本發明屬于農產品精深加工及其副產品綜合利用技術領域，具體涉及一種以玉米源抗氧化肽為原料制備的抗氧化滴丸及其制備方法。
背景技術：
玉米蛋白粉是玉米籽粒經濕磨法工藝生產玉米淀粉所產生的副產物，由于其水溶性差、利用率低、營養價值低等不足，限制了在食品工業中的應用，大多被用于飼料或作為廢棄物排掉。玉米抗氧化肽的開發為玉米蛋白粉的利用提供了新的途徑，極大地推動了玉米深加工產業發展。同時，隨著國內外保健食品市場的不斷擴展，開發新型玉米功能性肽類保健食品對提高人們的健康水平和促進功能性食品工業的發展具有重要的社會意義和經濟效益。
玉米蛋白粉中的蛋白質主要為醇溶蛋白和谷物蛋白，另有少量的球蛋白和白蛋白。研究發現，玉米蛋白粉可用以制備高F值低聚肽、降血壓肽和抗氧化肽等蛋白肽。代衍峰等研究報道(代衍峰，何志勇，陳潔，等.抗氧化性玉米肽的分離純化及其性質[J].科研開發，2008，24(5):5–8.)，采用DPPH自由基清除率法可以測定經分離純化后的玉米抗氧化肽活性。徐力(徐力，李相魯，黃宜兵，等.小分子玉米肽Leu–ASp–Tyr–Glu保護線粒體抗氧化損傷的研究[J].高等學校化學學報，2004，25:1073–1075.)等報道了小分子玉米抗氧化肽Leu-Asp-Tyr-Glu可以作為一種新型抗氧化劑，能夠有效清除自由基和抑制心肌線粒體損傷的作用。
凝膠色譜分離技術是通過相對分子質量和分子量的不同而獲得目標產物，具有分離條件溫和、重復性高、回收率高、設備簡便經濟等優點，是目前應用比較廣泛的分離技術之一。肽經過凝膠色譜分離后，獲得了不同抗氧化活性的肽段。本發明利用玉米抗氧化肽分離制備高活性因子，提供了一種具有抗氧化活性的玉米源肽的制備方法。
技術實現要素：
本發明所需要解決的技術問題是提供一種以玉米源蛋白肽為原料制備的抗氧化滴丸及其制備方法，其特征在于采用玉米源高抗氧化活性因子，獲得外觀形態優質(硬度強、圓整度飽滿、無拖尾)、溶散時限短、丸重差異小的玉米源抗氧化肽滴丸。
本發明所述的玉米源抗氧化肽滴丸的制備方法，其包括利用SephadexG-25凝膠色譜分離處理、真空冷凍干燥、基質調配、冷凝劑調配、滴丸制備、冷卻烘干等步驟，從而得到外觀形態優質(硬度強(大力按壓不變型)、圓整度飽滿、無拖尾、溶散時限7min以下、丸重差異0.2g以下，在三維橫徑中，任意二維橫徑之差在0.2～0.5mm以內，具體步驟如下：
1)SephadexG-25凝膠色譜分離處理：首先將SephadexG-25凝膠與蒸餾水混合，體積比為1:3～1:5；然后于室溫下溶脹2～5h，再于沸水下溶脹0.5h～2h；將得所凝膠在2℃～6℃條件下注入到SephadexG-25凝膠色譜儀的層析柱中，待凝膠沉積至離層析柱頂5cm～10cm時，停止注入凝膠，采用蒸餾水平衡層析柱，使其基線走平；紫外檢測器的波長為280nm，玉米源蛋白肽粉(學位論文：王可，玉米蛋白資源高效利用開發抗氧化肽的關鍵技術研究[D].吉林大學，2014)溶液在280nm吸收波長下有最大吸收值，紫外檢測器用來追蹤肽粉溶液的吸光度隨時間的變化，直觀的顯示出經純化后可以得到三個不同組分的玉米源抗氧化肽液；將玉米源蛋白肽粉溶于蒸餾水中，使其濃度為30mg/mL～60mg/mL，將所得肽粉溶液經0.45μm濾膜過濾；肽粉溶液的上樣體積為0.5mL～5mL，控制流速1mL/min～3mL/min，收集3個不同組分的純化后的玉米源抗氧化肽液；
2)真空冷凍干燥：將步驟1)得到的不同組分的純化后的玉米源抗氧化肽液分裝于冷凍盤中，厚度10～20mm，在-75～-80℃條件下預凍5～6h，然后在-30～-45℃條件下凍干10～24h，即得到不同組分的純化后的玉米源抗氧化肽凍干粉，分別測定DPPH自由基清除率，收集DPPH自由基清除率最高的玉米源抗氧化肽凍干粉組分；
DPPH自由基清除率的測定：將不同組分的純化后的玉米源抗氧化肽凍干粉分別用蒸餾水配制為質量濃度為10mg/mL的測試液，采用96孔板，依次加入100μL測試液、100μL甲醇及100μL、0.6mmol/L的DPPH甲醇溶液，將96孔板放在微量震蕩器上震蕩1min，使反應液混合均勻，在環境溫度為25℃條件下避光反應30min，用酶標儀在515nm處測定其吸光度AS；相同條件下，用100μL甲醇代替測試液作為空白對照，測定其吸光度AB，DPPH清除率計算公式如下：式中：AB為200μL甲醇與100μL、0.6mmol/L的DPPH甲醇溶液的吸光度；AS為100μL測試液、100μL甲醇與100μL、0.6mmol/L的DPPH甲醇溶液的吸光度；分別測定每個組分的玉米源抗氧化肽粉的DPPH自由基清除率；
3)基質調配：將聚乙二醇4000與聚乙二醇6000以質量比2：3～1：1的比例混勻；
4)冷凝劑調配：將液體石蠟與二甲基硅油以體積比1：2～2：1的比例混勻；
5)滴丸制備：將步驟3)得到的基質水浴加熱至熔融狀態，保持溫度為70～80℃，30～35min后將步驟2)得到的DPPH自由基清除率最高的玉米源抗氧化肽凍干粉組分加入熔融態的混合基質中，混勻，保持溫度不變，DPPH自由基清除率最高的玉米源抗氧化肽凍干粉與混合基質的質量比為1：5～1：10；將以上熔融混合物置入滴丸機漏斗中，設置滴丸機參數，滴距5～10cm、滴速20～45滴/min，滴入2～8℃的冷凝劑中，獲得滴丸；
6)脫去冷凝劑：將步驟5)得到的滴丸在功率0.70～1.0kw、離心轉速2000～3000rpm的條件下離心，將滴丸外部的冷凝劑脫去，自然干燥，從而得到本發明所述的玉米源抗氧化肽滴丸。
前面內容中所述的玉米源蛋白肽粉的分子量在10kDa～30kDa之間，蛋白質含量為70～85％，水解度為40～50％。
本發明的技術優勢主要體現在以下兩個方面：
第一，申請的專利技術是以滴丸化制備技術為核心技術。特別強調的是，將滴丸化制備技術應用于玉米源蛋白肽的功能活性保護的研究中，其技術優勢突出體現于：
(1)利用滴丸化技術制備玉米源功能活性肽滴丸，可獲得溶散時限7min以下；丸重差異0.2g以下；形狀類圓形，在三維橫徑中，任意二維橫徑之差在0.2～0.5mm；完全不產生拖尾現象且硬度強的滴丸產品。
(2)選用的滴丸基質、冷凝劑材料安全，更適合玉米天然、高附加值的產品開發主題。
(3)區別于以往食源性功能肽活性保護常見方法，滴丸化制備技術可實現連續工業化生產，操作簡便，設備簡單，工藝周期短，生產效率高，生產車間無粉塵，利于環境保護。
第二，申請的專利技術是以分子量在10kDa～30kDa的玉米源蛋白肽為原料，具有來源廣泛、原料成本低廉且易獲取的特點。
第三，申請的專利技術采用SephadexG-25凝膠色譜分離處理技術，以DPPH自由基清除率為抗氧化活性評價指標，對分子量10kDa～30kDa的玉米源蛋白肽進行分離純化。
(1)本專利采用的SephadexG-25凝膠色譜分離技術是通過相對分子質量和分子量的不同而獲得目標產物，分離條件溫和、重復性高、回收率高、設備簡便經濟。SephadexG-25凝膠色譜分離技術處理獲得的玉米源抗氧化活性肽，具有純化度高的優點
(2)本專利采用以DPPH自由基清除率為抗氧化活性評價指標，經測定，組分Ⅲ為抗氧化高活性因子，所獲得的DPPH自由基清除率為80％～85％左右。
綜上所述，縱觀國內外相關研究與技術報道，未見利用SephadexG-25凝膠色譜分離和滴丸化制備技術對分子量在10kDa～30kDa的玉米源蛋白肽進行活性保護，獲得外觀形態優質(硬度強、圓整度飽滿、無拖尾)、溶散時限為7min以下、丸重差異為0.2g以下的玉米源抗氧化活性滴丸。
附圖說明
圖1：為以分子量在10kDa～30kDa的玉米源蛋白肽為原料，進行SephadexG-25凝膠色譜分離技術得到的DPPH自由基清除率最高組分Ⅲ的凝膠色譜分離純化圖譜。結果顯示，在280nm紫外檢測波長檢測下，得到3個分離組分，將其分別命名為組分Ⅰ、組分Ⅱ、組分Ⅲ。其中Ⅲ的峰值最高，分離效果最明顯。
具體實施方式
實施例1
稱取SephadexG-25凝膠，使其與蒸餾水混合，比例為1:3(v/v)，室溫溶脹時間2h，沸水溶脹0.5h，將凝膠在2℃條件下注入層析柱中，待凝膠沉積至離層析柱頂約5cm時，停止注入凝膠，采用蒸餾水平衡層析柱，使其基線走平，紫外檢測器的波長為280nm，將分子量在10kDa～30kDa，蛋白質含量為80.2％，水解度為40.26％的玉米源蛋白肽粉溶于蒸餾水中，使其濃度為30mg/mL，將肽粉溶液經0.45μm濾膜過濾，上樣體積為3mL，控制流速2mL/min，最終共收集到3個組分，進行真空冷凍干燥，將每個純化后的玉米抗氧化肽液的組分分裝于冷凍盤中，厚度10mm，在-75℃條件下預凍5h，然后在-45℃條件下凍干24h，即得到純化后的玉米源抗氧化肽凍干粉。分別測定每個組分的DPPH自由基清除率，用蒸餾水將純化后的玉米抗氧化肽凍干粉配制為質量濃度為10mg/mL的測試液，采用96孔板，依次加入100μL測試液、100μL甲醇及100μL0.6mmol/L的DPPH甲醇溶液，將96孔板放在微量震蕩器上震蕩1min，使反應液混合均勻，在環境溫度為25℃條件下避光反應30min，用酶標儀在515nm處測定其吸光度AS。相同條件下，用100μL甲醇代替測試液作為空白對照，測定其吸光度AB，DPPH清除率計算公式如下：式中：AB為200μL甲醇與100μLDPPH甲醇溶液的吸光度；AS為100μL測試液、100μL甲醇與100μLDPPH甲醇溶液的吸光度。3個組分的DPPH自由基清除率分別為40.12％、48.57％、83.31％。收集DPPH自由基清除率最高的組分III，稱量10g凍干粉備用。配制基質，稱取PEG-4000 25g，PEG-6000 25g，混勻后備用。配制冷凝劑，稱取液體石蠟1L，二甲基硅油1.5L，混勻后備用。將基質水浴加熱至熔融狀態，保持溫度為80℃，30min后將DPPH自由基清除率最高的組分III加入熔融態的混合基質中，混勻，保持溫度不變。將以上熔融混合物置入滴丸機漏斗中，設置滴丸機參數，滴距5cm、滴速45滴/min，滴入2℃的冷凝劑中，滴制成丸。將制備好的滴丸在功率0.75kw，離心轉速為2000rpm條件下離心，將滴丸外部的二甲基硅油和液體石蠟脫去，保證滴丸干燥狀態。按照《中國藥典》規定，對滴丸進行測定。經測定，溶散時限為6.5min；丸重差異0.15g；形狀類圓形，在三維橫徑中，任意二維橫徑之差在0.35mm；完全不產生拖尾現象且硬度強的玉米源抗氧化肽滴丸。
實施例2
稱取SephadexG-25凝膠，使其與蒸餾水混合，比例為1:4(v/v)，室溫溶脹時間3h，沸水溶脹1h，將凝膠在3℃條件下注入層析柱中，待凝膠沉積至離層析柱頂約7cm時，停止注入凝膠，采用蒸餾水平衡層析柱，使其基線走平，紫外檢測器的波長為280nm，將分子量在10kDa～30kDa，蛋白質含量為83.5％，水解度為45.29％的玉米源蛋白肽粉溶于蒸餾水中，使其濃度為30mg/mL，將肽粉溶液經0.45μm濾膜過濾，上樣體積為4mL，控制流速1mL/min，最終共收集到3個組分，進行真空冷凍干燥，將每個純化后的玉米抗氧化肽液的組分分裝于冷凍盤中，厚度15mm，在-76℃條件下預凍5.2h，然后在-40℃條件下凍干20h，即得到純化后的玉米源抗氧化肽凍干粉。分別測定每個組分的DPPH自由基清除率，用蒸餾水將純化后的玉米抗氧化肽凍干粉配制為質量濃度為10mg/mL的測試液，采用96孔板，依次加入100μL測試液、100μL甲醇及100μL0.6mmol/L的DPPH甲醇溶液，將96孔板放在微量震蕩器上震蕩1min，使反應液混合均勻，在環境溫度為25℃條件下避光反應30min，用酶標儀在515nm處測定其吸光度AS。相同條件下，用100μL甲醇代替測試液作為空白對照，測定其吸光度AB，DPPH清除率計算公式如下：式中：AB為200μL甲醇與100μLDPPH甲醇溶液的吸光度；AS為100μL測試液、100μL甲醇與100μLDPPH甲醇溶液的吸光度。3個組分的DPPH自由基清除率分別為43.35％、49.43％、82.41％。收集DPPH自由基清除率最高的組分III，稱量10g凍干粉備用。配制基質，稱取PEG-400024g，PEG–600036g，混勻后備用。配制冷凝劑，稱取液體石蠟1L，二甲基硅油1L，混勻后備用。將基質水浴加熱至熔融狀態，保持溫度為75℃，31min后將玉米源蛋白肽粉末加入熔融態的混合基質中，混勻，保持溫度不變。將以上熔融混合物置入滴丸機漏斗中，設置滴丸機參數，滴距6cm、滴速30滴/min，滴入5℃的冷凝劑中，滴制成丸。將制備好的滴丸在功率0.75kw，離心轉速為2200rpm條件下離心，將滴丸外部的二甲基硅油和液體石蠟脫去，保證滴丸干燥狀態。按照《中國藥典》規定，對滴丸進行測定。經測定，溶散時限為6.8min；丸重差異0.16g；形狀類圓形，在三維橫徑中，任意二維橫徑之差在0.5mm；完全不產生拖尾現象且硬度強的玉米源抗氧化肽滴丸。
實施例3
稱取SephadexG-25凝膠，使其與蒸餾水混合，比例為1:5(v/v)，室溫溶脹時間4h，沸水溶脹1h，將凝膠在5℃條件下注入層析柱中，待凝膠沉積至離層析柱頂約8cm時，停止注入凝膠，采用蒸餾水平衡層析柱，使其基線走平，紫外檢測器的波長為280nm，將分子量在10kDa～30kDa，蛋白質含量為85.0％，水解度為41.38％的玉米源蛋白肽粉溶于蒸餾水中，使其濃度為30mg/mL，將肽粉溶液經0.45μm濾膜過濾，上樣體積為3mL，控制流速2mL/min，最終共收集到3個組分，進行真空冷凍干燥，將每個純化后的玉米抗氧化肽液的組分分裝于冷凍盤中，厚度16mm，在-77℃條件下預凍5.5h，然后在-35℃條件下凍干18h，即得到純化后的玉米源抗氧化肽凍干粉。分別測定每個組分的DPPH自由基清除率，用蒸餾水將純化后的玉米抗氧化肽凍干粉配制為質量濃度為10mg/mL的測試液，采用96孔板，依次加入100μL測試液、100μL甲醇及100μL0.6mmol/L的DPPH甲醇溶液，將96孔板放在微量震蕩器上震蕩1min，使反應液混合均勻，在環境溫度為25℃條件下避光反應30min，用酶標儀在515nm處測定其吸光度AS。相同條件下，用100μL甲醇代替測試液作為空白對照，測定其吸光度AB，DPPH清除率計算公式如下：式中：AB為200μL甲醇與100μLDPPH甲醇溶液的吸光度；AS為100μL測試液、100μL甲醇與100μLDPPH甲醇溶液的吸光度。3個組分的DPPH自由基清除率分別為42.28％、50.06％、83.54％。收集DPPH自由基清除率最高的組分III，稱量10g凍干粉備用。配制基質，稱取PEG-400030g，PEG–600040g，混勻后備用。配制冷凝劑，稱取液體石蠟1L，二甲基硅油1.2L，混勻后備用。將基質水浴加熱至熔融狀態，保持溫度為76℃，32min后將玉米源蛋白肽粉末加入熔融態的混合基質中，混勻，保持溫度不變。將以上熔融混合物置入滴丸機漏斗中，設置滴丸機參數，滴距8cm、滴速35滴/min，滴入8℃的冷凝劑中，滴制成丸。將制備好的滴丸在功率0.75kw，離心轉速為2500rpm條件下離心，將滴丸外部的二甲基硅油和液體石蠟脫去，保證滴丸干燥狀態。按照《中國藥典》規定，對滴丸進行測定。經測定，溶散時限為6.3min；丸重差異0.2g；形狀類圓形，在三維橫徑中，任意二維橫徑之差在0.45mm；完全不產生拖尾現象且硬度強的玉米源抗氧化肽滴丸。
實施例4
稱取SephadexG-25凝膠，使其與蒸餾水混合，比例為1:5(v/v)，室溫溶脹時間4.5h，沸水溶脹1.5h，將凝膠在4℃條件下注入層析柱中，待凝膠沉積至離層析柱頂約6cm時，停止注入凝膠，采用蒸餾水平衡層析柱，使其基線走平，紫外檢測器的波長為280nm，將分子量在10kDa～30kDa，蛋白質含量為82.2％，水解度為48.57％的玉米源蛋白肽粉溶于蒸餾水中，使其濃度為30mg/mL，將肽粉溶液經0.45μm濾膜過濾，上樣體積為4mL，控制流速2.5mL/min，最終共收集到3個組分，進行真空冷凍干燥，將每個純化后的玉米抗氧化肽液的組分分裝于冷凍盤中，厚度17mm，在-78℃條件下預凍5.8h，然后在-38℃條件下凍干15h，即得到純化后的玉米源抗氧化肽凍干粉。分別測定每個組分的DPPH自由基清除率，用蒸餾水將純化后的玉米抗氧化肽凍干粉配制為質量濃度為10mg/mL的測試液，采用96孔板，依次加入100μL測試液、100μL甲醇及100μL0.6mmol/L的DPPH甲醇溶液，將96孔板放在微量震蕩器上震蕩1min，使反應液混合均勻，在環境溫度為25℃條件下避光反應30min，用酶標儀在515nm處測定其吸光度AS。相同條件下，用100μL甲醇代替測試液作為空白對照，測定其吸光度AB，DPPH清除率計算公式如下：式中：AB為200μL甲醇與100μLDPPH甲醇溶液的吸光度；AS為100μL測試液、100μL甲醇與100μLDPPH甲醇溶液的吸光度。3個組分的DPPH自由基清除率分別為41.39％、50.05％、84.38％。收集DPPH自由基清除率最高的組分III，稱量10g凍干粉備用。配制基質，稱取PEG-400045g，PEG–600030g，混勻后備用。配制冷凝劑，稱取液體石蠟1L，二甲基硅油1.3L，混勻后備用。將基質水浴加熱至熔融狀態，保持溫度為78℃，34min后將玉米源蛋白肽粉末加入熔融態的混合基質中，混勻，保持溫度不變。將以上熔融混合物置入滴丸機漏斗中，設置滴丸機參數，滴距9cm、滴速30滴/min，滴入7℃的冷凝劑中，滴制成丸。將制備好的滴丸在功率0.75kw，離心轉速為2800rpm條件下離心，將滴丸外部的二甲基硅油和液體石蠟脫去，保證滴丸干燥狀態。按照《中國藥典》規定，對滴丸進行測定。經測定，溶散時限為7min；丸重差異0.12g；形狀類圓形，在三維橫徑中，任意二維橫徑之差在0.38mm；完全不產生拖尾現象且硬度強的玉米源抗氧化肽滴丸。
實施例5
稱取SephadexG-25凝膠，使其與蒸餾水混合，比例為1:5(v/v)，室溫溶脹時間5h，沸水溶脹2h，將凝膠在6℃條件下注入層析柱中，待凝膠沉積至離層析柱頂約10cm時，停止注入凝膠，采用蒸餾水平衡層析柱，使其基線走平，紫外檢測器的波長為280nm，將分子量在10kDa～30kDa，蛋白質含量為83.4％，水解度為42.85％的玉米源蛋白肽粉溶于蒸餾水中，使其濃度為30mg/mL，將肽粉溶液經0.45μm濾膜過濾，上樣體積為5mL，控制流速3mL/min，最終共收集到3個組分，進行真空冷凍干燥，將每個純化后的玉米抗氧化肽液的組分分裝于冷凍盤中，厚度20mm，在-80℃條件下預凍6h，然后在-30℃條件下凍干10h，即得到純化后的玉米源抗氧化肽凍干粉。分別測定每個組分的DPPH自由基清除率，用蒸餾水將純化后的玉米抗氧化肽凍干粉配制為質量濃度為10mg/mL的測試液，采用96孔板，依次加入100μL測試液、100μL甲醇及100μL0.6mmol/L的DPPH甲醇溶液，將96孔板放在微量震蕩器上震蕩1min，使反應液混合均勻，在環境溫度為25℃條件下避光反應30min，用酶標儀在515nm處測定其吸光度AS。相同條件下，用100μL甲醇代替測試液作為空白對照，測定其吸光度AB，DPPH清除率計算公式如下：式中：AB為200μL甲醇與100μLDPPH甲醇溶液的吸光度；AS為100μL測試液、100μL甲醇與100μLDPPH甲醇溶液的吸光度。3個組分的DPPH自由基清除率分別為43.64％、44.65％、83.62％。收集DPPH自由基清除率最高的組分III，稱量10g凍干粉備用。配制基質，稱取PEG-400060g，PEG–600030g，混勻后備用。配制冷凝劑，稱取液體石蠟1L，二甲基硅油1L，混勻后備用。將基質水浴加熱至熔融狀態，保持溫度為70℃，35min后將玉米源蛋白肽粉末加入熔融態的混合基質中，混勻，保持溫度不變。將以上熔融混合物置入滴丸機漏斗中，設置滴丸機參數，滴距10cm、滴速45滴/min，滴入8℃的冷凝劑中，滴制成丸。將制備好的滴丸在功率0.75kw，離心轉速為3000rpm條件下離心，將滴丸外部的二甲基硅油和液體石蠟脫去，保證滴丸干燥狀態。按照《中國藥典》規定，對滴丸進行測定。經測定，溶散時限為6.9min；丸重差異0.18g；形狀類圓形，在三維橫徑中，任意二維橫徑之差在0.26mm；完全不產生拖尾現象且硬度強的玉米源抗氧化肽滴丸。