
PD-1抗體首選為Nivolumab(BMS-936558)、Pembrolizumab(MK-3475)，AMP-514，AMP-224，Pidilizumab；但是也適用于其它來源的PD-1抗體。
Nivolumab的制備按照專利WO2006121168中制備5C4、17D8、2D3、4H1、4A11、7D3和5F4的方法；及其CN201380062005.0中公布的方法。
Pembrolizumab的制備按照專利WO2008156712(A1)中制備h409A11、及其US8354509和US8900587專利中公布的方法。
AMP-514和AMP-224的制備按照專利WO201214549專利中公布的方法。
Pidilizumab的制備按照專利WO2009014708和WO2009114335專利中公布的方法。
PD-1抗體的制備方法也可采用本領域公知的其它公開方法，如在中國專利CN201410838610.9；CN201310199947.5；CN201380079581.6；CN201480011008.6；CN201310258289.2的中公開的方法。
PD-1抗體也可以市場購買為來源，比如購自美國BioXCell公司PD-1抗體，名稱：anti h PD-1(h CD279)IgG1，含量95％；北京科昕生物科技有限公司抗PD-1全人單克隆抗體。本發明新型抗體合成方法中的PD-1抗體來源不局限于此。
以下PD-1抗體的反應濃度均為1當量濃度(1eq，相對于其它反應物)。
新型抗體10的制備：
偶聯前體小分子化合物1的合成制備方法請參考中國專利(CN201210382202.8)。
將化合物1(10eq當量濃度)和PD-1抗體(Nivolumab)混合于1mL的DMSO溶劑中，混合物加入三乙胺0.1mL，與5℃至20℃攪拌反應12小時。反應混合物與10mL的0℃純水混合，搖勻，用10kD的生物濾膜過濾除去小分子，用純水洗脫產物，洗脫液冷凍干燥得新型抗體10(收率60％)。質譜鑒定分子量增加為1167；計算偶聯度為3。(1167/386＝3.02)。
新型抗體12的制備：
將化合物11(30eq當量濃度)和PD-1抗體(Nivolumab)混合于適量DMSO溶劑中，混合物加入三乙胺調節pH值到8，與5℃至20℃攪拌反應12小時。反應混合物與10倍體積的0℃純水混合，搖勻，用10kD的生物濾膜過濾除去小分子，用純水沖洗脫產物，洗脫液冷凍干燥得新型抗體12(收率72％)。質譜鑒定分子量增加為2931；計算偶聯度為5。(2931/585.6＝5)。
(在新型抗體12的制備方法中，將Nivolumab替換為BioXCell公司PD-1抗體：anti h PD-1(h CD279)IgG1，得到新型抗體12-2，其制備過程和所得新型抗體12-2的結果與新型抗體12相同)。
新型抗體14的制備：
將化合物13(40eq當量濃度)和PD-1抗體(AMP-514)混合于適量DMSO溶劑中，混合物加入三乙胺調節pH值到8，與5℃至20℃攪拌反應12小時。反應混合物與10倍體積的0℃純水混合，搖勻，用10kD的生物濾膜過濾除去小分子，用純水沖洗脫產物，洗脫液冷凍干燥得新型抗體14(收率66％)。質譜鑒定分子量增加為1917；計算偶聯度為3。
新型抗體16的制備：
將化合物15(40eq當量濃度)和PD-1抗體(Pembrolizumab)混合于適量DMSO溶劑中，混合物加入三乙胺調節pH值到8，與5℃至20℃攪拌反應12小時。反應混合物與10倍體積的0℃純水混合，搖勻，用10kD的生物濾膜過濾除去小分子，用純水沖洗脫產物，洗脫液冷凍干燥得新型抗體16(收率73％)。質譜鑒定分子量增加為2377；計算偶聯度約為4。
新型抗體18的制備：
將化合物17(40eq當量濃度)和PD-1抗體(AMP-224)混合于適量DMSO溶劑中，混合物加入三乙胺調節pH值到8，與5℃至20℃攪拌反應12小時。反應混合物與10倍體積的0℃純水混合，搖勻，用10kD的生物濾膜過濾除去小分子，用純水沖洗脫產物，洗脫液冷凍干燥得新型抗體18(收率57％)。質譜鑒定分子量增加為1143；計算偶聯度約為2。
本發明新型抗體的免疫激活實驗方法(小鼠)：
1.取Balb/C小鼠脾淋巴細胞，按1x106/ml/孔鋪板
2.優選抗體濃度:按0.1μM加藥刺激24h。
3.收集上清并用ELISA方法檢測IL-6/IL-12(效果如圖1、2所示)。
本發明中小分子免疫激動劑的免疫激活實驗方法(小鼠)：
1.取Balb/C小鼠脾淋巴細胞，按1x106/ml/孔鋪板
2.選取小分子免疫激動劑的濃度:按0.1、10、20μM加藥刺激24h。
3.收集上清并用ELISA方法檢測IFN-γ/IL-6(效果如圖6、7所示)。
本發明新型抗體的免疫激活實驗方法(人)：
1.取自愿者外周單核細胞，分離出T細胞(懸浮細胞)于37℃，5％CO2含血清培養基培養7天，按1x106/ml/孔鋪板
2.優選抗體濃度:按0.1μM加藥刺激24h。
3.收集上清并用ELISA方法檢測IFN-γ(如圖3所示)。
本發明新型抗體的抗腫瘤效果實驗方法：
將6—8周齡的Balb/C小鼠隨機分為7組。在小鼠背部皮下種植2.5x105個4T1腫瘤細胞。分別用PBS空白對照、10mg/kg的PD-1抗體對照給藥；對照藥和新型抗體10、12、14、16、18的給藥劑量為10mg/kg、體積100μL；各組給藥方式為腹腔注射。在種植腫瘤后的第1天，第7、15、22、29天各組分別給藥。當腫瘤達到1500mm3或者大于體重的15％時將小鼠安樂死。腫瘤抑制結果如圖4所示。可見本發明中新型抗體處理組具有顯著提高的抗腫瘤效應。
本發明新型抗體的促進T細胞增值實驗方法：
取自愿者外周單核細胞，分離出T細胞(懸浮細胞)于37℃，5％CO2含血清培養基培養7天后，換無血清培養基同時加入本發明的新型抗體和PD-1(對照)(濃度均為1μM)，3天后CCK-8細胞染色方法檢測。可見本發明新型抗體可以通過加強阻斷PD-1和激活天然免疫促進T細胞增值。結果如圖5所示。
本發明新型抗體的PD-1抗體功能特征實驗方法(用PD-1的特異性二抗檢測PD-1抗體)：
1.抽取健康志愿者外周血
2.取得外周血于離心管中，800g，30min。分離血清和血細胞。
3.獲得血細胞后重懸于生理鹽水中，輕輕沿壁加入至外周血淋巴細胞分離液上層。
4.800g離心30min.吸取白膜層(外周淋巴細胞層)。
5.將分離得到的外周血淋巴細胞重懸于生理鹽水中900g，10min。洗滌2次。
6.計數分離獲得的外周血淋巴細胞。
7.取1x106細胞，100ul生理鹽水重懸，分別用PD-1抗體，本發明新型抗體10、12、16,和IgG1(對照)，37度孵育30min。
8.生理鹽水洗滌3次，用100ul生理鹽水重懸，加入Anti-PD-1-FITC的二抗，室溫孵育30min。
9.生理鹽水洗滌，流式上機檢測。
結果見如圖8、9、10、11所示：與對照組以及未偶聯的組比較可以發現，
本發明的新型抗體的PD-1抗體功能特征保持完好。
以上所述，僅為本發明較佳的具體實施方式，但本發明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明揭露的技術范圍內，可輕易想到的變化或替換，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。因此，本發明的保護范圍應該以權利要求的保護范圍為準。
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