一種以桿狀病毒為載體的H7N9亞型禽流感基因工程疫苗及其制備方法與應(yīng)用與流程

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種以桿狀病毒為載體的H7N9亞型禽流感基因工程疫苗及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)屬于正黏病毒科流感病毒屬，一直以來對(duì)養(yǎng)殖業(yè)和人類公共安全造成了嚴(yán)重危害。2013年H7N9亞型AIV的暴發(fā)，更引發(fā)了全球?qū)IV的關(guān)注。H7N9AIV雖然對(duì)禽類呈現(xiàn)低致病性，感染后一般不表現(xiàn)出臨床癥狀，呈帶毒狀態(tài)，但對(duì)人具有較強(qiáng)的致病性。為有效控制禽類感染該亞型AIV，亟待研究有效預(yù)防禽源H7N9流感病毒的疫苗。

給易感動(dòng)物免疫合適的疫苗可以保護(hù)易感禽類免于潛在的感染，還可以減少感染動(dòng)物的排毒和病毒的傳播能力。H7N9亞型禽流感病毒的抗原性與以往流行的禽流感病毒不同，原有的季節(jié)性流感疫苗和禽流感疫苗對(duì)其缺乏免疫保護(hù)作用，目前應(yīng)用最為廣泛的是油乳劑滅活苗，傳統(tǒng)的油乳劑滅活苗雖能夠誘導(dǎo)免疫動(dòng)物產(chǎn)生足夠的免疫保護(hù)作用，但是也存在一些缺陷：疫苗生產(chǎn)過度依賴雞胚，在流感暴發(fā)時(shí)雞胚產(chǎn)量受到限制；存在其它抗原污染的可能性；滅活苗免疫后產(chǎn)生的抗NP或M1蛋白抗體不能把免疫和野毒感染產(chǎn)生的抗體區(qū)分開來。而弱毒活疫苗具有感染性，存在生物安全隱患，目前尚不允許在禽類中使用?；蚬こ桃呙绮粫?huì)干擾禽流感病毒的血清學(xué)調(diào)查，而且不存在毒力返強(qiáng)、散毒和環(huán)境污染等問題。

桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)能夠高效的表達(dá)外源基因，作為一種真核表達(dá)系統(tǒng)，在外源基因表達(dá)方面具有加工、修飾、并將蛋白正確的定位且形成高級(jí)結(jié)構(gòu)，其表達(dá)產(chǎn)物與天然產(chǎn)物的生物學(xué)特性相似。桿狀病毒屬于昆蟲病毒，有高度特異的宿主范圍，對(duì)脊椎動(dòng)物和植物均無致病性，并且已經(jīng)重組后的病毒因失去病毒粒子的天然保護(hù)物多角體蛋白結(jié)晶體，病毒粒子極易在自然環(huán)境中失活，不會(huì)產(chǎn)生對(duì)環(huán)境及人畜的污染，因而重組桿狀病毒被認(rèn)為是安全的表達(dá)載體。桿狀病毒表達(dá)載體的應(yīng)用主要有兩種表達(dá)形式，一種攜帶有哺乳動(dòng)物細(xì)胞活性基因表達(dá)盒，能轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的桿狀病毒，通常稱作BacMan病毒。另一種是表面展示重組蛋白的桿狀病毒。隨著研究的逐步深入，桿狀病毒本身可以作為佐劑，增強(qiáng)對(duì)多種感染性病原的保護(hù)性免疫應(yīng)答這一事實(shí)變得越來越清楚。近年來研究發(fā)現(xiàn)，桿狀病毒可以轉(zhuǎn)導(dǎo)不同來源的許多細(xì)胞，所以攜帶不同啟動(dòng)子、不同抗原的重組BacMan病毒已經(jīng)被開發(fā)應(yīng)用于疫苗。通過啟動(dòng)子如人巨細(xì)胞病毒(CMV)的早期啟動(dòng)子將桿狀病毒外源基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。研究顯示，利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)H5亞型、H7亞型的重組HA疫苗，免疫10日齡仔雞，對(duì)免疫組攻擊致死性禽流感強(qiáng)毒，結(jié)果免疫雞都不發(fā)病，未免疫組攻毒后全部死亡；劉明等分別構(gòu)建了桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體，表達(dá)了禽流感病毒H5N1的HA基因和NA基因以及H7N1的HA基因，免疫SPF雞后用禽流感病毒攻擊，可提供一定程度的保護(hù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種以桿狀病毒為載體的H7N9亞型禽流感基因工程疫苗。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述以桿狀病毒為載體的H7N9亞型禽流感基因工程疫苗的制備方法。

本發(fā)明的再一目的在于提供上述以桿狀病毒為載體的H7N9亞型禽流感基因工程疫苗的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種以桿狀病毒為載體的H7N9亞型禽流感基因工程疫苗，包括重組修飾的桿狀病毒，所述的桿狀病毒能夠表達(dá)禽流感病毒主要保護(hù)性抗原HA蛋白。

所述的禽流感病毒主要保護(hù)性抗原HA蛋白包括H7N9亞型禽流感病毒血凝素蛋白HA的全長，所述的禽流感病毒主要保護(hù)性抗原HA蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

所述的重組修飾的桿狀病毒的基因組中雙啟動(dòng)子基因盒被替換，所述雙啟動(dòng)子基因盒如下組件：多角體蛋白(Polyhedron,PH)啟動(dòng)子被巨細(xì)胞病毒早期增強(qiáng)子啟動(dòng)子替換，巨細(xì)胞病毒早期增強(qiáng)子表達(dá)盒下游為主要保護(hù)性抗原血凝素蛋白HA，P₁₀啟動(dòng)子被巨細(xì)胞病毒早期增強(qiáng)子表達(dá)盒替換，巨細(xì)胞病毒早期增強(qiáng)子表達(dá)盒下游為主要保護(hù)性抗原血凝素蛋白HA；得到含雙CMV啟動(dòng)子雙向表達(dá)的重組核苷酸序列HA-CMV-CMV-HA,其中CMV-HA核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

所述的重組修飾的桿狀病毒的基因組中雙啟動(dòng)子基因盒被替換，是以pFastBac^TMDual(購自于Invitrogen公司)為骨架質(zhì)粒，pcDNA3.1(+)(購自于Invitrogen公司)為材料，通過下述方法獲得：以pcDNA3.1(+)質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增CMV序列，其上下游帶有BstZ 17I和Bbs I酶切位點(diǎn)，用BstZ 17I和Bbs I酶切擴(kuò)增片段CMV，回收包含663bp的片段，置換pFastBac^TM Dual的P₁₀啟動(dòng)子，得到中間質(zhì)粒pFast-CMV；以pcDNA3.1(+)質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增CMV序列，其上下游帶有BstZ 17I和BamH I酶切位點(diǎn)，用BstZ 17I和BamH I酶切擴(kuò)增片段CMV，回收包含663bp的片段，置換中間質(zhì)粒pFast-CMV的多角體啟動(dòng)子，最終獲得質(zhì)粒pFast-(CMV)₂，實(shí)現(xiàn)重組修飾的昆蟲桿狀病毒的基因組中雙啟動(dòng)子基因盒被替換；其中CMV啟動(dòng)子核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

所述的重組修飾的桿狀病毒的構(gòu)建所用的出發(fā)載體為pFastBac^TM Dual。

所述的桿狀病毒為苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒(AcMNPV)。

所述的重組修飾的桿狀病毒命名為重組桿狀病毒BV-(CHA)₂。

上述的以桿狀病毒為載體的H7N9亞型禽流感基因工程疫苗的制備方法，包括以下步驟：首先通過對(duì)H7N9亞型禽流感病毒的HA基因的生物信息學(xué)軟件分析，獲得編碼H7N9流感病毒HA蛋白的基因的全長序列，分別在重組修飾的桿狀病毒供體質(zhì)粒pFast-(CMV)₂兩邊的多克隆位點(diǎn)依次插入流感病毒基因組HA，得到含雙CMV啟動(dòng)子雙向表達(dá)的重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFast-(CHA)₂；將重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH10Bac大腸桿菌，通過轉(zhuǎn)座重組，獲得重組桿狀病毒質(zhì)粒Bacmid-(CHA)₂；最后用脂質(zhì)體法將Bacmid-(CHA)₂轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細(xì)胞從而獲得第一代重組桿狀病毒BV-(CHA)₂，采用sf9細(xì)胞培養(yǎng)和重組桿狀病毒增殖，結(jié)合超速離心分離技術(shù)，純化得到以桿狀病毒為載體的H7N9亞型禽流感基因工程疫苗。

上述以桿狀病毒為載體的H7N9亞型禽流感基因工程疫苗的應(yīng)用，應(yīng)用于制備H7N9亞型禽流感疫苗。

本發(fā)明利用人巨細(xì)胞病毒(CMV)的早期啟動(dòng)子構(gòu)建了桿狀病毒雙CMV表達(dá)載體，選擇H7N9亞型AIV的HA基因?yàn)榘谢?，?gòu)建了表達(dá)HA蛋白的重組桿狀病毒BV-(CHA)₂，攜帶HA基因的重組桿狀病毒通過轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，能在動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)得到高效表達(dá)，類似于DNA疫苗。將此重組桿狀病毒疫苗進(jìn)行SPF雞的免疫保護(hù)效力評(píng)價(jià)。以上內(nèi)容為研制H7N9亞型禽流感疫苗提供了新的思路，也為有效預(yù)防H7N9亞型AIV建立了必要的技術(shù)儲(chǔ)備。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下的優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明提供一種以桿狀病毒為載體的H7N9亞型禽流感基因工程疫苗，該H7N9亞型禽流感疫苗包括重組修飾的桿狀病毒，所述的桿狀病毒能夠表達(dá)H7N9亞型禽流感病毒血凝素HA蛋白。經(jīng)肌肉注射免疫，使用方便；在誘導(dǎo)細(xì)胞免疫方面占優(yōu)勢；疫苗制備簡單，便于大批量生產(chǎn)。本發(fā)明選擇將H7N9亞型禽流感病毒HA蛋白基因與人巨細(xì)胞病毒CMV啟動(dòng)子結(jié)合，一個(gè)桿狀病毒體內(nèi)包含兩個(gè)CMV-HA核苷酸序列，能夠在脊椎動(dòng)物細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞中將所需免疫原性外源基因表達(dá)成抗原性蛋白的結(jié)構(gòu)，從而提高外源蛋白在動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平，該疫苗能夠進(jìn)入動(dòng)物細(xì)胞介導(dǎo)抗原表達(dá)，具有核酸疫苗的特點(diǎn)；重組桿狀病毒制備簡單，便于大規(guī)模生產(chǎn)。

附圖說明

圖1為重組質(zhì)粒pFast-CMV的鑒定結(jié)果圖，其中M1為DNA Marker，DL5000Marker；1：以質(zhì)粒pFast-CMV為模板擴(kuò)增CMV；2：以ddH₂O為模板的陰性對(duì)照；3：BstZ 17I、Bbs I雙酶切質(zhì)粒pFast-CMV；M2為DNA Marker，DL 10000Marker；

圖2為重組質(zhì)粒pFast-(CMV)₂的鑒定結(jié)果圖，其中M1為DNA Marker，DL 5000Marker；1：以質(zhì)粒pFast-(CMV)₂為模板擴(kuò)增CMV；2：以ddH₂O為模板的陰性對(duì)照；3：BstZ 17I、BamH I雙酶切質(zhì)粒pFast-(CMV)₂的CMV；M2為DNA Marker，DL10000Marker；

圖3為重組供體質(zhì)粒pFast-(CMV)₂-HA的鑒定結(jié)果圖，其中M1為DNA Marker，DL5000Marker；1：以重組質(zhì)粒pFast-(CMV)₂-HA為模板擴(kuò)增外源基因HA；2：以ddH₂O為模板的陰性對(duì)照；3：Bbs I、Kpn I雙酶切質(zhì)粒pFast-(CMV)₂-HA；M2為DNA Marker，DL10000Marker；

圖4為重組供體質(zhì)粒pFast-(CHA)₂的鑒定結(jié)果圖，其中M1為DNA Marker，DL5000Marker；1：以重組質(zhì)粒pFast-(CHA)₂為模板擴(kuò)增外源基因；2：以ddH₂O為模板的陰性對(duì)照；3：BamH I、Hind III雙酶切質(zhì)粒pFast-(CHA)₂的HA；M2為DNA Marker，DL10000Marker；

圖5為重組桿狀病毒質(zhì)粒Bacmid-(CHA)₂的鑒定結(jié)果圖，其中M為DNA maker，DL10000Marker；1：以重組桿狀病毒質(zhì)粒Bacmid-(CHA)₂為模板擴(kuò)增外源基因；

圖6為攻毒后SPF雞拭子病毒滴度的檢測結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明的實(shí)施方案通過下列實(shí)施例舉例說明，所述實(shí)施例是為了舉例說明本發(fā)明，而本發(fā)明的實(shí)施方案不限于實(shí)施例的特定細(xì)節(jié)。本發(fā)明的范圍由附屬的權(quán)利要求限定。

下述實(shí)施例中的試驗(yàn)材料，若無特別說明，均是來源于商業(yè)途徑。所述的試驗(yàn)方法，若無特別說明，均為常規(guī)試驗(yàn)方法。

實(shí)施例1：本發(fā)明中的pFast-(CMV)₂骨架質(zhì)粒的構(gòu)建

(1)重組質(zhì)粒pFast-CMV的構(gòu)建與鑒定

以pcDNA3.1(+)質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，P1、P2和P3、P4。其中利用引物P1、P2擴(kuò)增人巨細(xì)胞病毒CMV啟動(dòng)子，并在上下游引入BstZ 17I、Bbs I酶切位點(diǎn)，引物序列如下：

P1：5'-GTATACGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATT-3'

P2：5'-GAAGACTTGATCACAGCTTGGGTCTCCCTATAGTGAGT-3'

引物P1/P2的擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5min后進(jìn)入循環(huán)；循環(huán)參數(shù)為：94℃，45s，56℃，45s，72℃，1min；30個(gè)循環(huán)后72℃終延伸10min。將PCR產(chǎn)物回收并用BstZ 17I和Bbs I雙酶切后，插入到載體pFastBac^TMDual的BstZ 17I和Bbs I位點(diǎn)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，獲得載體pFast-CMV。用BstZ 17I和Bbs I對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，并對(duì)該質(zhì)粒進(jìn)行測序，結(jié)果正確(圖1)。

引物P3、P4擴(kuò)增人巨細(xì)胞病毒CMV啟動(dòng)子，并在上下游引入BstZ 17I、BamH I酶切位點(diǎn)，引物序列如下：

P3：5'-GTATACGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATT-3'

P4：5'-CGGGATCCCAGCTTGGGTCTCCCTATAGTGAGT-3'

引物P3/P4的擴(kuò)增條件均為：94℃預(yù)變性5min后進(jìn)入循環(huán)；循環(huán)參數(shù)為：94℃，45s，56℃，45s，72℃，1min；30個(gè)循環(huán)后72℃終延伸10min。將PCR產(chǎn)物回收并用BstZ 17I、BamH I雙酶切后，插入到轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFast-CMV的BstZ 17I和BamH I位點(diǎn)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，獲得載體pFast-(CMV)₂。用BstZ 17I和BamH I對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，并對(duì)該質(zhì)粒進(jìn)行測序，結(jié)果正確(圖2)。

實(shí)施例2：重組桿狀病毒質(zhì)粒(Bacmid)的構(gòu)建與鑒定

(1)H7N9亞型禽流感病毒基因組RNA的提?。?/p>

本實(shí)驗(yàn)中使用的H7亞型禽流感病毒A/CK/GD/G1/2013(H7N9)(以下簡稱G1)以及由其制備的陽性血清均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)人獸共患病防控制劑國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室保存。將含有G1病毒的雞胚尿囊液12000r/min離心5min，取上清液500μL到DEPC處理過的Eppendorf管中提取RNA。

①加入500μL Trizol LS Reagent，劇烈震蕩后室溫放置10min，加入200μL氯仿，充分混合，待乳化溶液呈乳白狀后，室溫靜置10min后離心(13000rpm，15min，4℃)；

②取600μL上層水相移至另一新的DEPC處理過的1.5mL滅菌Eppendorf管；

③向上清中加入等體積的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，室溫下靜置10min離心(13000rpm，15min，4℃)；

④棄去上清液，沿離心管壁緩慢加入預(yù)冷的1mL 75％的乙醇，緩慢顛倒混勻，離心(8000rpm，5min，4℃)，棄去上清液；

⑤在超凈工作臺(tái)內(nèi)風(fēng)干后，加入適量的DEPC處理水溶解RNA，待完全溶解，-70℃保存或直接用于反轉(zhuǎn)錄；

⑥取少量RNA溶液檢測濃度。

(2)RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA

RT反應(yīng)體系(20μL)如下：向0.2mL離心管加入10μL模板及2μL引物，72℃水浴10min后，按照TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒的說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，即在20μL的PCR體系中加入以下各組分：4μL 5×Buffer、2μL dNTPMix、1μL M-MLVRT、0.5μL Recombinant RNase，42℃水浴1h。

根據(jù)流感病毒(A/CK/GD/G1/2013(H7N9))血凝素HA核酸序列，設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，P5、P6和P7、P8。其中在P5、P6上下游引入Bbs I、Kpn I酶切位點(diǎn)，引物序列如下：

P5：5’-GAAGACTTGATCAATGAACACTCAAATCCTGGTATTCGCTC-3’

P6：5’-GGGGTACC TTATATACAAATAGTGCACCGCATGTT-3’

引物P5/P6的擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5min后進(jìn)入循環(huán)；循環(huán)參數(shù)為：94℃，45s，56℃，45s，72℃，2min；30個(gè)循環(huán)后72℃終延伸10min。將PCR產(chǎn)物回收并用Bbs I、Kpn I雙酶切，插入到構(gòu)建好的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFast-(CMV)₂的Bbs I和Kpn I位點(diǎn)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，獲得載體pFast-(CMV)₂-HA。用Bbs I和Kpn I對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，并對(duì)該質(zhì)粒進(jìn)行測序，結(jié)果正確(圖3)。

而引物P7、P8在上下游引入BamH I、Hind III酶切位點(diǎn)，引物序列如下：

P7：5’-CGGGATCC ATGAACACTCAAATCCTGGTATTCGCTC-3’

P8：5’-CCCAAGCTT TTATATACAAATAGTGCACCGCATGTT-3’

引物P5/P6的擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5min后進(jìn)入循環(huán)；循環(huán)參數(shù)為：94℃,45s，56℃,45s，72℃，2min；30個(gè)循環(huán)后72℃終延伸10min。將PCR產(chǎn)物回收并用BamH I、Hind III雙酶切后，插入到構(gòu)建好的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFast-(CMV)₂-HA的BamH I和Hind III位點(diǎn)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，獲得載體pFast-(CHA)₂。用BamH I和Hind III對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，并對(duì)該質(zhì)粒進(jìn)行測序，結(jié)果正確(圖4)。

(3)重組桿狀病毒質(zhì)粒Bacmid-(CHA)₂的獲得與鑒定

將供體質(zhì)粒pFast-(CHA)₂轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，通過轉(zhuǎn)座重組，獲得重組桿狀病毒質(zhì)粒Bacmid-(CHA)₂，按照Invitrogen公司Bac-to-Bac桿狀病毒操作手冊(cè)，用M13引物擴(kuò)增片段對(duì)其鑒定，結(jié)果正確(圖5)。

實(shí)施例3：重組桿狀病毒BV-(CHA)₂的獲得與鑒定

(1)重組桿狀病毒BV-(CHA)₂的獲得

利用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法，將重組桿狀病毒質(zhì)粒Bacmid-(CHA)₂轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細(xì)胞，于27℃培養(yǎng)。培養(yǎng)至72h時(shí)，細(xì)胞出現(xiàn)病變，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，即可獲得第一代重組桿狀病毒(P1)BV-(CHA)₂。

(2)重組桿狀病毒BV-(CHA)₂轉(zhuǎn)導(dǎo)PK15細(xì)胞及其表達(dá)能力鑒定

轉(zhuǎn)導(dǎo)前1d，將形態(tài)良好的PK15細(xì)胞以1×10⁵個(gè)/孔的量接入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長至70％-80％單層，去除培養(yǎng)基，用含鈣、鎂離子的PBS洗細(xì)胞。將重組桿狀病毒與PBS按照1﹕4的比例混和后(總體積為1mL)，將此病毒感染液加入到PK15細(xì)胞中，室溫?fù)u床上轉(zhuǎn)導(dǎo)6小時(shí)。然后棄去感染液，用PBS洗一遍，加入2mL的細(xì)胞維持液，37℃培養(yǎng)48h，每孔用PBS洗3次，4％多聚甲醛室溫固定15min，PBS洗3次。在對(duì)應(yīng)的細(xì)胞孔分別加入H7N9陽性血清作為一抗，37℃作用30min，PBS洗3次。加入FITC標(biāo)記的羊抗雞IgG為二抗，37℃作用30min，PBS洗3次。在倒置熒光顯微鏡下觀察熒光。重組桿狀病毒BV-(CHA)₂轉(zhuǎn)導(dǎo)的PK15細(xì)胞能產(chǎn)生特異性免疫熒光，說明重組桿狀病毒能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)PK15細(xì)胞，并能在CMV啟動(dòng)子的作用下表達(dá)外源蛋白。

實(shí)施例4：免疫原性分析

(1)重組桿狀病毒的濃縮與滴定

使用蔗糖密度梯度離心法對(duì)重組桿狀病毒進(jìn)行超離濃縮。用Clontech公司的桿狀病毒快速滴定試劑盒對(duì)超離濃縮的桿狀病毒進(jìn)行滴度測定，用于動(dòng)物試驗(yàn)或置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)免疫程序

2周齡SPF雞隨機(jī)分為3組并標(biāo)記，每組12只雞，每組免疫兩次，間隔三周，免疫方式為肌肉注射免疫。分組情況和免疫情況為：第一組為重組桿狀病毒組BV-(CHA)₂，第二組為桿狀病毒野毒(AcMNPV-WT)對(duì)照組，第三組為PBS空白對(duì)照組。桿狀病毒組免疫劑量為500uL/只(10⁹pfu/只)，PBS免疫劑量為500μL/只。

實(shí)施例5：攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)研究

(1)攻毒后拭子病毒滴度檢測

第二次免疫后3周，滴鼻攻毒10⁶EID₅₀/100uL G1病毒，攻毒后2周內(nèi)每天觀察雞只臨床癥狀，并于攻毒后3d、5d和7d采集喉頭拭子和泄殖腔拭子，按照常規(guī)方法進(jìn)行病毒的分離和滴定。

在攻毒后的2周觀察期內(nèi)，免疫雞和對(duì)照雞均沒有出現(xiàn)臨床發(fā)病癥狀。將拭子浸出液倍比稀釋后接種雞胚進(jìn)行病毒分離和滴定，結(jié)果顯示，BV-(CHA)₂免疫組在攻毒后第3d檢測到4只雞排毒，在第5d檢測到2只排毒，在第7d沒有檢測到排毒，AcMNPV-WT免疫組在攻毒后第3d檢測到11只雞排毒，在第5d檢測到6只雞排毒，在第7d檢測到2只雞排毒，而PBS對(duì)照組在攻毒后第3d全部檢測到排毒，在第5d檢測到6只雞排毒，在第7d檢測到3只雞排毒，結(jié)果如圖(圖6)。結(jié)果表明，BV-(CHA)₂免疫后可以有效降低排毒。

(2)攻毒后SPF雞臟器病毒滴度的檢測

在攻毒后第3d、5d，各組隨機(jī)挑選3只SPF雞；SPF雞安樂死，剖檢采集肝、脾、肺、腎各1g置于2.0mL離心管中研磨，4℃，12000r/min離心5min，取上清；上清液用無菌含雙抗PBS 10倍梯度稀釋(10^-1-10^-10)，每個(gè)稀釋度接種3枚9～11日齡非免疫雞胚，37℃孵化48h；收獲雞胚尿囊液，測定血凝活性，按Reed-Muench方法計(jì)算病毒在SPF雞肺臟復(fù)制的滴度(單位Log₁₀EID₅₀/mL)。

G1病毒攻擊試驗(yàn)雞后第3d，BV-(CHA)₂組和AcMNPV-WT組在脾、肺、腎等組織中檢測到病毒復(fù)制，另外PBS對(duì)照組在腦組織中也檢測到病毒復(fù)制，各組織臟器中BV-(CHA)₂組病毒滴度明顯低于AcMNPV-WT組，而AcMNPV-WT組各組織臟器中病毒滴度均低于PBS對(duì)照組。攻毒后第5d，BV-(CHA)₂組僅在肺臟中檢到病毒，且病毒滴度明顯低于AcMNPV-WT組和PBS對(duì)照組。結(jié)果如表1和表2所示。

表1為攻毒3天后雞的臟器載毒量結(jié)果

表2為攻毒5天后雞的臟器載毒量結(jié)果

上述所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：BV-(CHA)₂免疫后可以有效降低排毒。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。