本發明涉及一種人源化抗PD-1單克隆抗體的水針制劑。
背景技術：
：PD-1是CD28家族成員，參與T細胞的免疫調節。配體PD-L1/L2，通常表達在抗原呈遞細胞(APC)上，和PD-1結合后下調T細胞作用。大多數實體瘤(例如非小細胞肺癌，肝癌，胃癌，霍奇森淋巴瘤，腎細胞癌和黑色素瘤)細胞表面表達PD-L1，從而抑制T細胞活性。人源化抗PD-1單克隆抗體JS001產品由本公司自主研發(專利：201310258289.2)，JS001能夠特異性與PD-1結合并阻斷其與受體的相互作用，從而切斷腫瘤細胞表面表達的PD-L1與T細胞PD-1的結合抑制，增強機體免疫力，達到抗癌目的。抗體制劑在用于受試者之前必須預先制備，并經過貯存及運輸的過程。而抗體在貯存及運輸過程中可能會發生多聚或修飾改變、活性降低等變化，這些變化會使受試者出現免疫毒性或效用降低，因此需要一種穩定的制劑來保證抗體到達受試者體內前仍具有其治療所需的生物活性。這種制劑適合藥物長期貯存及運輸中的穩定性。目前市場上尚無最適合于我們抗體穩定的制劑存在。技術實現要素：本發明提供一種工藝簡單合理，成本低廉，穩定性強的制劑。本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：一種穩定的抗PD-1單克隆抗體制劑，制劑由人源化抗PD-1單克隆抗體JS001、緩沖液、等滲調節劑和表面活性劑組成。本發明公開的制劑為水針制劑。本發明制劑配方簡單，蛋白體系穩定。便于大規模生產、貯存和運輸。枸櫞酸緩沖液、組氨酸緩沖液和乙酸緩沖液具有很強的緩沖能力和對蛋白的保護能力。緩沖pH范圍5.0～6.5，更優選5.5～6.5。抗PD-1單克隆抗體水針制劑蛋白含量為10-60mg/mL，更優選為25-50mg/mL。本發明等滲調節劑選擇氯化鈉、蔗糖、甘露醇、山梨醇、海藻糖之一或其組合，更優化為125mMNaCl、250mM蔗糖、250mM甘露醇、250mM山梨醇、250mM海藻糖、200mM蔗糖與氯化鈉(兩者比例在1∶1到3∶1范圍內)、200mM甘露醇與氯化鈉(兩者比例在1∶1到3∶1范圍內)、200mM山梨醇與氯化鈉(兩者比例在1∶1到3∶1范圍內)、200mM海藻糖與氯化鈉(兩者比例在1∶1到3∶1范圍內)之一。在本發明抗PD-1單克隆抗體制劑中，等滲調節劑更優選150mM蔗糖+50mM氯化鈉、150mM甘露醇+50mM氯化鈉、150mM山梨醇+50mM氯化鈉、150mM海藻糖+50mM氯化鈉。本發明表面活性劑選擇0.01％-0.2％聚山梨酯20、0.01-0.2％聚山梨酯80或兩者組合。在本發明抗PD-1單克隆抗體制劑中，表面活性劑更優選為0.01％～0.02％聚山梨酯20或0.01％～0.02％聚山梨酯80。具體實施方式下面結合實施例對本發明進一步說明。實施例一：抗體制劑篩選實驗抗體制劑制備方法：通過透析作用將抗體換液到目的緩沖液中，樣品為三步純化后的單克隆抗體。置于4℃冰箱中透析換液3次。透析后的樣品進行分裝后取一份樣品凍存于-80℃冰箱中，同時放置于4℃和40℃的樣品分別在第2周第4周取出進行分析檢測，檢測項目包括活性、SEC-HPLC和CEX-HPLC。緩沖液組成：枸櫞酸緩沖液：枸櫞酸緩沖液0.5M枸櫞酸0.5M枸櫞酸鈉pH5.036.5％63.4％pH5.526.5％73.5％pH6.015.0％85.0％組氨酸緩沖液：組氨酸緩沖液0.5M組氨酸0.5M組氨酸鹽酸pH5.522.5％77.5％pH6.050.0％50.0％pH6.570.0％30.0％乙酸緩沖液：乙酸緩沖液0.5M乙酸0.5M乙酸鈉pH5.029.6％70.4％pH5.513.6％86.4％pH6.02.4％97.6％分析檢測方法：濃度檢測：用紫外吸收法測定。純度檢測：分子尺寸排阻高效液相色譜法分析。活性檢測：抗體與PD-1結合ELISA實驗及與PD-L1競爭抑制ELISA實驗電荷異構體：采用陽離子交換色譜法測定電荷異質體主峰含量。緩沖液pH值選擇依據：通過SEC-HPLC方法考察JS001在40℃條件下放置2周和4周后的單體含量，從而確定抗體穩定的最佳pH。以試驗起始(0W)、放置兩周(2W)和放置四周(4W)的單體含量，擬合直線并計算下降斜率(％/周)；平均下降斜率為JS001在兩種不同抗體濃度(10mg/mL和60mg/mL)下降斜率的平均值；篩選標準為兩個濃度下單體平均下降速率≤0.25％/周；同時初步考察等滲條件下不同輔料(7.3g/L氯化鈉，25.0g/L蔗糖或45.5g/L甘露醇)對抗體穩定性的影響。枸櫞酸緩沖液中JS001在不同pH值下單體含量匯總見表1-1所示；組氨酸緩沖液中JS001在不同pH值下單體含量匯總見表1-2所示；乙酸緩沖液中JS001在不同pH值下單體含量匯總見表1-3所示。表1-1JS001在枸櫞酸緩沖液中不同pH值下單體含量(SEC-HPLC)表1-2JS001在組氨酸緩沖液中不同pH值下單體含量(SEC-HPLC)表1-3JS001在乙酸緩沖液中不同pH值下單體含量(SEC-HPLC)從表1-1、1-2和1-3可以看出，無論是在枸櫞酸緩沖液、乙酸緩沖液還是在組氨酸緩沖液中，抗體制劑在pH5.0～6.5范圍內均可保持相對穩定，最佳的pH條件為5.5～6.5。緩沖體系選擇依據：在最佳pH條件下，我們進一步對緩沖體系選擇進行研究比較，從而選出可使抗體最為穩定性的緩沖液成份及濃度。分別配制枸櫞酸緩沖液和組氨酸緩沖液，通過CEX-HPLC檢測電荷異構體主峰含量，并對電荷異構體主峰基礎值的影響進行分析。結果見表1-4所示：表1-4枸櫞酸緩沖液和組氨酸緩沖液中抗體電荷異構體主峰含量(0W)從表1-4可以看出，抗體在三種制劑緩沖液中電荷異構體主峰含量均相對穩定，且不同濃度下無顯著差異。由于枸櫞酸緩沖液更優，我們進一步選擇枸櫞酸緩沖液進行輔料添加物篩選。輔料選擇依據：在最佳pH和緩沖液組成確定條件后，我們進一步對添加輔料進行研究比較，從而選出可使抗體最為穩定性的輔料添加物，同時考察不同輔料之間有無協同作用。在枸櫞酸緩沖液中分別添加125mM氯化鈉、250mM蔗糖、250mM甘露醇、250mM山梨醇、250mM海藻糖、100mM蔗糖+100mM氯化鈉、100mM甘露醇+100mM氯化鈉、100mM山梨醇+100mM氯化鈉、100mM海藻糖+100mM氯化鈉、150mM蔗糖+50mM氯化鈉、150mM甘露醇+50mM氯化鈉、150mM山梨醇+50mM氯化鈉、150mM海藻糖+50mM氯化鈉，40℃放置4周后進行活性及純度檢測。從表1-5中SEC-HPLC純度數據可以看出，在枸櫞酸緩沖液中添加各種輔料以調節滲透壓對JS001有顯著的穩定作用，單體平均下降速率均≤0.3％/周。表1-5在枸櫞酸緩沖液pH6.0下輔料對單體含量(SEC-HPLC)的影響進一步試驗我們利用PD-1抗原結合Elisa方法檢測起始(0W)、放置兩周(2W)和放置四周(4W)后JS001的生物活性。以起始值為參比，JS001生物學活性計算公式為：從表1-6活性數據可以看出，4周后JS001在兩個不同濃度(10mg/mL和60mg/mL)下活性的下降均小于30％。在枸櫞酸緩沖液pH6.0的條件下滿足穩定性考察的要求。表1-6在枸櫞酸緩沖液pH6.0下輔料對抗體活性(結合Elisa方法)的影響我們通過CEX-HPLC檢測JS001穩定性考察后電荷異構體主峰的含量，篩選標準為40℃放置4周后JS001電荷異構體的主峰含量值：含量越高，穩定性越好。結果如表1-7所示，在枸櫞酸緩沖液中(pH6.0)添加不同的輔料，JS001電荷異構體的主峰含量均較高，顯示了良好的穩定性。表1-7在枸櫞酸緩沖液pH6.0下輔料對抗體電荷異構體主峰含量的影響綜合SEC-HPLC、結合Elisa活性和CEX-HPLC的結果，在枸櫞酸緩沖液條件下(pH6.0)，添加125mM氯化鈉、250mM蔗糖、250mM甘露醇、250mM山梨醇、250mM海藻糖、200mM蔗糖與氯化鈉(兩者比例1∶1或3∶1)、200mM甘露醇與氯化鈉(兩者比例1∶1或3∶1)、200mM山梨醇與氯化鈉(兩者比例1∶1或3∶1)、200mM海藻糖與氯化鈉(兩者比例1∶1或3∶1)，不同的制劑中抗體均相對穩定。我們選擇單體含量、生物活性與電荷異構體主峰含量均為最佳的輔料添加物：50mM氯化鈉+150mM甘露醇進行表面活性劑研究。表面活性劑選擇依據：在確定抗體溶液的pH值、緩沖體系和輔料添加物后，我們進一步研究添加表面活性劑聚山梨酯20或聚山梨酯80對抗體穩定性的影響。在枸櫞酸緩沖液pH6.0+氯化鈉(2.92g/L)+甘露醇(25.00g/L)條件下，比較聚山梨酯20(0.001％、0.01％、0.20％、0.2％)、聚山梨酯80(0.001％、0.01％、0.20％、0.2％)、0.001％聚山梨酯20+0.20％聚山梨酯80、0.02％聚山梨酯20+0.02％聚山梨酯80、0.20％聚山梨酯20+0.001％聚山梨酯80對JS001(40mg/mL)40℃放置4周后關鍵質量屬性的影響，具體結果見表1-8。表1-8添加表面活性劑對JS001穩定性的影響從表1-8可以看出，在添加不同濃度聚山梨酯20、聚山梨酯80、聚山梨酯20和聚山梨酯80組合后，抗體制劑單體含量和電荷異構體主峰含量均具有很好的穩定性。通過對抗體活性(結合Elisa)、單體純度(SEC-HPLC)及電荷異構體主峰純度(CEX-HPLC)三個關鍵質量屬性進行檢查，我們最終選擇抗體制劑處方為在pH6.0枸櫞酸緩沖液中，添加2.92g/L氯化鈉、25.00g/L甘露醇和0.20％聚山梨酯80。但仍需進一步對此優選處方下設計穩定性試驗，驗證抗體制劑的穩定性，具體參見實施例二。實施例二：處方驗證實驗處方驗證試驗包括凍融穩定性試驗和25℃振搖穩定性試驗，考察JS001儲存在最終處方的穩定性。振搖穩定性實驗：試驗所用JS001蛋白來源于工作參比品，用優選的抗體制劑處方濃縮至所需濃度，進行振搖穩定性試驗，分別水平振搖和圓周振搖3天。我們重點考察JS001單體含量(SEC-HPLC)、電荷異構體主峰含量(CEX-HPLC)和抗體活性(結合Elisa)，結果匯總見表2-1。表2-1抗體制劑振搖穩定性結果匯總凍融穩定性實驗：試驗所用JS001蛋白來源于工作參比品，用優選的抗體制劑處方濃縮至所需濃度，進行凍融穩定性試驗，分別凍融1、3、5、6次。我們重點考察JS001單體含量(SEC-HPLC)、電荷異構體主峰含量(CEX-HPLC)和抗體活性(結合Elisa)，結果匯總見表2-2。表2-2抗體制劑凍融穩定性結果匯總綜上所述，我們通過對不同緩沖體系，不同pH條件、不同抗體濃度以及不同等滲調節劑和表面活性劑組成進行考察，探索研究重組人源化抗PD-1單克隆抗體JS001的穩定性，并確定最佳水針制劑配方。以上只通過說明的方式描述了本發明的某些示范性實施例，毋庸置疑，對于本領域的普通技術人員，在不偏離本發明的精神和范圍的情況下，可以用各種不同的方式對所描述的實施例進行修正。當前第1頁1 2 3