一種靶向載藥納米級超聲微泡及其制備方法與流程

本發明涉及靶向載藥納米級超聲微泡及其制備方法。

背景技術：

超聲造影劑(Ultrasound Contrast Agents,UCAs)是一類能夠顯著增強醫學超聲檢測信號的診斷藥物，通過靜脈注射給藥到達人體各器官微循環，微泡可以使其所在部位的回聲信號顯著增強。理想的超聲造影劑能作為一種血池顯像示蹤劑隨血流分布到全身，反映器官的血流灌注情況，同時又不干擾血流動力學。超聲造影劑能有效增強心肌、肝、腎、顱腦等實質性器官的二維超聲影像和血流多普勒信號，明顯提高超聲診斷的靈敏性和特異性，因此在影像醫學診斷方面顯示出很好的應用前景。目前常用的超聲造影劑膜材有白蛋白、脂質、表面活性劑類及高分子材料類造影劑。但是受到體內循環時間短、代謝時間過快、超聲顯像不明顯等缺點的限制，處于發展的瓶頸階段。傳統超聲造影劑通過顯示病變內部微循環灌注，顯著提高了疾病診斷與鑒別診斷水平。但近年來，單一功能的造影劑已不能滿足醫學多樣化需求。所以，越來越多的研究者開始將目光轉向具有多種功能超聲造影劑的研究，如多模態(適于多種成像模式的造影劑)和多功能(不僅適于成像，而且能夠用于藥物傳遞、基因轉染等)超聲造影劑。雖然對疾病的準確診斷可以通過應用多模態造影劑將各種成像模式綜合應用來實現，然而疾病診斷之后的治療也是一大難題。如果能夠將疾病的診斷和治療兩個過程合二為一，在得到診斷結果的同時，及時地對病變部位進行對癥治療，這樣不僅可以減少病人二次服藥的痛苦以及藥物可能引起的副作用，而且縮短了診治時間，也可以提高疾病的治療效果。同時，由于生物體內的結構復雜，器官組織中脂肪、蛋白質、水的含量變化，造成超聲顯像的靈敏度、清晰度和診斷的準確度等方面存在局限，所以提高超聲分子顯像信噪比和增加圖像清晰度也至關重要。因此，本發明正是基于研制出新型多功能超聲造影劑和提高超聲顯影效果這兩方面思想而提出的。

CNTs已廣泛用于小分子藥物和生物大分子如蛋白質、DNA、RNA等跨細胞膜藥物輸送，而且CNTs經表面修飾后在動物體內沒有明顯毒性，并能被緩慢地排除體外，CNTs能夠主動進入細胞，CNTs功能化后也可應用于癌癥治療。利用CNTs中空網狀這一特殊結構特點，其外表面不但可以非共價吸附各種分子，還可以共價鍵合多種化學基團，其內部則可以包埋小分子，從而提高CNTs藥物負載率及實現增溶和靶向等功能。

技術實現要素：

本發明是為了解決傳統超聲造影劑功能單一，靈敏度、清晰度和準確度低的問題，而提出的一種靶向載藥納米級超聲微泡及其制備方法。

一種靶向載藥納米級超聲微泡包括：微泡膜壁、FA-CNTs-PTX靶向載藥復合物、以及包裹在微泡膜壁內部的惰性氣體；其中所述FA為葉酸，CNTs為碳納米管，PTX為紫杉醇；

其中碳納米管置于微泡膜壁內部，靶向因子葉酸的一端通過殼聚糖連接到碳納米管上，另一端穿過微泡膜壁伸向微泡膜壁外側，連接葉酸的碳納米管通過物理吸附負載抗腫瘤藥物紫杉醇。

一種靶向載藥納米級超聲微泡的制備方法按以下步驟實現：

步驟一：制備葉酸-殼聚糖偶合物；

步驟二：將碳納米管進行羧基化，得到羧基化修飾的碳納米管；

步驟三：制備靶向復合物FA-CS-CNTs；所述FA為葉酸，CS為殼聚糖，CNTs為碳納米管；

步驟四：制備靶向載藥復合物FA-CNTs-PTX；所述PTX為紫杉醇

步驟五：制備復合FA-CNTs-PTX的微泡，即靶向載藥納米級超聲微泡。

發明效果：

本發明將碳納米管(簡稱CNTs)加入到新型超聲造影劑微泡中，可以有效克服傳統超聲造影劑功能單一，靈敏度、清晰度和準確度低等缺陷，可以實現診斷和靶向治療同時進行。

本發明的一種靶向載藥超聲微泡，其中，包括Span和PEG膜壁和包裹在Span和PEG膜壁內部的惰性氣體，在Span和PEG膜壁上鑲嵌了FA-CNTs-PTX靶向載藥復合物。本發明克服了傳統超聲造影劑微泡的靶向性低、體內循環時間短、穩定性差、超聲顯像不明顯、功能單一的缺點，提供一種靶向性強、體內循環時間長、分子量小、穩定性好、超聲顯影明顯且兼有治療作用的一種多功能納米級超聲微泡。

附圖說明

圖1為靶向載藥納米級超聲微泡的結構示意圖；圖中Gas為惰性氣體。

圖2為靶向載藥納米級超聲微泡的粒度分布圖。

具體實施方式

具體實施方式一：一種靶向載藥納米級超聲微泡包括：微泡膜壁、FA-CNTs-PTX靶向載藥復合物、以及包裹在微泡膜壁內部的惰性氣體；其中所述FA為葉酸，CNTs為碳納米管，PTX為紫杉醇；

其中碳納米管置于微泡膜壁內部，靶向因子葉酸的一端通過殼聚糖連接到碳納米管上，另一端穿過微泡膜壁伸向微泡膜壁外側，連接葉酸的碳納米管通過物理吸附負載抗腫瘤藥物紫杉醇。

具體實施方式二：本實施方式與具體實施方式一不同的是：所述微泡膜壁為脂質雙分子層結構，微泡膜壁材料為Span60和PEG1500。

其它步驟及參數與具體實施方式一相同。

具體實施方式三：本實施方式與具體實施方式一或二不同的是：所述靶向載藥納米級超聲微泡的的粒徑在400～600nm。

其它步驟及參數與具體實施方式一或二相同。

具體實施方式四：一種靶向載藥納米級超聲微泡的制備方法包括以下步驟：

步驟一：制備葉酸-殼聚糖偶合物；

步驟二：將碳納米管進行羧基化，得到羧基化修飾的碳納米管；

步驟三：制備靶向復合物FA-CS-CNTs；所述FA為葉酸，CS為殼聚糖，CNTs為碳納米管；

步驟四：制備靶向載藥復合物FA-CNTs-PTX；所述PTX為紫杉醇

步驟五：制備復合FA-CNTs-PTX的微泡，即靶向載藥納米級超聲微泡。

具體實施方式五：本實施方式與具體實施方式四不同的是：所述步驟一中制備葉酸-殼聚糖偶合物的具體過程為：

將殼聚糖溶于1％的醋酸溶液中，攪拌至殼聚糖完全溶解；另稱取葉酸和EDC溶于二甲基亞砜中，避光攪拌至葉酸完全溶解；將葉酸溶液逐滴加入CS醋酸溶液中，避光反應4～6小時，加入丙酮溶液，直至反應產物完全沉淀后，將沉淀物離心，用二甲基亞砜洗滌，再用雙蒸水洗滌，收集所得下層物，冷凍干燥，得到葉酸-殼聚糖偶合物。

其它步驟及參數與具體實施方式四相同。

具體實施方式六：本實施方式與具體實施方式四或五不同的是：所述步驟二中得到羧基化修飾的碳納米管的具體過程為：

取碳納米管加入到圓底燒瓶中，向其中加入濃硫酸和濃硝酸體積比為3:1的混酸，95～120℃條件下加熱回流2～4小時，冷卻后，將所得反應溶液用0.45μm混合纖維微孔濾膜抽濾，用雙蒸水洗滌至中性，收集固體產物，冷凍干燥，得到羧基化修飾的碳納米管。

其它步驟及參數與具體實施方式四或五相同。

具體實施方式七：本實施方式與具體實施方式四至六之一不同的是：所述步驟三中制備靶向復合物FA-CS-CNTs的具體過程為：

稱取等質量的羧基化碳納米管和葉酸-殼聚糖偶合物，分別置于1％(體積百分比)醋酸溶液中，醋酸溶液與羧基化碳納米管或葉酸-殼聚糖偶合物的用量比為2～3ml/mg(如醋酸體積為2ml，羧基化碳納米管或葉酸-殼聚糖偶合物質量為1mg，比例為2：1)，超聲分散0.5～1小時，得到羧基化碳納米管分散液和葉酸-殼聚糖偶合物溶液，在攪拌條件下，將葉酸-殼聚糖偶合物溶液加到羧基化碳納米管分散液中，避光反應16～24小時；反應結束后，混合物進行抽濾，并用1％醋酸溶液洗滌，再用雙蒸水洗滌至中性，收集固體產物，冷凍干燥，產物標記為FA-CS-CNTs。

其它步驟及參數與具體實施方式四至六之一相同。

具體實施方式八：本實施方式與具體實施方式四至七之一不同的是：所述步驟四中制備靶向載藥復合物FA-CNTs-PTX的具體過程為：

稱取等質量的靶向復合物FA-CS-CNTs與紫杉醇，分別加到無水乙醇中，無水乙醇與靶向復合物FA-CS-CNTs或紫杉醇的用量比為1～2ml/mg(如無水乙醇體積為2ml，靶向復合物FA-CS-CNTs或紫杉醇質量為1mg，比例為2：1)，再將紫杉醇的乙醇溶液滴加到靶向復合物FA-CS-CNTs的乙醇分散液中，避光，磁力攪拌3～5小時，得到靶向載藥復合物，產物標記為FA-CNTs-PTX。

其它步驟及參數與具體實施方式四至七之一相同。

具體實施方式九：本實施方式與具體實施方式四至八之一不同的是：所述步驟五中制備復合FA-CNTs-PTX的微泡的具體過程為：

取質量比為1：1：2的Span60、PEG1500和NaCl，研磨混合均勻后，加入PBS后，加熱并磁力攪拌至混合均勻；再將靶向載藥復合物FA-CNTs-PTX分散于PBS中；混合兩個PBS體系，70～80℃下磁力攪拌30～60分鐘，制得膜材；將制得膜材在850～900W條件下進行探頭超聲，同時通入氮氣，得到復合微泡粗品；再將微泡粗品在3000～5000rpm下離心10～15分鐘，收集上層液體，與等體積的PBS一起置于分液漏斗中，靜置30～60分鐘，洗滌，收集中層液體，得到復合FA-CNTs-PTX的微泡。

其它步驟及參數與具體實施方式四至八之一相同。

實施例一：

葉酸-殼聚糖偶合物(FA-CS)的制備：將殼聚糖(CS,0.1g)溶于醋酸溶液(1％，20mL)中，攪拌至CS完全溶解；另稱取葉酸(FA,0.04g)、EDC(0.01g)溶于二甲基亞礬(DMSO，5mL)中，室溫下避光攪拌至FA完全溶解；將FA溶液逐滴加入CS醋酸溶液中，避光反應6小時。待反應結束后，加入30mL丙酮溶液，直至反應產物完全沉淀；將沉淀物離心，用DMSO洗滌兩次，再用雙蒸水洗滌兩次，收集所得下層物，冷凍干燥，得葉酸-殼聚糖偶合物(FA-CS)。

CNTs羧基化：取100mg CNTs加入到250mL圓底燒瓶中，向其中緩慢加入40mL混酸(濃硫酸和濃硝酸體積比為3:1)，95℃條件下加熱回流4小時。冷卻后，將所得反應溶液用0.45μm混合纖維微孔濾膜抽濾，用雙蒸水洗滌至中性，收集固體產物，冷凍干燥，得羧基化修飾的CNTs(CNTs-COOH)。

靶向復合物FA-CS-CNTs的制備：稱取羧基化CNTs(CNTs-COOH,5mg)和葉酸-殼聚糖偶合物(FA-CS，5mg)，分別置于1％醋酸溶液(10mL)中，超聲分散1小時；在攪拌條件下，將FA-CS溶液緩緩加到CNTs-COOH分散液中，避光反應16小時；反應結束后，混合物進行抽濾，并用1％醋酸溶液洗滌，再用雙蒸水洗滌至中性，收集固體產物，冷凍干燥，產物標記為FA-CS-CNTs。

靶向載藥復合物FA-CNTs-PTX的制備：稱取一定質量的靶向復合物FA-CS-CNTs，分散于乙醇溶液中，向其中滴加等質量紫杉醇(PTX)的乙醇溶液，無水乙醇的體積與靶向復合物FA-CS-CNTs或紫杉醇的質量比值為1～2ml/mg。避光，磁力攪拌3小時，得到靶向載藥復合物，產物標記為FA-CNTs-PTX。

復合FA-CNTs-PTX的微泡制備：取450mg Span60、450mg PEG1500和900mg NaCl，置于研缽中，研磨混合均勻后，轉移至燒杯中，加入20ml PBS分散；再取20mg靶向載藥復合物FA-CNTs-PTX于20mL PBS分散。然后，混合兩個PBS分散液，75℃下磁力攪拌30分鐘，制得膜材。將制得膜材在900W條件下進行探頭超聲，同時通入氮氣，得到復合微泡粗品。再將微泡粗品在3000rpm下離心15分鐘，收集上層液體，置于250mL分液漏斗中，靜置60分鐘，加入等體積的PBS洗滌，再收集中層液體，得到復合FA-CNTs-PTX的微泡產品。靶向載藥納米級超聲微泡的粒徑在500nm左右。